2022年吉林省食品中沙門氏菌耐藥性及分子特征分析

孫景昱,趙 薇,孫績巖,石 奔,李可維,黃 鑫

沙門氏菌 (Salmonella)是一種革蘭氏陰性桿菌,是我國最常見的人獸共患病原菌。其血清型眾多,在我國分布有300多種,部分血清型可通過細菌代謝產生的內毒素引起食物中毒[1]。常見的沙門氏菌有鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌[2]。 沙門氏菌主要通過肉類、雞蛋、奶制品與水源傳播。根據 WHO發布的全球食源性疾病負擔報告顯示,由沙門菌導致的胃腸炎疾病負擔約為400萬,占食源性微生物導致的胃腸炎疾病負擔的22.2%[3]。目前, 對沙門菌的預防和抗感染治療主要是依賴抗生素, 抗生素可以通過影響細菌內蛋白質的生成、破壞細菌細胞壁的形成、改變細菌細胞膜通透性以及抑制核酸的復制轉錄等方式來干擾細菌的正常生長, 從而達到抑菌作用[4]。但抗生素的大量使用促使了細菌快速產生耐藥性,并出現多重耐藥菌株,給臨床治療帶來巨大困難。因此,本研究通過對2022年吉林省食品中61株沙門氏菌的調查研究,針對血清型分布、耐藥表型、多位點序列分型(multilocus sequence typing, MLST)以及耐藥基因進行分析比對,深入了解吉林省食品中沙門氏菌耐藥性分布特點,為防控診斷以及進一步的治療提供有效的理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 樣本來源 收集2022年對吉林省9個市州的食品樣品進行了沙門氏菌污染狀況監測,包括肉及肉制品、乳與乳制品、調味品、餐飲食品,共5個食品類別。分離得到的61株沙門氏菌,均經吉林省疾病預防控制中心微生物實驗室復核。

1.1.2 試劑、培養基及儀器 緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、營養瓊脂、營養肉湯(北京陸橋股份有限公司);沙門氏菌顯色培養基(法國科瑪嘉公司);API 20E生化試劑盒(法國生物梅里埃公司);VITEK2 全自動微生物鑒定系統GN鑒定卡(法國 BioMrieux公司);沙門氏菌屬診斷血清(丹麥 Statens serum institut 公司);以上均在有效期內使用。SLI-700生化培養箱(上海愛朗儀器有限公司);Nu-425生物安全柜(美國紐埃爾公司);Legend Micro 17高速離心機(美國賽默飛世爾科技有限公司)

1.2 方 法

1.2.1 檢驗方法 按照 GB/T 4789.4《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》以及《國家食品污染和有害因素風險監測工作手冊》中食源性致病菌檢驗標準操作程序進行檢驗[5-6]。

1.2.2 藥物敏感性試驗 對2022年的61株沙門氏菌進行藥敏試驗,共檢測25種抗生素。藥敏結果根據美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)出版的藥物敏感試驗指南 M100 32nd Edition進行判定[7],質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC 25922。

1.2.3 基因組提取、全基因組測序以及數據處理 挑取單個菌落接種至5 mL BHI肉湯中,37 ℃培養過夜,按QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒說明書提取基因組DNA,將核酸提取液送至北京博鰲鷹飛生物有限公司,進行文庫構建和全基因組測序(Whole Genome Sequencing,WGS)。流程如下:對61個DNA樣品構建文庫,利用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行雙末端高通量測序,測序深度為100×。下機后,對測序結果進行質量控制,將過濾后的數據進行denovo組裝,得到基因組contigs序列。

依托全民健康保障信息化工程食品安全風險評估業務應用平臺(https://sppt.cfsa.net.cn/goto/blogin,以下簡稱平臺),對61個測序結果進行MLST分析,確定其ST型別,通過平臺中CARD、ResFinder數據庫篩選沙門氏菌耐藥基因。

2 結 果

2.1 血清型分布情況 61株沙門菌分屬5個群,19個血清型,其中以D群占比最高68.85%(42/61);C群占比次之16.39(10/61);B群居中為8.20%(5/61);E群、G群占比較低,分別為4.92%(3/61)、1.64%(1/61)。19個血清型中腸炎沙門菌占比最高,達52.46%(32/61),為吉林省優勢血清型,其次為蓋勒特匹沙門氏菌占比13.11%(8/61),詳見表1。

表1 沙門氏菌血清分布表

2.2 藥敏實驗結果 按CLSI判定標準將藥物敏感類型分為耐藥型(R)、敏感型(S)、中介型(I)3類,61株沙門氏菌對25種不同抗菌藥物表現出了不同的耐藥性。藥敏結果顯示沙門氏菌對氨芐西林耐藥率最高為60.66%(37/61),其次為四環素占39.34%(24/61),氨芐西林/舒巴坦為24.59%(15/61)、多粘菌素E與頭孢唑林耐藥率均為22.95%(14/61),多粘菌素B為21.31%(13/61),其余抗生素耐藥率均低于20%。頭孢西丁、頭孢他啶、厄他培南、亞胺培南、替加環素均無耐藥菌株檢出,詳見表2。

表2 25種抗生素對沙門菌耐藥性試驗結果

2.3 全基因組測序數據質量分析 61株沙門氏菌基因組長度為4 642 406～5 043 210 bp,GC含量在51.73%～52.21%之間。contig數量范圍在19～90個之間,均為29個,其中數量小于40的菌株數占85.25%(52/61),Q30對應堿基準確率均大于85%。測序數據質量較好,進行后續分析。

2.4 沙門菌的多重耐藥(MDR)模式及耐藥譜 61株耐藥沙門菌中包含耐藥菌株49株,占所有菌株的78.69%(49/61),單耐藥菌菌株占40.82%(20/49),雙重耐藥菌株占28.57%(14/49),同時耐3類以上抗生素的菌株即MDR菌株,占30.61%(15/49)。

25種抗生素共產生31種耐藥譜,無明顯優勢耐藥譜,其中耐藥菌株數最多的有8株,為單耐藥譜AMP;其次為 AMP-TET與CT-PB,均有5株。多重耐藥譜中菌株數最多的譜型為CHL-TET-FFC,有3株,詳見表3。

表3 61株沙門菌耐藥譜

2.5 多位點序列分型(MLST) 根據平臺分析結果61株沙門氏菌共包含ST型13種,其中ST11型占比最高為68.85%(42/61),是吉林省優勢ST型;其次為ST1541型占8.20%(5/61)。腸炎菌、蓋勒特匹、布利丹Ⅱ 3種血清型分型結果全部為ST11,查理沙門氏菌、山夫登堡沙門氏菌、里森沙門氏菌3種血清型分別為ST1541、ST14、ST469型,詳見圖1。

2.6 耐藥基因 根據平臺中CARD、Resfinder數據庫比對結果,61株沙門氏菌均攜帶耐藥基因,共預測耐藥基因97種,主要包含以下7類:氨基糖苷類、β-內酰胺類、鏈霉素類、四環素類,氟喹諾酮類、磺胺類、苯丙醇類,其攜帶率分別為100%(61/61)、62.30%(61/61)、55.74%(34/61)、40.98%(25/61)、19.67%(12/61)、19.67%(12/61)、19.67%(12/61)。共檢測到6種β內酰胺類耐藥基因,分別為blaCTXM14、blaCTX-M-55、blaTEM1、blaTEM141、blaOXA1,blaNDM1,其中blaTEM1攜帶率最高,占54.10%(33/61),其余基因檢出率均低于10%。檢測到16 種氨基糖苷類耐藥基因,其中aac(6′)Iy基因攜帶率最高,達88.52%(54/61),檢測到4種氟喹諾酮類耐藥基因,aac(6′)Ib-cr、QnrB6、QnrD、QnrS1,其中QnrS1攜帶率最高為14.75%(9/61),其余基因攜帶率均低于10%;檢測到兩種氯霉素類耐藥基因分別為floR、cmlA1,floR攜帶率較高為16.39%(10/61);檢測到3種磺胺類耐藥基因,分別為sul1、sul2、sul3,其中sul2攜帶率最高(52.46%,32/61),其余基因均低于10%;檢測到4種甲氧芐啶類耐藥基因,分別為dfrA12、dfrA14、dfrA17、dfrA27,耐藥率均低于10%;檢測到2種四環素類耐藥基因,分別為tetA、tetC,2種耐藥基因同時出現,攜帶率均為40.98%(25/61)。此外還檢測到磷霉素、利福霉素類和大環內酯類、林可酰胺類耐藥基因,攜帶率分別為9.84%(6/61)、8.20%(5/61)和11.48%(7/61)、6.56%(4/61),未檢出多肽類耐藥基因mcr,詳見圖1。

2.7 耐藥表型與耐藥基因 在大環內酯類、β內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類以及磺胺類表型耐藥的菌株中,均檢出相應的耐藥基因,同種類抗生素中耐藥基因攜帶率最高的分別為mphA(100%,5/5)、blaTEM1(86.49%,32/37)、aac(6′)Iy(83.33%,5/6)、QnrS1(66.67%,4/6)、sul3(57.14%,4/7)。四環素類及苯丙醇類表型耐藥的菌株中,相應耐藥基因檢出率分別為95.83%(23/24)、90.91%(10/11),四環素類抗生素tetA、tetC基因攜帶率均為95.83% (23/24)。苯丙醇類抗生素中floR基因攜帶率最高,為90.91%(10/11)。

3 討 論

每年發展中國家約有2 000萬人感染沙門氏菌,造成近20萬人的感染和死亡。如今沙門菌所引發的食源性疾病已成為全球性的公共衛生問題,美國每年沙門菌腸道感染病例大約有140萬[8]。據統計, 我國70%～80%細菌性食物中毒由沙門菌引起, 其中90%以上由禽肉類等動物源性食品引起[9-10]。

本次監測結果中,吉林省1 000份市售食品樣品中共檢出沙門氏菌61株,總檢出率為6.1%,說明市售食品均有不同程度的沙門菌污染,與吳憲等人的研究結果相符[11]。生肉及生肉制品的沙門菌檢出率最高,與2011-2018年間本省食品中沙門菌檢測結果基本一致[12]。吉林省位于北方地區,檢測率總體表現為夏秋季高,冬春季少。夏秋季溫度相對較高且氣候濕熱,更易于細菌等微生物的繁殖生長。

吉林省沙門氏菌的優勢血清型為腸炎沙門氏菌,這與云南、廣西等省市研究結論基本一致[13-15]。不同地區的優勢血清型也存在一定差異。據報道,上海市和渭南市的優勢血清型均為鼠傷寒沙門菌、德爾卑沙門菌[8,16]。內蒙古自治區的血清型以腸炎沙門菌和德爾卑沙門菌為主[17]。由于抗生素在食品、農業以及臨床方面的廣發使用,造成沙門氏菌的耐藥率居高不下,而攜帶耐藥基因的菌株可以通過質粒進行耐藥基因的轉移傳播,產生多重耐藥菌株,加劇了我國食品安全問題[1,18-19]。此次藥敏結果顯示61株分離株對氨芐西林、四環素、氨芐西林/舒巴坦、頭孢唑林以及多粘菌素類的耐藥性較高,對頭孢西丁、替加環素、頭孢他啶/阿維巴坦敏感性較高,這與我國其他地區藥敏結果基本一致[20]。

61株沙門菌均攜帶耐藥基因以及外排泵,其中氨基糖類、氟喹諾酮類、四環素、β-內酰胺類攜帶率較高,提示在食品來源的沙門菌中,相關藥物的耐藥可能已經廣泛存在并傳播。多位點序列分型結果中,腸炎沙門菌對應ST11型,結果與北京市研究結果一致[21],提示血清型與ST型之間可能緊密相關。同時,不同血清型的菌株中攜帶的耐藥基因種類存在差異。推測在沙門氏菌中,耐藥基因的種類與ST型、血清型存在著一定程度的關聯,ST型別及血清型的差異可能會影響耐藥基因的傳遞水平。

本研究中第一代頭孢類抗生素耐藥率遠高于其他頭孢類抗生素,說明高代數頭孢雖已開始在養殖業中使用,但范圍尚不廣泛。從攜帶基因方面來看,61株沙門菌中β-內酰胺類抗生素耐藥表型和耐藥基因攜帶情況一致率較高,說明此類耐藥表型與耐藥基因的存在有密切的關系,基本遵循一一對應的關系。此次篩選到一株印地安納沙門氏菌,碳青霉烯類表型耐藥株的同時攜帶blaNDM金屬酶基因,經一代測序比對后確認為blaNDM-1。此菌株對亞胺培南在內的9種β-內酰胺類抗生素表現為耐藥,且同時攜帶19種耐藥基因、外排泵(mdtK、emrA、emrB、sdiA、marA、robA、H-NS等)、多重耐藥外排蛋白(mdtG、acrB-tolC)以及位移酶mdfA。隨著臨床上耐碳青霉烯類藥物的使用,其耐藥率逐年攀升,特別是大腸桿菌及肺炎克雷伯菌已是屢見不鮮,然而此次在食品來源的沙門菌中檢出,此情況在我國尚不常見。

多肽類抗生素對于禽類感染致病性腸桿菌的治療具有顯著效果[22],我國農業部門已于2016年7月發布第2428號公告[23],正式停止在動物中使用多粘菌素作為飼料添加劑,但本研究中,多粘菌素耐藥情況不容樂觀,作為治療革蘭氏陰性菌的最后一道防線已是岌岌可危[24]。多粘菌素耐藥機制主要包括兩種途徑:染色體介導和mcr基因的質粒介導,本研究中未檢測到mcr基因以及PmrAB和PhoPQ調控系統,但包含大量PmrC、PmrE、PmrF基因,說明沙門菌中多粘菌素耐藥機制除了與PmrAB和PhoPQ調控系統有關外,可能存在其他調控系統及相關機制。

多重耐藥菌的劃分標準目前仍不統一[25]。有學者將其定義為:同時對多種作用機制不同或結構完全各異的抗菌藥物具有耐藥性,即對3類及以上抗菌藥物同時耐藥的病原菌為多重耐藥菌[26]。本文將頭孢菌素、青霉素類、單環β-內酰胺類、碳青霉烯類按藥物作用機制歸類于β-內酰胺類中以便分析。分析結果發現,耐β-內酰胺類的菌株絕大多數都伴隨耐其他類別抗生素的情況發生,這與其他學者研究結果相符[27]。

隨著耐藥菌株也在不斷涌現,沙門菌耐藥譜型也隨之變化,使得菌株多重耐藥率不斷攀升。因此,針對吉林省食源性沙門菌的多重耐藥情況,應盡快建立快速有效的防控機制,并結合當地優勢血清型、耐藥譜型及耐藥基因,優化治療方案,合理使用抗生素。

利益沖突：無

引用本文格式：孫景昱,趙薇,孫績巖,等.2022年吉林省食品中沙門氏菌耐藥性及分子特征分析[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):104-110. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.016