福建省36株人源豬鏈球菌分離株病原學特征分析

梁雪晨,高亞東,李曲文,,3

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌,最早報道于1954年,1968年在丹麥報告首例人感染豬鏈球菌病例[1]。豬鏈球菌宿主存在多樣性,主要宿主是豬,定植部位為豬的上呼吸道。人感染豬鏈球菌的主要途徑是呼吸道和接觸,例如通過破損的傷口、黏膜、消化道、鼻咽腔等。感染豬鏈球菌會引起化膿性關節炎、聽力喪失、敗血癥等疾病,甚至威脅生命。根據莢膜多糖抗原差異,將豬鏈球菌分為29個血清型,為1-19、21、23-25、27-31和1/2[2]。其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14型為引起豬鏈球菌病的主要血清型。1998年和2005年2次疫情暴發,均為豬鏈球菌2型[3]。豬鏈球菌發病率與致病性和其數量無關,而與其毒力因子相關。豬鏈球菌毒力因子眾多,根據其攜帶毒力因子的不同,被分為高致病性毒株、低致病性毒株和無致病性毒株[4]。常用多位點序列分析分型(Multi-locus sequencing typing,MLST)測定細菌的多個管家基因獲得菌株的序列型(sequence type,ST)對其進行分類。隨著高通量測序成本的降低,全基因組測序技術廣泛運用于分析豬鏈球菌的流行病學、致病性、耐藥性以及進化等研究。豬鏈球菌血清型眾多,疫苗防治效果不理想,養殖場常在飼料中添加抗生素進行預防。抗生素的濫用導致豬鏈球菌產生了耐藥性,甚至出現多重耐藥菌株[5],因此調查和分析豬鏈球菌的耐藥性與耐藥基因不僅對臨床治療豬鏈球菌感染引起的相關疾病有極大幫助,還有助于新型抗菌藥物的研發。自2005-2023年期間,福建地區共報告了36例人感染豬鏈球菌的病例。為了解福建省人源豬鏈球菌分離株毒力基因、耐藥情況,進行了全基因組分析、藥敏試驗等研究,以了解福建流行菌株的病原特征,對福建地區的豬鏈球菌防控提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 福建省2005-2023年分離自人的豬鏈球菌分離株,共計36株(菌株標號為1-36號,見表1),均通過PCR、質譜、生化鑒定為豬鏈球菌。

表1 福建省人源豬鏈球菌信息表

1.2 主要儀器設備 熒光PCR儀購自中國杭州博日科技股份有限公司;常規PCR儀購自美國ABI有限公司;全自動快速生物質譜檢測儀購自BRUKER公司;鏈球菌藥敏試劑板DL-96STR MIC購自珠海迪爾生物工程股份有限公司;豬鏈球菌熒光PCR核酸檢測試劑盒購自深圳生科原有限公司;血瓊脂平板購自北京陸橋技術股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的復蘇 將實驗室保存的36株豬鏈球菌菌株分別劃線接種于血瓊脂平板上,放入37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養18～24 h。

1.3.2 DNA提取 使用凱杰基因組試劑盒,參照試劑盒說明書提取細菌基因組,用于毒力、耐藥、基因組測定等實驗。

1.3.3 毒力因子檢測 選擇豬鏈球菌主要的毒力基因(mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh)進行 PCR 檢測,參考文獻[6]合成引物。引物由生工生物工程股份有限公司合成。PCR 反應體系(23 μL):模板 DNA 3.0 μL,上、下游引物各 0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL。PCR 反應結束后,取 5 μL 產物進行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳,通過凝膠成像系統觀察并記錄結果。

1.3.4 全基因組測序 由上海生工生物工程股份有限公司有限公司進行細菌基因組框架圖測序。使用Illumina Hiseq進行基因組二代測序,對測序的原始數據通過FastQC進行質量評估,使用SPAdes拼接二代測序數據,拼接的序列用于后續分析。

1.3.5 藥敏試驗 藥敏實驗按照鏈球菌藥敏試劑盒微量肉湯稀釋法(MIC法)說明書進行,質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。耐藥折點值參考2020版美國臨床實驗室標準協會(CLSI)藥敏實驗判斷標準中肺炎鏈球菌的判斷標準。

1.3.6 耐藥基因及耐藥基因預測 使用CARD網站預測菌株可能攜帶的林可酰胺類、大環內酯類、四環素類、氯霉素類等耐藥基因,并通過ICEfinder網站預測可能含有的ICE。

1.3.7 多位點序列分型 將全基因組序列結果在PubMLST網站進行7個管家基因(mutS、recA、aroA、cpn60、thrA、dpr、gki)及序列ST型查詢。將全基因組測序數據上傳至BacWGSTdb網站繪制SNP進化樹(參考菌株A7_CP002570_ST7)。使用iTOL(https://itol.embl.de/)對進化樹進行美化。

1.3.8 統計分析 采用Excel 2013軟件錄入實驗室檢測結果和全基因組分析數據,進行統計分析。

2 結 果

2.1 毒力基因檢測 通過PCR對36株豬鏈球菌分離株mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh毒力基因進行了檢測,其攜帶率分別為55.6%、80.6%、86.1%、100%、100%、100%。sly+epf+mrp+為優勢毒力基因型,共15株,占47.1%,其次為sly+epf+mrp-毒力基因型,共10株,占27.8%,sly-epf+mrp-毒力基因型共4株,sly+epf-mrp-、sly-epf+mrp+與sly+epf-mrp+毒力基因型各2株,sly-epf-mrp+毒力基因型1株。

2.2 MLST分型及毒力基因攜帶模式 36株豬鏈球菌的MLST分析結果顯示,有5種不同的ST型,其中以ST1型58.3%(21/36)與ST7型30.6%(11/36)最為常見。

36株豬鏈球菌分離株ST型與血清型和毒力基因型的關系見表2,ST1主要毒力基因型為sly+epf+mrp-與sly+epf+mrp+;ST7主要毒力基因型為sly+epf+mrp+;ST25毒力基因型是sly-epf-mrp+與sly-epf+mrp-。

表2 豬鏈球菌ST型與血清型和毒力基因型分布

2.3 耐藥表型及基因型 36株藥敏結果顯示:對四環素的耐藥率高達100%(36/36),紅霉素83.3%(30/36)、克林霉素83.3%(30/36),復方新諾明耐藥率55.6%(20/36),氯霉素11.1%(4/36),頭孢噻肟、美羅培南、頭孢吡肟、萬古霉素、青霉素均為2.8%(1/36)。36株豬鏈球菌中7重耐藥菌株有1株,占比2.8%(1/36),5重耐藥菌株有2株,占比5.6%(2/36),4重耐藥菌株有17株,占比47.2%(17/36),3重耐藥菌株有10株,占比27.8%(10/36),2重耐藥菌株有2株,占比5.6%(2/36),耐1種藥物的菌株4株,占比11.1%(4/36)。其中最常見的是4重耐藥,具有兩種耐藥模式:四環素+紅霉素+克林霉素+復方新諾明(14株);四環素+紅霉素+克林霉素+氯霉素(2株),見表3。

表3 豬鏈球菌耐藥情況

對四環素耐藥基因(tet40、tetB、tetE、tetL、tetM、tetO)、大環內酯類耐藥基因(mefA、ermA、ermB)、氨基糖苷類耐藥基因(acc(6′)-aph(2″)、ant(6)-Ia、ant(9)-Ia、aph(3′)-III)、葉酸通道拮抗劑耐藥基(dfrG)、惡唑烷酮類耐藥基因(optrA)、氯霉素類耐藥基因(cat、FloR、cmlA)進行預測,不同菌株攜帶耐藥基因種類也不同,最常見的是cmlA(31株,86.1%),其次是ermB(30株,83.3%)、tetL(30株,83.3%)、tetE(27株,75%)、tetB(25株,69.4%)、tetM(21株,58.3%)、FloR(20株,55.6%)、tetO(19株,52.8%)和dfrG(19株,52.8%)等。同時結合耐藥基因及SNP進化系統發育樹分析顯示,36株菌株可分為4個進化譜系,其中譜系1包括15株(41.7%)均為ST1型,譜系2中2株為ST25和1株ST2249;譜系3中6株ST1型和2株ST7型;譜系4中9株ST7型和1株ST1711型,見圖1。

注:用最大似然法構建進化樹,黑色填充表示存在參數。

3 討 論

豬鏈球菌是一種人獸共患病病原體,人可通過破損的傷口接觸而感染。本研究通過全基因組測序和抗生素敏感性實驗,分析了福建省近18年分離到的36株人源豬鏈球菌的毒力、耐藥和分子流行病學特征。血清2型被認為是最致命的血清型,曾在中國造成了兩次大規模的人類疫情和大量的豬死亡[7-8]。血清型3、7和9在許多國家也廣泛傳播。本研究的豬鏈球菌分離株中,血清型2(97.2%)最常見,與現有報道一致[9]。

豬鏈球菌的毒力因子與致病力之間的作用機理還未明確,但兩者之間存在密切聯系。豬鏈球菌根據毒力基因不同分為強毒株、弱毒株和無毒株[10]。sly、epf、mrp是血清型2菌株的常用毒力指標[1,12],本研究中豬鏈球菌的毒力基因攜帶情況,其中以sly+epf+mrp+有15株,占比41.7%,為最主要毒力基因攜帶型別,表明我省人感染分離株多為強毒株。多位點序列分型(MLST)是通過測定核酸序列來對細菌進行分型的方法,豬鏈球菌的MLST分型已經有1 000多種。根據報道,在我國主要流行的MLST分型主要為ST1和ST7型,本研究通過全基因組測序并上傳到pubMLST網站進行分型,發現福建省近18年分離到的人感染豬鏈球菌多為ST1型(58.3%),與文獻中報道的豬鏈球菌易感染人主要是血清2型的ST1為主的結論相一致[13]。

2017-2019年中國臨床分離到的豬鏈球菌大多對克林霉素(96.26%)、四環素(92.52%)和紅霉素(67.29%)耐藥[14-15]。本研究中我們檢測了36株豬鏈球菌對15種抗生素藥物的敏感性,所有分離株至少對一類抗生素耐藥,其中,36株均對四環素耐藥,對紅霉素和克林霉素也發現具有較高的耐藥率,而對替考拉寧、阿莫西林、左氧氟沙星、青霉素、萬古霉素、莫西沙星、利奈唑胺敏感,與其他地區研究結果類似[16]。研究發現福建省的分離株中林可酰胺類、大環內酯類和四環素類耐藥基因的攜帶率較高。抗生素在食品動物養殖過程中不僅用于預防控制和治療病原菌感染,也常作為生長促進因子,增加肉的產量。據報道,在所有抗生素中,四環素是豬生產中使用最廣泛的,很多研究也報道了中國養豬場使用磺胺類、四環素類、氟喹諾酮類、大環內酯類和β類酰胺類抗生素[17-18]。這導致豬鏈球菌對四環素、紅霉素和克林霉素耐藥率高,提示應及時調整抗生素治療策略,合理使用抗生素,避免產生耐藥性。而青霉素、萬古霉素、利奈唑胺屬于人常用藥物,一般很少獸用,因此幾乎所有的菌株都對這幾種抗生素敏感,但近些年也有許多研究發現有攜帶利奈唑胺耐藥基因的菌株其表現對利奈唑胺及氟苯尼考等耐藥[19]。

對36株豬鏈球菌的耐藥基因進行了預測,發現福建省的人感染豬鏈球菌分離株普遍存在耐藥基因,且菌株攜帶耐藥基因型與其耐藥表型一致。其中氯霉素類、大環內酯類和四環素類耐藥基因的攜帶率較高,這可能與這些抗生素在養殖業中的廣泛使用有關,使耐藥基因發生選擇和擴散。同時通過ICEfinder網站對菌株分析發現本研究中的36株有15株含有整合性接合元件 (Integrative and conjugative element, ICE),還需進一步對該類菌株研究,以防攜帶這些元件菌株成為耐藥性傳播的重要載體。

綜上所述,本研究揭示了福建省人感染豬鏈球菌菌株的毒力、耐藥和部分基因組特征具有一定的地域性特征。應加強對福建省各地區豬鏈球菌的監測,加大對相關從業人員的健康教育,防止人感染豬鏈球菌病的暴發。

利益沖突：無

引用本文格式：梁雪晨,高亞東,李曲文.福建省36株人源豬鏈球菌分離株病原學特征分析[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):161-165,170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.026