常見食源性病原菌的快速檢測技術研究進展

俞 佳,岑葉平,江玲麗,高有領

食源性病原微生物可引發疾病,它們可以通過水、土壤、空氣等媒介傳播,并在食品加工、運輸和貯藏等環節污染食品,對人類造成不同程度的危害[1-2]。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)統計顯示,每年約有1/10的人因食源性微生物感染而患病,給公共衛生帶來嚴重負擔,且5歲以下兒童具有更高的患病風險[3]。如今由食源性病原微生物引起的疾病仍時有發生,如何快速、高效地檢測食源性病原微生物成為食品安全問題的關鍵所在。

微生物引發的食源性疾病為美國患者住院和死亡的主要原因,最常見的病原菌有單核細胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,簡稱單增李斯特菌)、大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenterica)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、弧菌屬(Vibriospp.)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli(STEC))等[4]。一旦從污染的食品中攝入這些病原菌,就會給人體造成不同程度的危害(表1)。以單增李斯特菌為例,它是一種重要的人獸共患病原體,研究證明,牛是其主要的無癥狀攜帶者,單增李斯特菌不僅可以通過牛和牛乳進行傳播,而且在牛糞施肥后的土壤上也有較強的生存能力,從而給農產品帶來污染的風險。此外,其他肉類、奶制品、魚類也是其傳播媒介[5]。單增李斯特菌可導致腸道感染,患者出現發熱、肌肉酸疼、惡心、嘔吐等癥狀,嚴重者還會穿越人體的大腦屏障和胎盤屏障,導致敗血癥、腦膜炎及孕婦流產[6],在免疫力低下人群中具有較高的病死率[7]。

表1 常見食源性病原菌對人的主要危害

傳統的食源性病原菌檢測方法一般采用平板培養,并結合生化鑒定和血清型鑒定。該方法應用范圍廣、準確率高、操作簡便,檢測成本低,至今仍是檢測病原微生物的金標準。但由于其耗時長、出現假陰性的概率較大[4],逐漸不能滿足當下食品快速檢測的要求。隨著科學技術的日新月異,已建立了多種快速檢測食源性病原微生物的方法,并逐漸成為檢測行業的標準。本文總結食品中常見病原菌的各項檢測技術并比較各自優缺點,以期能為今后的食品安全快速與現場檢測提供參考和依據。

1 免疫識別檢測類

1.1 免疫層析法 免疫層析法(Immunochromatographic Assay,ICA)是建立在層析法與抗原-抗體特異性反應上的一種快速免疫識別檢測技術。其原理是待測樣品溶液與檢測試紙中的抗體反應后,溶液因毛細管作用沿硝酸纖維素膜向上移動。若溶液中含有目標菌,可與在膜上的檢測線(T)上固定的特異性抗原或抗體結合并顯色,從而特異性檢出目標病原菌。同時,該膜上還有一條質控線(C),無論有無目標菌,該線上固定的特異性抗原或抗體都可以與結合墊上的抗體結合而顯色,從而判斷結果是否有效[16]。

免疫層析法包括膠體金免疫層析法、基于磁性納米顆粒的免疫層析法和熒光微球免疫層析法等[17-19]。其中膠體金免疫層析法具有檢測快速、準確率高、成本低、便于現場檢測等特點,在食品微生物的檢測中應用較為廣泛[20-21]。我們前期建立了一種檢測單增李斯特菌溶血素(LLO)的膠體金試紙,在15 min內即可對樣品進行檢測,檢測速度快,且具有特異性強、穩定性高、重復性好的特點,檢出限可達3×105CFU/mL[20]。為了提高試紙的檢測效率,多聯檢測試紙應運而生。夏詩琪等[21]制備出了可同時檢測5種沙門氏菌的膠體金試紙,檢出限達到105～106CFU/mL,實現了對5種沙門氏菌的同時檢測。膠體金多聯檢測試紙大大提高了檢測效率,在食品檢測中具有較高的應用價值。

1.2 免疫吸附法

1.2.1 酶聯免疫吸附法 酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)是基于抗原抗體反應的一種檢測方法。該方法將抗體(或抗原)固定在固相載體上,使酶標的抗原(或抗體)和待測樣本進行競爭性結合,根據加入含酶底物后溶液的顯色情況對樣本進行定性和定量檢測,具有檢測速度快、特異性強、靈敏度高等特點,已廣泛應用于食品和醫學等檢測領域[4,22]。

傳統的ELISA方法具有設備昂貴、抗體制備流程復雜且不同批次的抗體質量差異較大、容易產生交叉反應等局限性[4],現已開發多種ELISA與其他技術相結合的新方法。Pang等[23]開發了一種基于紙張的ELISA檢測方法(P-ELISA),使用該方法對致病性大腸桿菌O157∶H7進行檢測,檢測限可達到1×104CFU/mL,且無需依賴大型設備,攜帶方便,有利于現場檢測。Gu等[24]研制了一種特異性納米抗體,該抗體可與辣根過氧化物酶結合,無需額外制備二抗,有效縮短了檢測時間,降低了檢測成本。研究顯示該方法檢測腸炎沙門氏菌的檢測限可達5×104CFU/mL,且經8 h富集,在牛奶中的檢測限可達10 CFU/mL,與傳統ELISA方法相比具有更高的靈敏度。因此將ELISA與其他技術相結合,研發出更靈敏、快捷的檢測方法,是目前研究的熱點方向之一,應用前景較廣闊。

1.2.2 熒光免疫吸附法 熒光免疫吸附法(Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay, FLISA)是利用免疫吸附原理,將抗體(或抗原)固定在固相載體上,并用熒光物質代替傳統的辣根過氧化物酶等物質標記抗體(或抗原),使其與待測樣本進行競爭性結合,激發熒光標記物,最后通過熒光信號的強弱對目標病原菌進行定性或者定量鑒定[25]。

黃偉華等使用熒光微球作為標記物,利用雙抗體夾心熒光免疫吸附法對單增李斯特菌進行定量檢測,并與傳統ELISA法進行比較。結果顯示ELISA法的檢測限為107CFU/mL,熒光免疫吸附法的檢測限為105CFU/mL,靈敏度比ELISA法提高了兩個數量級,且與其他致病菌無明顯交叉反應[26]?？梢姛晒饷庖呶椒ㄝ^酶聯免疫吸附法具有更高的靈敏度和特異性。

1.3 免疫磁珠分離技術 免疫磁珠分離技術(Immunomagnetic bead separation techniques, IMBS)是將特異性抗體包被于磁珠之中,以此來捕獲目標抗原,并在磁場的作用下對目標抗原進行分離和富集,從而達到快速分離目標抗原的目的。免疫磁珠分離技術有著效率高、可重復性好、速度快、操作簡便等優點,可代替傳統檢測中選擇性增菌的步驟[27]。

Wang等[28]通過免疫磁珠分離技術與流式細胞相結合,富集并檢測了生菜和草莓中單個大腸桿菌O157活體細胞,該檢測過程需5.7 h,檢測限可達1 CFU/25 g。與傳統分離培養方法相比,大大縮短了檢測時間,提高了檢測效率。但由于免疫磁珠價格過于昂貴,且只能對目標病原菌進行富集與分離,還需結合其他技術對病原菌進行進一步鑒定,限制了其在實際檢測中的廣泛應用。

免疫學檢測方法檢測食源性病原菌具有準確率高、特異性強、速度快等優點,已廣泛應用于食品檢測領域,但同時也存在設備或試劑昂貴、操作復雜等缺點,如何進行進一步優化,是目前主要的研究熱點之一。

2 分子生物學檢測類

2.1 傳統核酸檢測方法

2.1.1 聚合酶鏈式反應 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)由美國Mullis于1986年發明,它實現了核酸分子在體外短時間內大量擴增[29]。該方法通過設計病原菌的特異性引物進行PCR擴增,并在瓊脂糖凝膠電泳后通過凝膠成像儀對產物進行驗證,即可完成對目標樣品檢測。PCR反應具有特異性強、靈敏度高、成本低等優點,已廣泛應用于食源性病原菌的檢測之中[4]。但其每次只能檢測一種病原菌,且不能進行定量,存在一定的假陽性[4,30]。

為解決PCR反應只能單通量檢測的缺陷,建立了多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)技術。mPCR可針對多個目標病原菌設計多對引物,使其在同一體系中進行PCR擴增,以實現多個病原菌的同時檢測。Tao等[31]建立了一種可同時檢測沙門氏菌、單增李斯特菌、致病性大腸桿菌等11種病原菌的通用引物介導的mPCR檢測方法,檢測限可達103～104CFU/mL,其中對霍亂弧菌和福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)的檢測限可達102CFU/mL[31]。Boukharouba等[32]基于mPCR,建立了一種可同時檢測致病性大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的方法。該研究將四種病原菌于緩沖蛋白胨水(BPW)中進行統一增菌后,使用mPCR法對其進行同時檢測。該方法的檢測限可達10 pg/μL,且BPW肉湯可有效支持四種病原菌的共同生長,從而減少因不同病原菌各自分離培養所需的時間和成本。但mPCR的特異性不高,引物設計復雜,且仍存在不能定量分析,無法區分活菌和死菌,因而仍具有一定的局限性[33]。

2.1.2 熒光定量PCR 熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是基于PCR反應,在反應體系中加入熒光染料或熒光探針等熒光物質,利用熒光信號的變化對整個反應進行實時監測,即可得到DNA擴增的實時數據,實現對目標病原菌的定量分析。與普通PCR相比,qPCR具有更高的特異性和靈敏度,且可實現對目標病原菌的定量分析[34-35]。

Vizzini等[36]基于qPCR設計了一對引物CampyPFw和CampyPRv,可同時對4種彎曲桿菌進行鑒定,該方法無需預增菌步驟,且具有較高的靈敏度,檢測限約為4.6×102cells/mL。王華健等[37]通過分別設計三對特異性引物和探針,建立了可同時檢測大腸桿菌O157∶H7、沙門氏菌和單增李斯特菌的多重qPCR方法,結果顯示該方法具有較好的特異性,檢測限為104copies/μL,并具有較好的重復性。為改進熒光定量PCR方法無法區分死菌與活菌的缺點,張俊彥等利用疊氮溴化乙錠(EMA)與實時熒光PCR技術相結合來檢測食品中的單增李斯特菌活菌。結果顯示,該方法與傳統的細菌分離培養法結果一致,且在10 h左右完成檢測,時間遠短于傳統檢測方法,檢測限可達55 CFU/反應[38]。 qPCR的缺點為檢測成本較高,容易產生交叉污染,且加樣時溫度、速度等因素均會影響結果,對操作者的技術要求較高[33,39]。

2.1.3 數字PCR 數字PCR(digital PCR,dPCR)是可以對核酸分子進行絕對定量的檢測技術。dPCR可將體系中的樣本分成幾十萬份,使每個反應單元盡可能僅包含一份核酸樣品,從而分別進行擴增反應,通過檢測到的熒光信號大小對目標物質進行定性和絕對定量分析。dPCR技術在檢測中無需建立標準曲線或添加標準物質,且檢測限低,準確率高,在食源性病原菌的檢測中具有較大的優勢[40]。

Suo等[41]開發了一種芯片數字PCR(chip digital PCR,cdPCR)技術用以快速檢測復雜食品基質中的鼠傷寒沙門氏菌,該方法僅需2 h完成檢測,檢測限可達90 CFU/反應,捕獲效率為94.5%,該方法實現了預增菌與定量檢測的結合,有利于現場檢測。He等[42]基于微滴數字PCR(droplet digital PCR,ddPCR),建立了可從食品中檢測致病性大腸桿菌的方法,并可同時檢測其產生的志賀毒素。該方法無需預增菌,在蘋果汁中的檢測限可達2 CFU/mL。dPCR動態范圍受反應單元數量限制,在分析前需要對樣品進行稀釋,且dPCR的儀器和試劑較昂貴,檢測成本較高[43]。

2.2 核酸等溫擴增檢測方法

2.2.1 環介導等溫擴增技術 環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術由Notomi等于2000年首次發表[44],該方法通過兩對特異性引物識別目的基因的6個特異性序列,反應在恒溫(60 ℃～65 ℃)下進行,具體步驟如圖1[45]所示。LAMP方法反應速度快,通常在1 h內就可以完成對目標樣品的檢測,且特異性強、成本低。與PCR反應相比,LAMP可直接對樣本進行檢測,無需進行增菌,反應的結果可通過不同方法(比濁法、鈣黃綠素等)用肉眼直接判斷,無需通過凝膠電泳檢測,且LAMP反應的靈敏度比PCR高10～100倍[46]。

注:A.起始物合成階段。1-2. 在Bst DNA聚合酶的作用下從內部引物FIP開始合成互補DNA鏈;3-5. 外部引物F3與模板結合,置換FIP連接的互補鏈,并在5′端處形成莖環結構;6-8. 在下游內部引物BIP作用下延伸DNA鏈,并在下游外部引物B3作用下置換DNA,最終形成兩端都有莖環的結構的產物。B.循環擴增階段。8-11. 雙莖環DNA作為第2階段循環擴增的模板,在內引物和Bst DNA聚合酶引導下進行循環擴增,最終擴增出長短不一的花椰菜狀DNA

Hassan等[47]建立了一種基于LAMP快速檢測肉類和牛奶中金黃色葡萄球菌的方法,該方法以致病性金黃色葡萄球菌的femA基因和arcC基因為靶基因進行LAMP反應,整個檢測過程需要1.3 h,且該試驗的靈敏度較PCR反應提高了100倍。Jainonthee等[48]建立了一種基于RNA反轉錄(RT)與LAMP相結合的RT-LAMP法,用于實時檢測雞肉中的空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni),該方法使用9 min即可使反應達到最佳閾值,且可在3 h內完成整個檢測過程,檢測限可達103CFU/mL。但由于LAMP反應至少需要設計兩對特異性引物,引物設計較為繁瑣,且在檢測過程中容易產生非特異性擴增與污染,距離初步的產業化應用還需要進一步研究[49]。

2.2.2 重組酶聚合酶擴增技術 重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技術也是一種等溫擴增技術,該方法由Piepenburg等于2006年首次提出[50]。RPA通過重組酶與引物結合模板中的同源序列結合并插入模板中形成D-環結構,再在單鏈結合蛋白與DNA聚合酶作用下進行延伸,使用凝膠糖電泳或熒光探針檢測擴增產物,以達到對目標病原菌定性或定量檢測的目的(圖2[51])。相對于LAMP,RPA可在更低的溫度下(37 ℃～42 ℃)進行反應,反應時間僅需5～20 min,且靈敏度高,特異性強,操作更為簡便[52]。

注:A. 重組酶與引物結合,形成重組酶引物復合體;B. 重組酶引物復合體定位到DNA模板上的同源序列;C. 重組酶引物復合體插入DNA序列形成D-環結構,啟動鏈置換反應;D. 單鏈結合蛋白與解開的DNA鏈結合,防止進一步置換;E. 在DNA聚合酶作用下,DNA開始復制延伸;F.兩條新的雙鏈互補DNA形成

Li等[53]基于RPA技術,結合光敏比色法來檢測沙門氏菌,結果顯示該試驗在1 h內即可完成,檢測限為5×103CFU/mL,對沙門氏菌進行6 h增菌后,檢測限可達3 CFU/mL。Du等[54]將RPA技術與側流層析試紙結合,建立了一種快速檢測單增李斯特菌的方法,該方法可在15 min內完成檢測,檢測限為15 CFU/mL,對樣品進行預增菌6 h后,檢測限可達1.5 CFU/mL。目前RPA商業化的試劑盒較少,試劑價格相對較高,且沒有專門設計引物的軟件,僅用于實驗室研究,在食品檢測行業中還未得到廣泛應用[55]。

2.3 基因芯片技術 基因芯片技術又稱DNA微陣列技術,其原理是將大量核酸探針片段按陣列方式固定在載體表面上,使被標記的樣本核酸片段與之雜交,通過雜交時產生的信號強弱對樣品進行定性或定量分析?；蛐酒夹g具有通量高、特異性強、速度快、靈敏度高、可區分活菌與死菌,目前應用比較廣泛。但基因芯片價格昂貴,且制備復雜,重復性較差,需要專業的操作人員,因此如何優化該技術,使之簡便化與低成本化,是目前研究的熱點之一[56]。

Srinivasan等[57]設計了一種高密度微陣列同時鑒定14種食源性病原微生物,該技術使用金標記銀增強(gold labeling with silver enhancement,GLS)方法,并通過使用高分辨率的平板掃描儀量化反應過程中金沉積與銀增強所產生的信號,從而對目標樣品進行定量分析。該高密度微陣列避免了假陽性的產生,具有與PCR相似的靈敏度,且無需使用昂貴的激光掃描儀,是一種經濟且可靠的微陣列檢測方法。Li等[58]設計了一種可視化DNA微陣列芯片,以同時檢測食品中常見的病原體。該方法將mPCR與基因芯片技術結合,將堿性磷酸酶及其底物引入試驗,可通過肉眼直接判斷結果,并通過比色法對目標物質進行定量分析,該方法的檢測限小于102CFU/mL,具有較高的靈敏度。

2.4 新型快速核酸檢測方法

2.4.1 核酸-微流控芯片 核酸-微流控芯片技術是基于小型微流控芯片進行核酸擴增并檢測擴增產物,從而鑒別病原菌的一種快速檢測方法。微流控技術由Whitesides于2006年提出,該技術特征是使用微米級通道對流體進行精密操控[59]。微流控技術可將樣品制備、反應、分離、分析等步驟集成于一塊微小的芯片上,集成度高、檢測速度快、成本低、靈敏度高,可實現高通量檢測和現場檢測[60]。將微流控芯片與核酸檢測結合,無需使用大型且昂貴的核酸擴增設備,既降低了成本,又便于現場檢測,有較大的市場潛力。目前,應用于食源性病原菌檢測中的核酸-微流控技術有PCR-微流控芯片技術、LAMP-微流控芯片技術和RPA-微流控芯片技術等(表2)。下面將應用比較多的PCR-微流控技術與LAMP-微流控技術進行介紹。

表2 核酸-微流控技術在食源性病原菌快速檢測中的部分應用

Kopp等[61]于1998年首次建立了將PCR與微流控技術相結合的檢測技術,PCR-微流控技術與傳統PCR技術相比,體系溫度更為均勻,檢測的靈敏度與準確率大大提高,是目前快速檢測食源性病原菌的研究熱點之一。Zhang等[62]建立了一種新型PCR-微流控芯片來檢測大腸桿菌O157∶H7,該技術通過在反應通道中泵入磁珠,并對其施加多環高梯度磁場,以高效獲取樣品中的DNA,結果表明該方法對大腸桿菌O157∶H7的檢測限可達12 CFU/mL,具有較高的靈敏度。為了降低檢測成本,方便現場檢測,Salman等設計出一種便攜的分流PCR微流控裝置。該裝置在體系循環時可較快進行加熱和冷卻,進而縮短反應時間。同時,該技術通過結合低成本且高靈敏度的鎖定光電檢測器對樣品進行實時熒光檢測,實現了對致病性大腸桿菌的定量檢測,對致病性大腸桿菌dsDNA的檢測限可達0.7 ng/μL[63]。同時,張道遠等[64]設計出一種高集成度的數字PCR-微流控芯片,該芯片實現了數字PCR芯片的小型化,便于攜帶,且進樣率高、樣品損耗少、成本較低,可以滿足一般實驗室的檢測需求。

LAMP與微流控技術結合,可優化LAMP的性能并縮短檢測時間,提高檢測效率、靈敏度和特異性。同時LAMP-微流控技術還可對病原菌進行高通量檢測與現場實時檢測,市場前景廣闊[65]。Xiang等開發了一種基于微流控芯片與LAMP結合的快速檢測方法,以檢測零食中11種常見的沙門氏菌血清型。該方法實現了對樣品的高通量檢測,且在40 min內可完成整個反應過程,檢測限可達102～103CFU/mL。結果顯示該方法的血清型檢測結果與傳統方法一致,可滿足有關部門對沙門氏菌監測的需求[66]。Luo等[67]建立了一種基于微流控芯片,并將LAMP和成簇規則間隔短回文重復序列(CRISPR)/Cas12a進行系統集成來檢測沙門氏菌的方法。該技術通過兩個微小的通道分別添加反應試劑,從而實現了在一個芯片上進行兩步反應,避免LAMP溶液轉移到CRISPR/Cas反應溶液時可能導致的氣溶膠污染和交叉污染的問題。同時,整個檢測過程可在50 min內完成,反應速度快,且對粗提的基因組DNA檢測限可達118 pg/μL,具有較高的靈敏度。

使用核酸-微流控芯片技術檢測食源性病原菌,成本低、集成度高、靈敏度高且特異性好,便于現場檢測,具有取代傳統檢測法的潛力。但作為近幾年興起的新技術,該方法還未被大范圍應用,且具有對儀器精密度要求高等局限性,未來將往更全面、精準且自動化的方向發展[68]。

2.4.2 肽核酸熒光原位雜交技術 熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技術是利用熒光標記核酸探針,通過探針與目標核酸的特異性雜交來激發熒光,產生熒光信號,從而對目標樣品進行鑒定的一種快速檢測方法[75-76]。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一種DNA類似物,與DNA探針相比,具有更高的親和力、穩定性和特異性,故而代替普通的核酸探針廣泛應用于單增李斯特菌和沙門氏菌等食源性病原菌的鑒定中[74-76]。Rocha等[77]建立了一種基于PNA-FISH技術來快速檢測食品中單增李斯特菌的方法,該方法使用已知PNA探針與一種新型阻斷劑探針以1∶2比例耦合替代原有的PNA探針,結果顯示該方法在不同的食品基質中對單增李斯特菌的檢測限可達0.5 CFU/mL(g),總體準確度為99%,特異性高、靈敏度強、準確度高,且使用離心法,在29 h內可完成整個檢測過程,檢測速度較傳統方法快。楊彤等[75]建立了一種液相PNA-FISH技術來檢測沙門氏菌,該方法的檢測限可達104CFU/mL,與傳統檢測方法相當,但該方法具有更好的特異性、準確性與重復性,并大大縮短了檢測時間,為沙門氏菌的檢測提供了一個快速且較可靠的新方案。

PNA-FISH技術法檢測食源性病原菌,可以提高檢測的特異性與準確度,并縮短檢測時間,但該技術需依賴熒光顯微鏡并使用PNA探針,價格昂貴,多用于實驗室的檢測,較難在整個行業中推廣[78]。故如何優化PNA-FISH技術,降低成本,使其廣泛應用到現場檢測之中,是該項研究的重中之重。

分子生物學檢測方法速度快,特異性強,靈敏度高,但多需要借助大型的檢測儀器,給現場檢測帶來不便。核酸-微流控芯片技術的出現,較好地解決了這個問題,其儀器依賴性較小,方便攜帶,且集成度高,為現場檢測與實時檢測帶來可能。

3 生物傳感器檢測類

3.1 電化學生物傳感器 生物傳感器主要由生物感受器和信號轉換器組成,可將信號識別、轉導、放大集于一體。生物傳感器基于細胞、組織、核酸、酶、抗體、抗原等物質來識別目標物質,并將其轉化為光、電、磁等其他信號輸出,從而完成對目標物質的定性與定量檢測[79]。電化學生物傳感器通過感受器識別目標物質時產生的電流、電位、電阻或電導的變化來對目標物質進行定量,具有靈敏度高、成本低、操作簡便、可實時分析、檢測速度快等優點,廣泛應用于食源性病原微生物的檢測之中[79]。

Nordin等[80]開發了一種電化學DNA生物傳感器,其使用聚乳酸穩定的金納米顆粒(PLA-AuNPs)來修飾電極,并利用DNA雜交來檢測副溶血性弧菌。該生物傳感器可以特異性區分不匹配的、非互補的和互補的核酸片段,且無明顯的交叉反應,具有較高的特異性和靈敏度。Saini等[81]基于碳納米纖維/金納米顆粒(CNF/AuNp)電極的電化學生物傳感器,首次使用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶基因(PlcA)作為核酸探針,來檢測牛奶樣品中的單增李斯特菌。該方法在30 min內可完成檢測,靈敏度為3 461(μA/cm2)/ng,檢測限可達82 fg/6 μL。

3.2 光學生物傳感器 光學生物傳感器通過接收生物受體與被標記的物質直接發光或在反應過程中產生顏色、化學發光、熒光等光學信號,并將其轉化為電信號,從而對目標物質進行定量檢測。此外,還有表面等離子體共振(SPR)和表面增強拉曼光譜等方法,通過反應過程中環境光學特性的變化來檢測目標物質,無需額外提供標記物。光學生物傳感器靈敏度高、檢測速度快、檢出率高,已廣泛應用于食源性病原菌的檢測之中,但其儀器昂貴,且檢測時易受環境的干擾,對環境要求較高[82-84]。

Zheng等[84]開發了一種基于多孔gold@platinum納米催化劑(Au@PtNCs)的光學生物傳感器,并與被動式三維微混合器結合來快速檢測鼠傷寒沙門氏菌。該方法使用磁分離技術,可在99 min內分離得到10%的目標菌,檢測限可達17 CFU/mL。Khateb等[85]基于局域表面等離子體共振(LSPR),開發了一種不需要標記物的光學生物傳感器。該方法無需預增菌步驟,只需2 min即可完成整個分析檢測過程,在牛奶中金黃色葡萄球菌的檢測限可達103CFU/mL。

3.3 質量生物傳感器 質量生物傳感器是基于共振現象,通過感應傳感器表面微小的質量變化對目標物質進行檢測,無需標記物的參與。根據換能器的不同可分為壓電生物傳感器和磁彈性生物傳感器。質量生物傳感器具有高靈敏度、快速、便捷等特點,但目前在食源性病原微生物的檢測方面應用不廣泛,具有較大的發展潛力[86]。

劉素芹等[87]設計了一種以壓電生物傳感器為基礎的自動化微生物檢測儀來檢測病原微生物。結果顯示用該方法檢測致病性大腸桿菌,檢測限可達到10 CFU/mL,與傳統平板分離法的準確度相當,但更為快速、便捷,靈敏度更高。Wang等[88]設計了一種基于噬菌體磁彈性生物傳感器來檢測菠菜中的沙門氏菌。對沙門氏菌富集7 h后進行檢測,檢出限可達100 CFU/25 g,檢測速度比美國食品藥品監督管理局BAM方法的檢測速度(24～26 h)快了3倍多。

生物傳感器法也是目前較新興的檢測方法,其可對目標病原菌進行實時定量分析,且具有較高的靈敏度,但由于其對儀器精密度的要求和對環境的要求較高,限制了其的廣泛應用。

4 結 語

目前,對食源性病原菌的檢測技術仍以傳統的分離鑒定方法為主,各種現代檢測技術共存[4]。傳統的平板培養分離鑒定法耗時長,不利于現場檢測,而新近發展的快速檢測技術耗時短,克服了這一缺點。但由于不同的現代檢測技術具有不同的優勢與局限性,還需進行進一步優化。如免疫學檢測方法利用抗原抗體反應對病原菌進行檢測,速度快、特異性強、靈敏度高,但其抗體制備復雜且重復性較差,與其他技術相結合開發出更靈敏、快捷的檢測方法,是將來研究的方向。

在分子生物學檢測方法中,mPCR可以實現快速多重檢測;qPCR則解決了普通PCR不能定量的問題;dPCR可對目標物質進行絕對定量,且準確度更高;基因芯片技術通過分子雜交原理,可對樣品進行定量分析及實現大批量樣品的同時檢測。隨著等溫擴增技術的興起,LAMP、RPA等技術均被運用到了食品中病原菌的檢測之中。這幾種方法均具有靈敏度高、特異性強、速度快等特點,但其操作復雜,且儀器試劑昂貴,需要專業的技術人員,給現場檢測帶來一定的困難。微流控技術的引入,則較好地解決了這個問題。將微流控芯片與核酸檢測技術結合,既可以對樣品實現較為快速的檢測,又避免依賴大型儀器,適合現場檢測。目前基于微流控芯片的檢測技術正處于前期研發階段,在將來會向更全面、精確、簡便且自動化的方向發展。

生物傳感器檢測技術具有結果可視化、功能多樣化、智能化的特點,檢測結果更加準確。但由于其儀器昂貴,且光學生物傳感器對環境的要求較高,故而在實際應用中仍需進一步研究完善。

食源性病原菌的現場檢測是有效監測和預防食源性疾病的關鍵環節,相信隨著科學技術的進一步發展,可建立更為準確、快速、便捷且性價比高的檢測方法,應用到現場檢測之中,以更好地預防病原菌的傳播與感染,保障廣大消費者的食品安全,推進改善民生福祉,助力健康中國行動計劃。

利益沖突：無

引用本文格式：俞佳,岑葉平,江玲麗,等.常見食源性病原菌的快速檢測技術研究進展[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):123-133. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.024