細菌外囊泡的研究進展

郭金榮,雍浩蕾,賀雅寧,李沐曉,王麗梅

細菌外囊泡(bacterial extracellular vesicles, BEVs)是由細菌分泌的、直徑為10～450 nm的球形雙層膜結構,其內攜帶有母源細菌來源的外膜蛋白、周質蛋白、肽聚糖、脂多糖、磷脂、DNA、RNA和毒性因子等物質,被認為是一種特殊形式的細菌分泌[1-2]。

1965年,研究人員在一株營養缺陷的大腸埃希菌的電子顯微鏡圖像中,首次觀察到BEVs的產生[3]。隨后幾十年,由于革蘭陽性(Gram-positive, G+)菌細胞壁較厚,被認為較難分泌BEVs,研究一直集中于革蘭陰性(Gram-negative, G-)菌的BEVs。直到2009年,Lee等[4]才從金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌的培養上清液中分離出G+菌的BEVs。隨后,在古細菌中也發現有BEVs。BEVs在細菌的發生和進化中扮演著重要的角色,而且與人的正常生理功能和疾病的發生發展也具有密切的關系。本文從BEVs在細菌的環境耐受、防御作用、信號交流、物質運輸以及細菌對宿主的免疫調節和發病機理等方面,對當前的BEVs研究進展進行了全面的綜述,為BEVs的相關研究提供有用參考。

1 BEVs的發生機制和結構組成

不同細菌來源的BEVs,其生物發生途徑不同,且具有不同的結構和組成。

1.1 G-菌的BEVs G-菌的BEVs主要通過兩種途徑生成,即通過細菌外膜(outer membrane, OM)的起泡生成或通過細菌裂解產生[5-6]。由此,G-菌的BEVs可分為由外膜起泡產生的外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)和外-內膜囊泡(outer-inner membrane vesicles, OIMVs),以及細菌裂解產生的外膜囊泡(explosive outer-membrane vesicles, EOMVs)和外-內膜囊泡(explosive outer-inner membrane vesicles, EOIMVs)。

1.1.1 OMVs和OIMVs OMVs為一種球形顆粒,由內外兩小葉構成。內小葉由磷脂組成,外小葉由脂多糖、外膜蛋白和膜出芽起泡過程中捕獲的周質蛋白組成[7]。OMVs是由于細菌外膜紊亂,如肽聚糖生物合成不平衡導致細菌OM與肽聚糖間的交聯減少,周質間隙中錯誤折疊蛋白質或包膜成分的積累,脂多糖分子之間的陰離子電荷排斥以及疏水分子嵌入OM等因素,引起OMVs的產生[5,7]。所以,OMVs富含周質蛋白、外膜蛋白和OM特定的脂質。然而,OMVs隨著細菌生長階段和條件的不同,其攜帶的成分和含量也存在差異[8-9]。

OIMVs的發生是由于細菌自溶酶降解肽聚糖層后,細菌內膜突出到周質間隙,伴隨胞質內容物進入囊泡并最終與周圍的OM一起被擠壓出去,從而產生OIMVs[10]。OIMVs包含DNA、RNA和ATP等細胞質成分。不同細菌產生的OIMVs含量,在細菌分泌產生的總BEVs含量中所占的比例差異較大。如研究發現,囊狀希瓦氏菌M7產生的OIMVs只占其總BEVs的大約0.1%,而海假交替單胞菌產生的OIMVs占其總BEVs的49%左右[11-12]。

1.1.2 EOMVs和EOIMVs 這兩種BEVs的生物發生機制是由于細菌DNA損傷應激,誘導前噬菌體來源的內溶素表達,從而降解細菌肽聚糖層并破壞細胞壁,從而導致細菌爆炸,出現膜碎片聚集并自組裝形成EOMVs和EOIMVs[13-14]。EOMVs和EOIMVs也含有細菌細胞質成分和基因組DNA。研究發現,囊狀希瓦氏菌M7在生長指數后期到穩定期階段,會產生EOMVs和EOIMVs,而且其EOIMVs通常具有不同尋常的結構,如在一個較大的囊泡內有多個囊泡或不規則形狀的內囊泡[15]。

1.2 G+菌的BEVs 研究證實,G+菌在不同條件和自然環境下都會產生BEVs,大小在10～450 nm之間。G+菌的BEVs的發生機制類似于G-菌通過發生裂解產生BEVs的機制,是由缺陷前噬菌體編碼的內溶素降解肽聚糖層,破壞細胞壁,導致菌體發生腫脹,細胞膜包裹的細胞質內容物向外膨出而形成。所以,G+菌的BEVs,又常被稱為細胞質膜囊泡(cytoplasmic membrance vesicles, CMVs)[16]。由于G+菌在此過程中并未完全解體,但細胞質膜完整性的喪失可導致部分細菌死亡,因此這一機制又被稱為“起泡細胞死亡”。

1.3 特殊類型的BEVs 管狀膜結構(tube-shaped membranous structures, TSMSs)是一種特殊類型的BEVs,又被稱為納米管、納米絲或納米顆粒。目前對于TSMSs的形成機制尚不完全明確,一般認為TSMSs是由G-菌的OM或G+菌細胞質膜的管狀突起而形成。結構最簡單的TSMSs是由OMVs串聯而形成[5]。部分細菌還可將串聯的OMVs進一步融合形成納米管結構,如土拉弗朗西斯菌可在液體介質中產生OMVs和TSMSs。OMVs與TSMSs之間還可以相互轉化,OMVs能夠串聯融合形成納米管,而納米管也可分解形成OMVs[17]。

2 BEVs的生物學功能

BEVs是細菌的一種特殊形式分泌[1-2],在細菌的自身調節和細菌—細菌之間相互作用中發揮著重要功能。但由于不同來源的BEVs含有的內容物不同,因而也發揮著不同的生物學功能。

2.1 攝取營養物質 BEVs內含有水解酶,可催化降解環境中存在的蛋白質和復合多糖,幫助細菌攝取營養物質[18]。此外,BEVs中還具有鐵載體、鋅載體、氨基酸和脂肪酸轉運系統等,從而促進細菌對相關營養物質的攝取。如結核分枝桿菌分泌的BEVs攜帶分枝菌素,可幫助結核分枝桿菌遠距離獲取宿主中的鐵成分,促進結核分枝桿菌的生長[19]。

2.2 防御作用 BEVs可通過環境耐受、抑制抗生素的殺菌作用、拮抗噬菌體的作用等多種機制增強細菌對外界環境的防御能力。其一,在應激情況下,細菌可以通過調節BEVs的產量和內容物,以此緩解由錯誤折疊蛋白、肽聚糖片段或脂多糖在周質間隙積累而引起的膜應激反應[20]。如溫度過高會導致蛋白質變性,從而引起細菌外膜流動性增加,BEVs的分泌也隨之增加[21]。鐵缺乏、氧化應激、酒精和鹽等環境刺激也均會影響BEVs的分泌[22]。其二,BEVs來源于細菌膜成分,可以保護細菌免受某些抗生素的侵害。研究證實,在抗生素環境中,分泌BEVs的細菌比不分泌的細菌存活時間更長。BEVs可通過結合、降解和排放等途徑作用進入菌體中的抗生素,從而提高細菌對抗生素的防御力。如流感嗜血桿菌分泌的含β-內酰胺酶的BEVs,能夠水解阿莫西林,保護A組鏈球菌免受阿莫西林的殺菌作用[23]。當鮑曼不動桿菌處于亞抑菌濃度的左氧氟沙星環境時,可以通過高外排泵的表達和BEVs的分泌,排出大量負載的抗生素囊泡,從而阻止抗生素的殺菌作用[24]。BEVs也可通過包裹的耐藥質粒,將抗生素抗性基因水平傳遞到其他細菌,從而增強細菌對抗生素的殺傷作用。如鮑氏不動桿菌可通過OMVs將β-內酰胺酶基因blaOXA-24傳遞給其陰性株,而使其獲得青霉素和頭孢類抗生素的抗性[25],從而增強鮑氏不動桿菌群落細菌對抗生素的抵抗力。其三,BEVs既可作為靶標吸引噬菌體的攻擊,又可作為將噬菌體傳遞給其他細菌的載體,進而擴大噬菌體的感染范圍[26]。如大腸埃希菌BEVs可結合并滅活大腸埃希菌特異性T4噬菌體,從而降低環境中噬菌體的細菌感染率[27]。

2.3 信號交流 BEVs可參與生物被膜的形成:細菌釋放BEVs時,可導致細胞表面疏水性的增加,從而增強生物膜的形成,同時BEVs也可作為細胞外DNA的成核位點或者通過提供有益的蛋白如血紅素利用蛋白HmuY,促進生物膜的形成[28]。研究發現,幽門螺桿菌可被其分泌的BEVs誘導形成生物被膜,但具體機制尚不清楚。變異鏈球菌分泌的BEVs不僅可促進其自身生物被膜的形成,而且還有利于白色念珠菌生物被膜的形成[29]。BEVs可傳遞、釋放毒力因子:G-菌分泌的BEVs中包含的大部分蛋白為酶、分子伴侶、毒力相關蛋白等毒力因子,且這些毒力因子在BEVs中的半衰期延長,因此BEVs在毒力因子的傳遞釋放中具有重要作用。研究表明,銅綠假單胞菌分泌的BEVs通過與宿主質膜中的脂筏融合,可直接將β-內酰胺酶、堿性磷酸酶、溶血磷脂酶C等多種毒力因子傳遞到宿主細胞質內,影響宿主細胞的生物學功能,從而避免病原體和宿主細胞直接相互作用引起的細胞毒性作用[30]。此外,腸出血性大腸埃希菌分泌的BEVs,其包裹的溶血素比游離的溶血素更穩定,前者半衰期長達20 h,而后者半衰期僅15 min[31]。BEVs可提高細菌群體競爭力:群體感應是一種細菌間通訊機制,允許細菌相互交流,是許多病原菌毒力的重要驅動力[32]。BEVs內所含的特異性酶能夠區分自身菌和非自身菌,進而靶向根除非自身菌,提高自身菌在環境中的競爭力。如銅綠假單胞菌分泌的BEVs通過遞送細胞壁蛋白水解酶降解肽聚糖而殺死競爭性細菌;嗜酸乳桿菌BEVs內的細菌素可使德氏乳桿菌和大腸埃希菌的生長受到抑制[33]。此外,共生菌特別是腸道微生物群可對宿主腸道進行免疫調節,共生菌分泌的BEVs可以殺死競爭細菌,影響競爭細菌產生細菌素,改善腸上皮屏障的功能,保護生態位,促進宿主免疫調節,從而為其親本細菌提供選擇優勢[34]。另外還有研究發現,在同一生態空間中的競爭性細菌還可分泌抗生素到BEVs內,選擇性地殺傷其他種屬的細菌。部分細菌可將糖苷酶和蛋白水解酶通過BEVs傳遞給競爭細菌,將其殺滅以獲取更多的營養物質[35]。

3 BEVs對宿主細胞的調節

BEVs能夠介導細菌和宿主細胞之間的相互作用,參與調節宿主細胞的功能,進而導致細菌感染性疾病的發生和發展。目前對BEVs調節宿主細胞功能的研究主要集中于免疫調節、介導細胞死亡和誘導腫瘤發生等過程。

3.1 調節宿主細胞免疫功能 由于BEVs的特殊發生機制,通常會攜帶有病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)[36]。PAMPs可被宿主細胞的模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)所識別,從而誘導宿主細胞免疫反應。如BEVs含有的脂多糖和脂寡糖能夠被TLR4所識別,肽聚糖能夠被核苷酸寡聚化結構域(Nucleotide-binding oligomerization domain, NOD)蛋白1 (NOD1)和2 (NOD2)受體識別,從而激活NF-κB通路,介導促炎反應。BEVs含有的RNA可被宿主細胞的TLR7/TLR8所識別,激活NF-κB信號通路,促進IFN-β、IFN-γ、TNF-α和IL-12等細胞因子的分泌[37-39]。另外,BEVs還可通過PAMPs激活宿主細胞的NLRP3、NLRC4和AIM2等炎癥小體,從而誘導宿主細胞的炎癥反應[40]。

BEVs還可誘發宿主細胞產生超敏反應,或者誘導免疫逃逸。Krisana A等[41]研究發現,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分泌的BEVs能夠刺激小鼠體內IL-4、IL-5、IL-6等Th2相關細胞因子的產生,并導致小鼠發生過敏性休克,這表明BEVs可引發IgE介導的全身性超敏反應。鼠傷寒沙門菌分泌的BEVs攜帶PagC蛋白,可通過募集補體抑制因子H使C3b失活,從而逃避補體介導的殺傷[42]。

3.2 誘導宿主細胞死亡 BEVs可通過觸發炎癥小體的形成,激活焦亡效應分子GSDMD,從而導致細胞焦亡[43-44]。腸出血性大腸埃希菌分泌的BEVs可通過內吞作用進入宿主細胞,其表面的脂多糖能夠與宿主細胞胞質內的caspase-11結合,從而直接激活GSDMD,活化的GSDMD可在宿主細胞膜上成孔,促進IL-1β和IL-18的分泌,導致宿主細胞焦亡[45]。BEVs也可通過直接影響線粒體的完整性或釋放毒力因子以及減少促生存蛋白的合成等途徑來誘導細胞凋亡[46]。研究發現,當鮑曼不動桿菌分泌的BEVs被宿主細胞內化后,其內的OmpA和Omp38可特異性地定位于線粒體,損害線粒體膜完整性,從而導致宿主細胞凋亡[47]。淋病奈瑟菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌分泌的BEVs能以非特異性的方式降低線粒體膜電位,并通過激活BAX和BAK蛋白、減少促生存蛋白BCL-2的合成來激活細胞凋亡[48]。

3.3 誘導腫瘤的發生 細菌在腫瘤的發生發展中如何發揮作用是目前研究的一個方向,但其作用機制還不完全清楚。目前越來越多的研究發現,BEVs傳遞的毒力因子能夠誘導癌細胞系基因組的損傷。例如,Kim DJ等[49]發現,糞腸球菌和大腸埃希菌分泌的BEVs可能含有外毒素,且可以產生靶向宿主細胞DNA的自由基,導致宿主細胞染色體不穩定,從而促進腫瘤的發生。TurkinaMV等[50]發現,幽門螺桿菌分泌的BEVs攜帶CagA蛋白,可增加ATP對染色體中H1組蛋白的親和力,導致基因組損傷,誘導腫瘤的發生。另外,BEVs攜帶的msRNA和sRNA可抑制宿主細胞mRNA的轉錄和翻譯,或促進mRNA衰減,從而參與宿主細胞腫瘤微環境的調節[51]。

4 展 望

BEVs作為細菌的一種特殊分泌形式,其在細菌自身的調節、細菌-細菌之間和細菌-宿主細胞之間相互作用中,均發揮著重要的功能。因此,目前在研究BEVs生物發生機制和生物學功能的基礎上,對于BEVs在細菌致病機制中的作用研究也越來越受到重視,成為BEVs研究的一個重要方向。此外,由于BEVs具有特殊的結構和物質組成,將BEVs作為新型疫苗和藥物遞送載體以及佐劑等的研究也正成為BEVs研究的一個新熱點。相信隨著對BEVs的不斷探索,未來我們將對細菌的生長、進化和環境耐受等方面會有更深的認知,對細菌的致病機制和耐藥性等方面也會不斷有新的發現,而且隨著對BEVs臨床應用的探索,也將加快疫苗和藥物載體的研發。BEVs的研究將為生命科學和醫學的發展開辟一個全新的方向。

利益沖突：無

引用本文格式：郭金榮,雍浩蕾,賀雅寧,等.細菌外囊泡的研究進展[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):191-196. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.023