檢測棘球蚴病患者血清內循環抗原的免疫層析試條的制備和評價

張 璟,王 穎,高春花,危芙蓉,賈孝凱,石 鋒

棘球蚴病又稱包蟲病,是由棘球絳蟲的幼蟲寄生所致的人獸共患的傳染性疾病。我國西部是世界上棘球蚴病患病率最高的地區,主要流行兩種棘球蚴病,即細粒棘球蚴病(Cystic echinococcosis, CE,又稱囊型包蟲病)和多房棘球蚴病(Alveolar echinococcosis, AE,又稱泡型包蟲病)。包蟲病是當前我國疾病負擔最嚴重的寄生蟲病[1-3],快速準確的診斷方法對于棘球蚴病的有效控制具有重要意義。迄今,已有多種基于檢測循環抗體的棘球蚴病診斷產品問世并在實驗室和現場使用,但檢測循環抗體無法區分既往感染和現癥感染,不利于病人的早期診斷和流行病控制策略的及時制定和實施[4-6]。有研究表明,棘球蚴純化包囊液粗抗原(Hydatid cyst fluid, HCF)檢測包蟲病的效能較高[7]。本研究制備了純化包囊液粗抗原的特異性單克隆抗體,研制了以雙抗夾心的抗原捕獲法為基礎的快速診斷包蟲病的膠體金免疫層析試條,并對其檢測效果進行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 1640培養基購自美國Invitrogen公司;新生小牛血清購自杭州四季青工程材料有限公司;HRP標記羊抗小鼠IgG購自生工生物工程有限公司;小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自洛陽佰奧通實驗材料中心;G蛋白層析柱購自美國Thermofisher公司;羊抗小鼠IgG購自英國Cohesion Bio公司;硝酸纖維素膜(CN140)、交聯釋放墊(8964)、吸水墊(H5072)和樣品墊(GRADE2)由上海杰一生物技術有限公司提供;氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)(滬試牌)購自上海國藥集團化學試劑有限公司;XZ1000型噴膜機、CM4000型切條機為美國Bio-Dot公司產品。

1.2 血清樣品 確診棘球蚴病患者血清127份,其中細粒棘球蚴病患者血清87份,多房棘球蚴病患者血清40份,囊尾蚴病病人血清25份、日本血吸蟲病患者血清10份,弓形蟲病、并殖吸蟲病和華支睪吸蟲病患者血清各5份,健康人血清60份,由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所(國家熱帶病研究中心)和新疆維吾爾自治區疾病預防控制中心提供。本研究獲得中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所(國家熱帶病研究中心)倫理審查委員會批準,并取得受試者的知情同意。

1.3 純化HCF的制備 按參考文獻[8]進行。取新鮮羊肝包囊液,以1 000×g離心30 min除去沉淀,上清液裝入透析袋,對pH5.0的5 mmol/L乙酸緩沖液于4 ℃下透析;回收透析液50 000×g離心30 min,除去上清白蛋白;沉淀用pH8.0的200 mmol/L的PBS溶解,加飽和硫酸銨至40%,18 000×g離心30 min除去沉淀球蛋白,即得純化囊液粗抗原。

1.4 單克隆抗體的制備與初步分析

1.4.1 免疫 按文獻[9]方法,免疫BALB/c小鼠,每只首次腹腔注射250 μL(約100 μg)純化的囊液粗抗原與250 μL福氏完全佐劑的混懸液,之后第30 d、60 d各注射50 μg純化的囊液粗抗原與福氏不完全佐劑的混懸液1次,第90 d經尾靜脈直接注射50 μg抗原加強免疫1次,第93 d取免疫小鼠的脾臟進行細胞融合。

1.4.2 雜交瘤細胞的產生與篩選 按本實驗室常規方法進行SP2/0瘤細胞與免疫小鼠脾細胞的融合及雜交瘤細胞的克隆[9]。對雜交瘤細胞培養上清進行抗原ELISA檢測抗體分泌,收集對純化的囊液粗抗原反應的克隆。

1.4.3 單克隆抗體(McAb)免疫球蛋白亞類鑒定 按照小鼠單克隆抗體亞類鑒定試劑盒的說明書分別與羊抗鼠IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3進行反應以鑒定McAb免疫球蛋白亞類。

1.4.4 腹水制備與效價測定 將收集的雜交瘤細胞接種BALB/c小鼠,每只BALB/c小鼠腹腔注射5×106雜交瘤細胞,1周左右觀察小鼠的精神狀態和腹水量,并及時收取腹水,用常規ELISA法確定腹水效價。

1.5 單克隆抗體的配對和免疫層析試條的制備 采用G蛋白層析柱按其產品說明書純化單克隆抗體。參照文獻[10-11]用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金并用膠體金標記單克隆抗體。純化的單克隆抗體分別作標記抗體和包被抗體,與其他抗體進行配對,篩選檢測敏感性和特異性均佳的抗體對用于制備試條。將篩選得到的單克隆抗體和羊抗鼠IgG分別噴涂在NC膜上適當位置形成檢測線和質控線制成試條。

1.6 免疫層析試條檢測條件的選取 將適量樣本血清加在樣品墊上,然后滴加適量樣本稀釋液,適時觀察并記錄檢測結果。

1.7 試條性能的評價 用制備的試條對上述包蟲病患者血清、其他寄生蟲病患者血清和健康者血清采取單盲法檢測。檢測結束后將試條檢測結果與病原學方法檢測結果進行比較,統計試條檢測的敏感性和特異性。分別制備3批試條對同樣的血清進行重復檢測。

1.8 統計學分析 采用SPSS 11.0 軟件對試條檢測囊型和泡型包蟲病結果進行χ2檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 羊棘球蚴囊液抗原的純化 將從我國新疆流行區收集的羊肝棘球蚴囊液離心后去除原頭節,上清液經透析和飽和硫酸銨沉淀后除去白蛋白和球蛋白,即得純化囊液粗抗原(圖1)。

注:M.標準蛋白分子量;1.純化前羊細粒棘球蚴囊液;2.純化中間產物;3.分離的雜蛋白;4.純化后的羊細粒棘球蚴囊液抗原

2.2 單克隆抗體的制備與初步鑒定 以純化羊細粒棘球蚴囊液免疫小鼠,取免疫小鼠的脾細胞與SP2/0瘤細胞融合,經篩選獲得11株高效分泌針對重組蛋白單克隆抗體的雜交瘤, 用雜交瘤培養上清對相應的單克隆抗體的亞類進行了鑒定(表1) ,將這些雜交瘤接種小鼠腹腔均獲得了含高效價單克隆抗體的腹水(表1) 。

表1 單克隆抗體特性

2.3 單克隆抗體配對和試條的制備 制備的11株單克隆抗體分別作為包被抗體和標記抗體進行配對實驗, 經比較選擇單克隆抗體F3B6標記膠體金作為檢測抗體, 選擇C4H6作包被抗體, 檢測效果最佳。檢測線上的C4H6單克隆抗體工作濃度為1.2 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;質控線羊抗鼠IgG工作濃度為1.0 mg/mL,噴涂量為1 μL/cm;膠體金標記探針F3B6單克隆抗體的工作濃度(以蛋白濃度計):20 μg/mL,噴涂量為40 μL/cm。

2.4 試條的檢測條件 每次檢測取5 μL血清,滴加在試條底部樣品墊上,再緩慢滴加3滴(120～200 μL)樣本稀釋液。檢測線和質控線出現紅色條帶,不論強弱即判為陽性;若僅有質控線顯色判為陰性(圖2)。檢測結果均在15 min 內判斷。

注:1-10.陽性樣本檢測結果;11-20.陰性樣本檢測結果

2.5 試條法檢測結果 分別用3批制備的試條對包蟲病患者血清、其他寄生蟲病患者血清和健康者血清進行檢測,批次間檢測結果完全符合。用研制的試條檢測127份棘球蚴病患者血清的敏感性為88.12%(112/127),其中試條檢測囊型包蟲病患者血清的敏感性為88.51%(77/87),檢測泡型包蟲病患者血清的敏感性為87.5%(35/40),試條法檢測兩型包蟲病患者血清敏感性之間差異無統計學意義(χ2=0.03,P=0.86)。與25份囊尾蚴病患者血清、10份日本血吸蟲病患者血清、5份弓形蟲病患者血清、5份并殖吸蟲病患者血清和5份華支睪吸蟲病患者血清均無交叉反應,60份健康者血清也均為陰性,總特異性為100.00%(表2)。

表2 試條法檢測寄生蟲病患者和健康人血清

3 討 論

目前,對包蟲病的診斷主要依賴影像學方法[12],由于該方法不能進行早期診斷,易造成患者錯過最佳藥物治療期,同時該方法需要使用儀器,對技術要求高,不適合于大規模防治的需要。免疫學診斷方法具有敏感特異的特點,目前應用的檢測包蟲病方法均基于檢測特異抗體,其檢測效能極大地依賴所應用的抗原。本課題組用ELISA方法評價了細粒棘球蚴純化囊液粗抗原、天然抗原B(nAgB)及其3個重組亞基(rAgB8/1、rAgB8/2和rAgB8/3)檢測囊型包蟲病的效能,結果顯示天然抗原應用ELISA法檢測囊型包蟲病的效能總體優于重組抗原[7],并以細粒棘球蚴包囊液純化抗原(檢測CE)和EM18重組蛋白(檢測AE)分別作為包被抗原,以抗IgG抗體標記膠體金作為檢測試劑,研制出了能夠區分檢測兩型包蟲病特異抗體的免疫層析試條。該試條檢測包蟲病的敏感性和特異性均達到90%以上[6,13],但囊液抗原存在不易標準化,與其他寄生蟲病患者血清存在不同程度的交叉反應的問題[7]。另外,由于抗體在包蟲病患者治療后仍可長時間存在,不能區分既往感染和當前感染,而檢測宿主體液中的循環抗原則可準確地判斷宿主體內有無棘球蚴存在,為確定原發、繼發、再感染及療效考核提供依據。已有不同作者應用單克隆抗體夾心ELISA[14]、dot-ELISA[15]和免疫金銀法[16]檢測棘球蚴病患者血清中的循環抗原的報道,但由于循環抗原在血清中含量甚微和檢測方法的限制,陽性率低,不適合現場應用。

本研究制備棘球蚴囊液純化抗原特異性單克隆抗體,以此單克隆抗體為基礎研制的膠體金免疫層析試條,用以檢測人棘球蚴病血清中的循環抗原敏感性為88.51%(77/87),檢測其他寄生蟲病患者血清和健康人血清也表現出很好的特異性,高達100%,檢測囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清敏感性之間差異無統計學意義(χ2=0.03,P=0.86)。該試條具有操作快速、簡便,無需任何儀器和設備;性能穩定,重復性好,結果判斷客觀,樣品無需冷藏等優點,特別適合現場應用。

本研究篩選到的單克隆抗體F3B6和C4H6對囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清均有反應,以此制備的試條不能區分兩型包蟲病。進一步篩選出針對細粒棘球蚴或多房棘球蚴抗原的特異性單克隆抗體,以此制備可區分檢測囊型包蟲病和泡型包蟲病患者血清循環抗原的膠體金免疫層析試條是今后的研究方向。

利益沖突：無

引用本文格式：張璟,王穎,高春花,等.檢測棘球蚴病患者血清內循環抗原的免疫層析試條的制備和評價[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):166-170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.021