雙膦酸鹽抗三種頂復門原蟲研究進展

侯文燕,張營營,張龍現,張素梅

1 三種頂復門原蟲防控現狀

1.1 瘧原蟲 頂復門原蟲可引起一系列嚴重的人類和動物疾病。例如,廣泛流行于熱帶地區和亞熱帶地區的瘧疾(Malaria)是人類最致命的寄生蟲病之一,每年有超過 2.5 億病例。瘧疾感染是兒童死亡的主要原因之一,每年有近 100 萬人感染死亡[1-2]。現有的治療藥物氯喹的耐藥開始出現后,磺胺多辛-乙胺嘧啶、奎寧等也相繼出現廣泛耐藥性,嚴重限制了瘧疾的預防和治療工作,并且目前在東南亞地區,瘧原蟲(Plasmodium)對青蒿素的敏感性已經開始降低[3],因此迫切需要新的抗瘧疾藥物。

1.2 弓形蟲 弓形蟲病(Toxoplasmosis)由剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)感染所致,呈全球性分布,弓形蟲可感染包括人類在內的幾乎所有溫血動物,人類感染通常無癥狀,但當宿主進行器官移植、癌癥化療或感染艾滋病毒等免疫力低下時可重新復發[4]。人類在懷孕期間發生弓形蟲急性感染時,速殖子可能會感染胎兒,導致嚴重的出生缺陷或造成流產[5]。在2022年關于重慶市犬和貓的弓形蟲感染和流行病調查結果顯示弓形蟲感染率分別為20.2%和6.6%。隨著動物飼養量上升,相關數據顯示:全球約1/3人口的弓形蟲血清抗體為陽性[6-7]。目前臨床上治療弓形蟲病的標準方法為磺胺嘧啶與乙胺嘧啶聯用,其他常用藥物如阿奇霉素、克拉霉素、阿托伐醌和氨苯砜等,雖有一定療效但存在毒副作用大、耐受性差等缺點,并且目前已有一些蟲株產生了耐藥性[8]。

1.3 隱孢子蟲 隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)是由隱孢子蟲(Cryptosporidium.spp)引起的一種呈世界性流行分布的人獸共患腸道寄生蟲病,是引起5歲以下兒童腹瀉死亡的主要因素。在美國,早先估計每年有748 000例隱孢子蟲病病例[9-10],隱孢子蟲感染后免疫正常個體會引發自限性水樣腹瀉,但在免疫功能低下或缺陷的個體可能發生嚴重腹瀉甚至死亡[11]。1986年,世界衛生組織將人的隱孢子蟲病列為艾滋病的懷疑指標之一[12]。最常見的隱孢子蟲病治療藥物有硝唑尼特和抗生素巴龍霉素,前者被美國FDA批準用于健康成人和 1 歲以上兒童,但這些藥物并非對所有人群全部有效[13-15]。

目前針對頂復門原蟲感染的治療藥物十分有限,現有的抗寄生蟲藥物多半臨床應用較復雜、整體效力差、毒副作用較大,鑒于這些寄生蟲具有巨大的基因組可塑性,出現耐藥性的機率較大。因此,迫切需要研發新的抗寄生蟲藥物。雙膦酸鹽類(bisphosphates,BPs)藥物在近幾十年臨床上用來預防和治療骨質疏松癥、佩吉特病(Paget’s病)、高鈣血癥、腫瘤骨轉移等骨代謝疾病。相關研究發現,雙膦酸鹽類還具有抗金黃色葡萄球菌等細菌病原體以及寄生原蟲如瘧原蟲、弓形蟲、錐蟲和利什曼原蟲等功效[16],有望發掘成為新型抗寄生原蟲藥物。

2 雙膦酸鹽化合物結構特征

雙膦酸鹽化合物的主要結構為兩個磷酸酯基團與一個中心碳原子結合(P-C-P),除此之外雙基碳上還含有R1、R2兩個取代基,當R1為羥基時可增強其與羥基磷灰石的結合能力,R2則決定雙膦酸鹽的功效[17](如圖1A所示);根據其化學結構的不同可分為兩類:含氮和非含氮雙磷酸鹽[18]。含氮雙膦酸鹽抗骨吸收效果與非含氮雙磷酸鹽相比可擴大100至20 000倍[19-20]。焦磷酸鹽是類異戊二烯合成途徑中關鍵酶法尼基焦磷酸合酶(FPPS)的合成底物,法尼基焦磷酸合酶是生物體必不可少的類異戊二烯合成通路中重要的幾種酶之一,對病原體的生長發育至關重要。但焦磷酸鹽(如圖1B所示)在體內易被相關酶水解,雙膦酸鹽是代謝穩定的焦磷酸鹽類似物,且雙膦酸鹽的P-C-P較焦磷酸鹽的P-O-P更穩定,能增加其對酶的抗性,因而雙膦酸鹽能夠競爭性抑制生物體中法尼基焦磷酸合酶進而抑制病原體的生長。

注:A.雙膦酸鹽化學結構式; B.焦磷酸鹽化學結構式

3 雙膦酸鹽化合物抗頂復門原蟲作用機理

3.1 類異戊二烯類物質合成途徑 類異戊二烯類化合物有約55 000多種分子[21],由多種脂類組成,參與生物體各種重要基本代謝,如:光合作用、呼吸作用、細胞壁生物合成、蛋白質翻譯后修飾和信號轉導等,同時還控制細胞壁、泛醌和色素等對病原體生存至關重要物質的合成[22]。類異戊二烯分子的生物合成途徑分為兩種,分別以其關鍵中間體命名:甲羥戊酸通路(mevalonate pathway,MVA通路)和 2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2C-methy1-D-erythri-to1-4-phosphate pathway,MEP途徑),MEP途徑也稱為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸途徑(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate pathway,DOXP途徑)。MVA途徑存在于動物、植物和真菌在內的高等復雜生物體中,也存在一些古細菌中;而大多數細菌、藻類、高等植物等生物都利用MEP途徑,如幽門螺桿菌、沙門氏菌、結核分枝桿菌、弓形蟲、瘧原蟲等。MEP途徑是重要病原體合成類異戊二烯化合物的唯一來源,且哺乳動物中不存在該途徑,因此MEP途徑可作為頂復門原蟲的選擇性藥物靶點[22]。法尼基焦磷酸合酶作為頂復門原蟲中MEP途徑合成類異戊二烯類物質中的關鍵分子即為雙膦酸鹽的選擇性靶點。

3.2 雙膦酸鹽抗頂復門原蟲機制 盡管類異戊二烯化合物種類眾多、結構和功能多樣,但幾乎所有類異戊二烯化合物均源于共同的兩個五碳結構單位焦磷酸——異戊二烯基焦磷酸(IPP)及其異構體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。在頂復門原蟲中,除了隱孢子蟲外[23],幾乎所有頂復門原蟲都依賴于頂質體中的MEP途徑合成和輸出IPP和DMAPP(如圖3所示)。MEP途徑起始產物為丙酮酸和3-磷酸甘油醛,二者通過1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(DXR)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶(CMS/IspD/YgbP)、4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇激酶(CMK/IspE/YchB)、2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸合成酶(MCS/IspF/YgbB)、(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶(HDS/IspG/GcpE)等多種酶的催化,經過一系列生化反應形成HMBPP,而后HMBPP經 HMBPP還原酶(HDR/IspH/LytB)以5∶1的比例同時合成IPP和DMAPP,IPP和DMAPP為類異戊二烯化合物合成的起始分子[24],至此,MEP途徑在頂質體內的反應完成。

注: Pyruvate:丙酮酸;GA-3P:3-磷酸甘油醛;DXS:1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶;DOXP:1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸;DXR: 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶;MEP:2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸;CMS/IspD/YgbP:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶;CDP-ME:4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇;CMK/IspE/YchB:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇激酶;CDP-MEP:4-二磷酸胞苷基-2-甲基-D-赤藻糖醇-2-磷酸;MCS/ IspF/YgbB:2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸合成酶;ME-cPP:2-C-甲基-D-赤藻糖醇-2,4-環二磷酸;HDS/IspG/GcpE:(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸合成酶;HMBPP:(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸;IspH:(E)-4-羥基-3-甲基-2-丁烯基-焦磷酸還原酶;IPP:異戊烯基焦磷酸;DMAPP:二甲基烯丙基焦磷酸;IPI:異戊烯基焦磷酸異構酶;FPPS:法尼基焦磷酸合酶;BPs:雙膦酸鹽;GPP:牻牛兒基焦磷酸;FPP:法尼基焦磷酸;GGPPS:牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合酶;GGPP:牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸;PFT:蛋白質法尼基轉移酶;PGGT:蛋白質牻牛兒基轉移酶;Ubiquinones:泛醌;Heme A:血紅素A;Sterols:甾醇;Dolichols:多萜醇;Prenylated proteins:戊烯基化蛋白質。

IPP和DMAPP輸出頂復門原蟲頂質體外需進行一系列酶促反應才能形成生物體必需的多種類異戊二烯化合物,IPP和DMAPP是頂復門原蟲中存在的類異戊二烯合成途徑關鍵酶法尼基焦磷酸合酶合成底物(如圖3虛線框所示)。與其宿主不同,在瘧原蟲中的關鍵酶為瘧原蟲法尼基焦磷酸合酶[25];在弓形蟲中為弓形蟲法尼基焦磷酸合酶或弓形蟲香葉兒基香葉兒基焦磷酸合酶(GGPPS)[26]。而隱孢子蟲在進化過程中失去了頂質體[27],尚不清楚獲得IPP和DMAPP的具體途徑,盡管如此,在隱孢子蟲基因組中發現了三種戊烯基合成酶,這表明隱孢子蟲可以獲得類異戊二烯前體,IPP、牻牛兒基焦磷酸(GPP)、法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)這些前體物質可在隱孢子蟲非特異性聚異戊二烯焦磷酸合酶(NPPPS)作用下生成類異戊二烯物質,非特異性聚異戊二烯焦磷酸合酶即為隱孢子蟲類異戊二烯合成途徑中的關鍵酶,并可被含氮雙膦酸鹽有效抑制[28]。

綜上所述,上述三種頂復門原蟲類異戊二烯合成途徑均存在法尼基焦磷酸合酶或非特異性聚異戊二烯焦磷酸合酶等關鍵酶,因雙膦酸鹽結構與該關鍵酶底物焦磷酸鹽相似,所以雙膦酸鹽可競爭性抑制頂復門原蟲類異戊二烯合成途徑關鍵酶的活性,從而影響寄生蟲生存必需的類異戊二烯物質,如泛醌、血紅素a、甾醇、多萜醇和戊烯基化蛋白質等的合成以及生物體的生長和能量產生、胞內信號傳導和膜結構支持等生命活動。

4 雙膦酸鹽化合物抗三種頂復門原蟲研究進展

在頂復門原蟲合成類異戊二烯物質過程中,有多個具有單一功能或者非單一功能的酶參與催化反應。其中任何一種酶的功能被抑制均能干擾MEP途徑合成類異戊二烯物質,因此,在該途徑中針對關鍵酶可開發對應的抑制劑,提供多種潛在的抗頂復門原蟲靶點。Beek等[29]通過使用C14標記甲羥戊酸、異戊烯基焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷,證明了法尼基焦磷酸合酶是含氮雙膦酸鹽的細胞內靶標:如含氮雙膦酸鹽帕米磷酸鈉、阿倫磷酸鈉和利塞膦酸鹽均被證明能有效抑制法尼基焦磷酸合酶[30-31],Moreno等[32]利用31P NMR 共振技術檢測出瘧原蟲、弓形蟲和微小隱孢子蟲等頂復門原蟲體內均存在大量縮合的無機磷酸鹽,除隱孢子蟲無頂質體外,瘧原蟲和弓形蟲體內的無機磷酸鹽均存在于其頂質體內,且該三種寄生蟲的生長均可能受到雙膦酸鹽的抑制。另外,Van等[29]通過使用14C同位素標記甲羥戊酸、IPP和DMAPP,證實法尼基焦磷酸合酶是雙膦酸鹽的靶標。這充分證明了雙膦酸鹽能夠利用其結構優勢競爭性抑制頂復門原蟲體內的法尼基焦磷酸合酶從而抑制其生長。

4.1 雙膦酸鹽化合物抗瘧原蟲研究進展 瘧疾是由瘧原蟲傳播引起的影響全球人類健康的蟲媒病,目前對其傳播無有效阻斷方法。已有數據表明瘧原蟲體內的法尼基焦磷酸合酶能被其底物焦磷酸鹽類似物——雙膦酸鹽化合物有效抑制[33]。相關研究表明,雙膦酸鹽化合物利塞膦酸對惡性瘧原蟲血液階段半數抑制濃度為20.3 μmol/L,且可抑制法尼基焦磷酸基團向寄生蟲蛋白轉移,體外結果顯示利塞膦酸可抑制瘧原蟲生長,在利塞膦酸鹽存在的情況下在培養基中添加法尼基焦磷酸合酶底物IPP,瘧原蟲生長未恢復,但添加其下游產物FPP 或 GGPP 可有效恢復瘧原蟲的生長。此研究結果表明法尼基焦磷酸合酶是雙膦酸鹽作用靶點[34]。Martin等[35]測定了19 種雙膦酸鹽對惡性瘧原蟲和剛地弓形蟲的抑制作用,經過比對發現不含氮的雙膦酸鹽具有較高活性,而對于惡性瘧原蟲,含有簡單芳基或烷基的雙膦酸鹽的IC50比含氮雙膦酸鹽低 10到20倍,以上研究表明:雙膦酸鹽結構不同可導致其對寄生蟲作用位點或結果有所差異。

4.2 雙膦酸鹽抗弓形蟲研究進展 雙膦酸鹽可抑制類異戊二烯通路,并已被證明能有效抑制弓形蟲生長[36-37]。Yardley等[38]使用10 mg/kg、20 mg/kg的利塞膦酸腹腔注射10 d,用于感染弓形蟲BALB/c小鼠的治療研究,結果顯示所有未經治療的對照組小鼠均于感染后16 d死亡,平均存活時間為12.7 d;而利塞膦酸 10 mg/kg治療組小鼠存活率為35%,平均存活時間為20.3 d;利塞膦酸20 mg/kg治療組存活率為55%,平均存活時間為22.1 d,表明利塞膦酸不能防止小鼠弓形蟲感染但可有效提升小鼠存活率。Szajnman等[39]研究結果顯示含砜化合物1-[(正癸基磺酰基)乙基]-1,1-雙膦酸對細胞內弓形蟲速殖子半數抑制濃度EC50為0.11 μmol/L,該化合物在組織培養中毒性較低,選擇性指數高于2 000,其在治療弓形蟲病小鼠模型中也顯示出高活性。該化合物對弓形蟲法尼基焦磷酸合酶的IC50高于其EC50,且其對惡性瘧原蟲和微小隱孢子蟲的EC50分別為0.6 μmol/L和65 μmol/L,表明該含砜雙膦酸是一種較好的抗寄生蟲新型藥物。Ling等[40]測定了60 種雙膦酸鹽對弓形蟲體外增殖的總體活性范圍為 280 nmol/L至 235 μmol/L,前10種最有效化合物的IC50均小于10 μmol/L,且該10種化合物中有7/10為含氮雙膦酸鹽,而后在弓形蟲感染小鼠模型中測試3種最有效的含氮烷基雙膦酸鹽,感染弓形蟲3 d后3種化合物分別以 5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg腹腔注射治療10 d,結果表明10 mg/kg的化合物1和5 mg/kg的化合物2可以保護80%的小鼠防止因感染死亡;而對照藥含氮雙膦酸鹽利塞磷酸只提供了約55%的保護率,且利塞磷酸的治療指數(100)遠低于該兩種含氮烷基雙膦酸鹽(1 600),作者推測含氮烷基雙膦酸鹽的較高保護作用與其治療指數有關。而后Moreno等[26]研究了60種雙膦酸鹽抗弓形蟲的功效,結果發現兩種最有效的化合物為長碳鏈(n=9或10)的含氮烷基雙膦酸鹽,驗證了以上Ling等人研究的含氮烷基雙膦酸鹽對弓形蟲的感染具有較好保護的結果。除此之外,Li等[41]發現雙膦酸鹽聯合用藥可有較高協同作用,在體外實驗顯示,含硫線性雙膦酸鹽中的一個衍生物1-[(正庚硫基)乙基]-1,1-雙膦(簡稱C7S)與多種他汀類藥物(西立伐他汀、匹伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀、美伐他汀)具有協同作用,而后以低劑量的阿托伐他汀(1.25 mg/kg/d)分別和C7S(0.03 mg/kg/d)、唑來膦酸(0.01 mg/kg/d)、利塞膦酸(0.01 mg/kg/d)聯合用藥或單藥治療弓形蟲感染的小鼠,結果表明單藥使用在感染后30d無明顯顯著保護作用,而聯合用藥組在相同條件下顯示60%至80%的保護作用,表明低劑量的雙膦酸鹽和他汀類藥物聯合用藥可起到更強的協同作用,并且聯合用藥劑量極低,可顯著降低藥物毒副作用。而先前報道市售雙膦酸鹽僅唑來膦酸與他汀類藥物之間有一定的協同作用。此外,雙膦酸鹽已被證明易積聚在寄生蟲感染的組織如肝臟和脾,濃度分別達到血漿濃度的140和814倍,并具有一定免疫調節作用[42]。以上研究表明,多種雙膦酸鹽尤其是含氮烷基雙膦酸鹽可有效降低弓形蟲感染。

4.3 雙膦酸抗隱孢子蟲研究進展 在頂復門原蟲中隱孢子蟲結構較為特殊,其在進化過程中丟失了頂質體[27],但Moreno等[32]利用31P NMR 共振技術檢測到微小隱孢子蟲中存在大量縮合磷酸鹽和焦磷酸鹽,表明焦磷酸鹽類似物可能抑制微小隱孢子蟲生長。隨后作者使用小鼠異種移植模型檢測100 μmol/L的利塞膦酸對微小隱孢子蟲增殖的影響,發現在利塞膦酸處理過72 h后的小鼠異種移模型中未檢測到寄生蟲。此外,將100 μmol/L的利塞膦酸鹽添加到部分脫囊的微小隱孢子蟲卵囊中不會導致子孢子活力的喪失,表明利塞膦酸作為焦磷酸鹽類似物可有效抑制微小隱孢子蟲的生長階段。Artz等[28]證明了含氮雙膦酸鹽能夠在受感染的 MDCK 細胞中以低濃度抑制隱孢子蟲生長發育。通過免疫熒光標記分析了含氮雙膦酸鹽對微小隱孢子蟲在 MDCK 細胞中生長的影響:帕米膦酸鹽和NE10790的IC50分別為 12.1 μmol/L和52.3 μmol/L,其數量級與巴龍霉素相同,而利塞膦酸、唑來膦酸和伊班膦酸顯示出較強的活性,其IC50低至3到6 μmol/L,比巴龍霉素的抑制效力強一個數量級以上,其作用機制是抑制類異戊二烯的生物合成,靶標酶是一種獨特的微小隱孢子蟲酶,稱為非特異性聚異戊二烯焦磷酸合酶。該酶產生各種大于 FPP 的類異戊二烯產物,并在亞納摩爾濃度下被含氮雙膦酸鹽抑制,且該機制得到了與利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽所結合的酶的晶體結構證實。Bessoff等[43]用伊伐他汀抑制宿主甲戊酸途徑,減少IPP合成而阻斷微小隱孢子蟲的生長,而培養基中添加IPP可恢復部分微小隱孢子蟲的生長。這表明微小隱孢子蟲依賴于宿主通過甲羥戊酸途徑合成產生的IPP合成必需的類異戊二烯化合物。

5 展 望

頂復門原蟲包括全球性的最普遍和最致命的人類病原體,嚴重威脅人類和動物健康,迫切需要新的抗寄生蟲藥物。現有治療方法和藥物多半有毒副作用或一定的耐藥性。目前,干擾類異戊二烯代謝途徑已被證明是預防和治療病原微生物疾病的一種有效方法。與瘧原蟲和弓形蟲不同,隱孢子蟲在進化過程中丟失了頂質體不能從頭合成類異戊二烯物質,其特殊的合成途徑尚不清楚,有待進一步深入研究。雙膦酸鹽在臨床上已成熟應用于治療骨代謝疾病,具有很好的安全性、開發空間較大。且頂復門原蟲體內的戊烯基合酶具有特殊的結構特性,可結合不同鏈長底物,同時雙膦酸化合物側鏈結構的微小變化均可影響其吸收能力和作用效果,以此可擴大雙膦酸類及相關抑制劑的儲備。因此,雙膦酸鹽有望發掘成為新型抗原蟲藥物。

利益沖突：無

引用本文格式：侯文燕,張營營,張龍現,等.雙膦酸鹽抗三種頂復門原蟲研究進展[J].中國人獸共患病學報,2024,40(2):185-190,196. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.029