二甲雙胍調控LC3B/p62 自噬通路抑制椎基底動脈延長擴張癥進展的機制

束寧德，劉慶新，曹曉雨

（濱州醫學院附屬醫院神經內科，山東 濱州 256600）

椎基底動脈延長擴張癥（Vertebrobasilar Dolichoectasia，VBD）是進行性發展的腦血管疾病，且與卒中的發生聯系緊密[1]。隨著VBD 血管病變程度的加重，腦缺血區域會增加[2]。根據多項動物實驗及尸檢報告可以明確VBD血管的病理特征為血管迂曲擴張，血管壁變薄，血管的彈性纖維斷裂伴隨內彈力層變性、間隙增多，血管平滑肌層全層萎縮[3]。

自噬能改善動脈瘤的血管重構[4-6]，抑制自噬的激活可能對主動脈夾層存在治療作用[7]。Wu、Liu 等人的研究也發現在血管炎癥以及動脈瘤等疾病中，亞精胺、STAT3抑制劑可通過激活自噬保護細胞，減輕血管炎癥，改善動脈瘤的血管重構[5-6]。Azza 團隊通過系統性回顧研究驗證發現，自噬不僅存在保護作用，過度激活的自噬也可加快細胞凋亡，導致細胞的死亡[8]。VBD 屬于血管形態學改變疾病，血管中存在多種結構破壞表現，是否有自噬的參與尚未見研究報道。

二甲雙胍是一類降糖藥物，同時還具有抗炎、內皮細胞保護、抗衰老等多種功能。以往的研究證實二甲雙胍能夠增加自噬相關蛋白 LC3II/I、beclin 1，且能改善血管收縮功能[9]。硫酸羥氯喹是一種著名的抗瘧藥，也是臨床上常用的自噬抑制劑。本實驗擬構建 VBD 大鼠模型，通過應用二甲雙胍及硫酸羥氯喹處理 VBD 大鼠，檢測各組大鼠血管平滑肌細胞自噬標志蛋白（LC3B、p62），探討二甲雙胍誘導的自噬在VBD 病程中的作用及機制，為VBD 的預防及治療提供思路。

1 材料與方法

1·1 實驗動物與試劑

選 擇6 ～7 周 體 重200 ～220 g SPF 級SD 大 鼠 共64 只（濟南朋悅繁育有限公司），飼養于濱州醫學院附屬醫院實驗動物中心。環境溫度18 ～25℃，環境濕度40%～70%，換氣次數10 ～20 次/h，光暗交替比例1∶1，定時飼喂等量紫外線消毒鼠糧、更換高壓蒸汽滅菌水。本動物實驗已通過濱州醫學院附屬醫院倫理委員會審核。

彈性蛋白酶（Worthington Biochemical 公司）、鹽酸二甲雙胍（中美上海施貴寶制藥有限公司）、硫酸羥氯喹 （上海上藥中西制藥有限公司）、LC3B 抗體（Proteintech Group）、p62 抗體 （博士德生物）、β-actin抗體 （博士德生物）、抗兔IgG 抗體（博士德生物）。

1·2 動物分組與處理

常規適應性喂養1周后，將64只大鼠隨機分為四組，即假手術組（S組）、VBD 模型組（V組）、二甲雙胍組（M組）、二甲雙胍+硫酸羥氯喹組（MH 組），每組16 只。后三組均制備VBD 模型。造模后24 h，M 組大鼠先給予2 mL 生理鹽水灌胃，30 分鐘后給予200 mg/kg 二甲雙胍灌胃；MH 組先給予40 mg/kg 硫酸羥氯喹（2 mL）灌胃，30 分鐘后給予200 mg/kg 二甲雙胍灌胃；其余兩組大鼠每天給予等量生理鹽水灌胃。

1·3 VBD 模型的制備

依次稱量各組大鼠體重，按10%水合氯醛0·4 mL/100 g比例，計算安全麻醉藥物腹腔注射劑量。參考文獻造模方法[4-5]，按照以下步驟進行操作：將麻醉良好的大鼠以俯臥位固定于工作臺，常規標記手術切口，備皮、消毒、鋪巾。逐層剪開大鼠皮膚、皮下軟組織，用鑷子鈍性分離大鼠頸部肌肉至環枕筋膜處。用微量注射器針尾抬高約45°緩慢旋轉進針穿刺環枕筋膜，待出現明顯突破感后向枕大池緩慢注射2·5 μL 彈性蛋白酶（10 MU/μL）（V 組、M 組、MH 組），S 組大鼠注入等體積生理鹽水。注射完成后停針靜置1 分鐘，緩慢拔針，觀察到有清亮腦脊液由針孔處緩慢溢出，表明穿刺位置正確。以無菌棉簽充分按壓注射點，直至注射點無腦脊液流出。

1·4 基底動脈彎曲程度的評價

造模8 周后，于深度麻醉下或灌流后處死大鼠并拍攝采集基底動脈照片，取材后存至-80℃冰箱備用。使用ImageJ 軟件對所采集的圖像進行測量，記錄數值進行整合及分析，測量血管的最大直徑、垂直長度及實際長度，計算直徑增加比率、血管的迂曲指數。各組測量或計算后的數值同時滿足以下兩個條件被認為造模成功，并納入各自分組（不滿足的樣本及數據將被剔除）：（1）直徑增加比率=（樣本直徑-假手術組平均直徑）/假手術組平均直徑≥0·25；（2）迂曲指數=（動脈實際長度/動脈垂直長度-1）×100 ≥10。動脈垂直長度：自基底動脈尖至椎動脈末端的直線距離。動脈實際長度：自基底動脈尖沿血管走行至椎動脈末端的距離。基底動脈直徑：測量基底動脈擴張程度最大處為基底動脈直徑。

1·5 Westernblot 檢測

取方法1·4 中帶有腦血管樹的大鼠全腦，剝離大鼠椎基底動脈，稱量標本重量后，加入裂解液及PMSF，充分進行研磨后使細胞充分裂解。裂解后離心取上清液，用BCA 法進行蛋白濃度測定。將BCA 實驗后剩余上清液按照1∶4 的配比添加5×蛋白上樣緩沖液，以95℃水浴鍋水浴加熱10 min，再次冷卻至室溫后，置于-20℃環境中保存備用。配制12·5% SDSPAGE 凝膠及電泳液，按計算后的蛋白上樣量進行上樣，進行電泳。電泳結束后分別在200 mA、30 min（LC3B、β-actin），200 mA、70 min（p62）條件下進行冰上轉膜。轉膜結束后，以5%脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。用封閉液配制一抗后，將封閉后的條帶置于對應一抗（LC3B 抗體、p62 抗體）中，于4℃下過夜。孵育后用TBST 充分洗滌殘余一抗，然后加入封閉液配制的二抗（抗兔IgG 抗體）室溫孵育2 h。以TBST 充分洗滌二抗后，加入 ECL 發光液進行曝光處理，并進行相關條帶的圖像采集。

1·6 統計學分析

使用SPSS 26·0 軟件及GraphPad Prism 8 軟件進行統計分析。正態性和等方差假設分別使用Hartley 檢驗和峰度與偏度Z 評分（Z-score）進行分析。符合正態分布且方差齊的數據采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)法進行分析，進一步兩兩比較采用Tukey 多重比較，方差不齊的數據比較采用Brown-Forsythe、Welch ANOVA和Tamhane’ s T2檢驗，以P＜0·05為差異有統計學意義。

2 結果

2·1 大鼠一般情況觀察及VBD 模型成功率統計

在實驗過程中共有4 只大鼠死于麻醉意外或術后并發癥，其中S 組、 V 組、M 組、MH 組分別為 1 只、0只、1 只、2 只。按照實驗計劃進行藥物干預 8 周后，取大鼠基底動脈，按統一標準測量大鼠基底動脈直徑、基底動脈尖至椎動脈末端直線長度、血管的走行長度等指標，計算各組大鼠直徑增加比率及血管的迂曲指數。根據VBD 大鼠納入標準（基底動脈直徑增加比率≥0·25；基底動脈迂曲指數≥10），各組分別排除 0 只、1 只、1只、2 只大鼠， 實驗總體模型制作成功率為 91%（41/45），各組大鼠模型制作成功率均在 86%以上。

2·2 VBD 大鼠基底動脈血管重構觀察及基底動脈迂曲指數、直徑、直徑增加比率計算

藥物干預 8 周后，通過對比四組大鼠基底動脈可以發現，V 組、M 組、MH 組大鼠基底動脈均有不同程度的迂曲延長，其中M 組血管迂曲及延長程度較 V 組及MH 組輕（見圖1）。

圖1 四組大鼠造模后8 周基底動脈形態特征

拍攝大鼠基底動脈形態學照片，應用 ImageJ 軟件測量四組大鼠基底動脈直徑并計算基底動脈迂曲指數及基底動脈直徑增加比率（詳見表1、圖2）。與S 組相比，V 組、M 組、MH 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數及直徑增加比率均有明顯增加，差異有統計學意義（P＜0·05）；與V 組相比，M 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數及直徑增加比率均明顯減小，差異有統計學意義（P＜0·05）；與M 組相比，MH 組大鼠基底動脈直徑、迂曲指數及基底動脈直徑增加比率均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0·05）。

表1 各組基底動脈延長、擴張程度比較（±s）

表1 各組基底動脈延長、擴張程度比較（±s）

組別 (每組大鼠數量) 基底動脈迂曲指數 基底動脈直徑 (mm) 基底動脈直徑增加比率Group S (10) 1.5302 ± 0.4047 0.2125 ± 0.0213 0.0000 ± 0.1003 Group V (10) 35.5258 ± 7.1007 0.4051 ± 0.0560 0.9064 ± 0.2637 Group M (9) 11.7234 ± 1.6032 0.2850 ± 0.1983 0.3412 ± 0.0933 Group MH (7) 23.0161 ± 6.2910 0.4094 ± 0.0439 0.9267± 0.2064

圖2 基底動脈迂曲指數、動脈直徑、基底動脈直徑增加比率

2·3 二甲雙胍干預的 LC3B/p62 相關自噬通路的調節作用

藥物干預 8 周后處死大鼠，取大鼠基底動脈提取蛋白，應用Western blot 技術檢測大鼠基底動脈平滑肌細胞內自噬相關蛋白指標并進行組間比較，比較結果如圖3所示，與S 組相比，V 組大鼠基底動脈LC3BII/I 蛋白比值明顯下降（P＜0·05），p62 蛋白表達升高（P＜0·05）；與 V 組相比，M 組及MH 組大鼠基底動脈LC3BII/I 蛋白比值升高（P＜0·05），p62 蛋白表達減少（P＜0·05）；與M 組相比，MH 組p62 蛋白表達增加（P＜0·05）。

圖3 各組大鼠血管標本中LC3BII/I 和p62 蛋白表達比較

3 討論

VBD 是腦血管病的一類，其特征性表現為椎動脈和（或）基底動脈的異常迂曲擴張。我們的研究團隊前期通過應用免疫熒光、Western blot、PCR 等相關實驗手段，驗證了VBD病變血管基質金屬蛋白酶 MMP-9表達增加，發現血管周圍巨噬細胞標志物MAC387 及JNK 表達量升高，應用瑞舒伐他汀對VBD 大鼠進行干預后，通過對比大鼠組間MAC387 等炎癥指標的變化，認為炎癥可能是VBD 的病因之一。過度激活的炎癥導致血管平滑肌細胞的損傷及血管結構的破壞，細胞的自噬作為一個高度保守的過程，往往在缺血、炎癥、氧化損傷等條件下出現，通常情況下自噬通過降解損傷細胞，并對降解細胞中的物質進行循環利用，從而使機體更快地適應環境的變化；同時結合文獻發現，特異性刪除小鼠血管平滑肌細胞的自噬相關基因會導致小鼠血管的彈性蛋白降解、斷裂[10-13]，相似的病理表現提示自噬可能同樣參與VBD 血管改變。

二甲雙胍能夠增加自噬相關蛋白 LC3II/I、beclin 1 和腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-Activated Protein Kinase，AMPK）水平，增強 AMPK/mTOR 信號通路，減輕β-甘油磷酸誘導的血管平滑肌細胞鈣化，同時還能增加血管平滑肌細胞中α-SMA 蛋白表達，改善血管收縮功能[14]；二甲雙胍還能夠通過降低NLRP3 和選擇性自噬接頭蛋白（Sequestosome 1，p62）的表達，增加LC3II/LC3I 的比值，減輕巨噬細胞的炎癥反應，保護缺血心肌，減輕心肌損傷[10]；此外二甲雙胍可通過增強自噬在改善炎癥-衰老的狀況、延緩骨關節炎進展、改善肺纖維化等不同方面發揮積極作用[11-12，15]。目前，二甲雙胍已成為短期內激活自噬的首選藥物之一。硫酸羥氯喹是磷酸氯喹的衍生物，由于其治療指標廣、口服生物利用度高、成本低，常用作臨床自噬相關的研究。Qin Fei 的團隊在研究中發現，氯喹能夠消除二甲雙胍對巨噬細胞自噬的促進作用[16]，在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中，羥氯喹抑制自噬的作用在相關手術中也有所應用[17]。

本實驗通過建立VBD 大鼠模型并使用二甲雙胍、二甲雙胍+硫酸羥氯喹進行干預，初步觀察了VBD 大鼠椎基底動脈中的LC3B 、p62 蛋白表達及二甲雙胍對其干預的作用，結果顯示：與S 組相比，V 組大鼠 LC3BII/I水平降低，p62 水平升高；與V 組相比，M 組及MH 組LC3BII/I 比值增加，M 組p62 蛋白降低；與M 組相比，MH 組大鼠p62 蛋白水平較高，以上差異均有統計學意義（P＜0·05）。本研究提示：VBD 大鼠血管迂曲擴張程度增加；VBD 大鼠血管平滑肌細胞自噬水平減低；二甲雙胍可延緩 VBD 的進展，其機制可能與干預 LC3B/p62 相關通路，提升血管平滑肌細胞自噬水平有關。

由于本實驗時間有限，對VBD 大鼠僅進行了8 周的干預，后續可進一步延長干預時間，進行療效觀察。本次研究過程中，在應用臨床治療藥物二甲雙胍對VBD大鼠進行相關實驗治療時，未設置不同的劑量組進行觀察對比，后續進行相關臨床試驗時還需進一步調整劑量以及設置相關對照組，以明確最佳的治療劑量。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。