改良方法與傳統方法對富血小板血漿血小板回收率的對比研究

鄧述歡，黃少媛，張棟武

（1·佛山市順德區樂從醫院，廣東 佛山 528315；2·佛山市高明區人民醫院，廣東 佛山 528500）

富血小板血漿（Platelet-Rich Plasma，PRP）是一種通過離心自體外周血獲得的血小板濃縮物[1]。研究已證實 PRP 激活后，血小板中的 α 顆粒可釋放PDGF、VEGF、TGF-β、IGF 和 EGF 等多種生長因子[2-3]。PRP具有促進組織修復的作用，且來源于自體，具有無排斥反應和來源便捷等優勢，臨床上已廣泛用于骨不連、慢性肌腱損傷、慢性創面、關節內軟骨損傷和骨關節炎等多種疾病的治療[4-7]。目前，臨床上使用的 PRP 制備套裝主要采用二次離心法和一次離心法。血小板回收率是用于比較制備方法優劣的指標，有學者[8]用血小板回收率對4 種不同參數的PRP 制備方法進行了比較，分析方法的優劣，并提出了改良方法。傳統的血小板回收率計算公式為：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；用此方法計算的血小板回收率均較低，在 46·9%左右[9-12]。此方法計算血小板回收率受較多因素的影響，特別是受人為因素的影響較大,進而影響PRP在臨床中的治療效果，使得PRP 在臨床治療中的推廣受限[13-15]。在制備PRP 時因血小板在中高速離心后多聚集在管底部，且有聚集成團的現象，操作者通常用吸管吹打數次后取100 μL 移于PVC 管用于計數，吹打次數不夠，血小板未充分懸浮，可導致計數偏低。其次因為PRP 的血小板濃度是基數血小板的數倍，而儀器計數有線性范圍，有學者通過對某款儀器進行性能分析發現，其線性范圍為( 0 ～977)×109/L, 而PRP的血小板濃度常有超過這一范圍的情況，所以易導致誤差。本研究通過對貧血小板血漿（Platelet-Poor Plasma,PPP）的血小板計數，用差值計數法得到PRP的真實濃度，再用血小板回收率的計算公式計算回收率。該方法不受上述因素影響，準確度可提高。研究表明，PPP 計數法的回收率明顯高于PRP 計數法的回收率，且其方法簡單不需要額外的儀器，只要有血球分析儀的實驗室都可開展，是值得推廣的方法。

1 材料與方法

1·1 實驗對象選擇標準

取 68 例成年健康志愿者的外周血（6 支 9mL/例）。其中男39 例，女29 例；年齡18 ～68 歲，平均42·6 歲。研究納入標準：（1）符合《中華人民共和國獻血法》和中華人民共和國衛生部頒布的《獻血體格檢查標準》相關要求的健康人群，血紅蛋白：男性≥120 g/L，女性≥ 110 g/L；血小板計數≥100×109/L［正常值（100 ～300）×109/L］。（2）采血前7 d 內未服用影響血小板功能和凝血系統的藥物。（3）無臨床可見的肝腎功能性疾病、傳染性疾病、相關血液疾病、惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病及感染等，依從性好且愿意配合進行相關檢測及隨訪，資料齊全。 研究排除標準：在納入標準的基礎上將依從性差，或有其他不適宜做此項研究之基礎疾病如血小板減少等的患者、資料不全或失聯者均排除在本次研究項目之外。本研究之目的、預期結果及潛在風險經過本單位道德倫理委員會討論認定符合道德倫理標準要求（樂從醫倫字20220124）。

1·2 主要試劑與儀器

枸櫞酸鈉抗凝管（廣州陽普醫療器械有限公司，10 mL/支）；一次性使用采血針（廣州陽普醫療器械有限公司）；生物安全柜（山東濟南鑫貝西生物技術有限公司）、離心機（山東百歐醫療科技有限公司，TDL-500C 型）、全自動血液分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，BC5390CRP）。

1·3 PRP 制備方法

方法：（1）用9 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血6 支（用于制備PRP），用2 mL 的枸櫞酸鈉一次性采血管抽血1 支（用于PLT 計數）。（2）將6 支血樣放入離心機第一次離心（參數160g、20 min，升9 降9），離心后取血漿放入潔凈離心管，對收取的離心管內血漿（PPP 血漿）進行充分混勻，并記錄體積，取100 μL 混勻的血漿放入PVC 管進行血小板計數。（3）對混勻的血漿進行第二次離心（離心參數：460g、15 min，升9 降9）。（4）第二次離心后，留下管底的2 mL富血小板血漿（PRP管），用吸管把上層的泛血小板血漿吸到另一支一次性離心管（PPP 管）中。充分混勻PRP 管并取100 μL 置于PVC 管中進行PLT 計數，得到數據組（PRP 血漿直接PLT 計數組）；充分混勻PPP管并取100 μL置于PVC管中進行PLT計數，得到數據組（PPP 血漿PLT 計數組）。

1·4 數據收集及計算血小板回收率

用兩組數據及相應的方法計算其相應的血小板回收率。分別為傳統方法計算的血小板回收率（公式1）：血小板回收率=（PRP 體積×PRP 中血小板濃度）/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%；改良法計算的血小板回收率（公式2）∶血小板回收率=(第一次離心后的血漿血小板計數×第一次離心后血漿的體積-PPP 的血小板計數×PPP 的體積)/（全血體積×全血中血小板濃度）×100%。

1·5 統計學方法

對所有結果采用GraphPad Prism統計軟件進行分析。

2 結果

用PRP 直接計數的血小板回收率，平均回收率為66·8%，最高回收率為95·7%，最低回收率為21·5%；PPP 直接計數的血小板回收率，平均回收率為75·9%，最高回收率為98·8%，最低回收率為35·7%。PPP 直接計數的血小板回收率顯著高于PRP 直接計數的血小板回收率，P＜0·05。見圖1。

圖1 血小板回收率比較

3 討論

PRP是一種自身血液經過離心去除紅細胞而得來的濃縮血小板血漿，盡管被醫療領域廣泛應用，但不少文獻認為PRP 在某些領域并不適用。目前，PRP 在慢性腱鞘炎、骨關節炎治療、醫美領域應用廣泛，在整形外科領域的應用逐漸被重視，但是應用效果卻不盡相同，爭議眾多，其根本原因在于PRP 制作最終質量不同[2,6,10]。看似是簡單的制作流程，但由于缺乏普遍認可的PRP 制作質量控制標準，多種因素（尤其是制作人操作水平、離心次數、離心機參數等因素）均可造成血小板回收率的較大差異，導致成品PRP 質量參差不齊，進而導致應用效果及臨床作用不盡相同。PRP 作為一種高濃度血小板濃縮物被應用于臨床由來已久，尤其是在慢性損傷修復、運動損傷修復、燒燙傷創面修復方面功效明顯；因血小板中富含生長因子、細胞因子和抗菌肽等多種生物活性物質，具有促進細胞增殖、分化、基質合成、組織再生與修復等作用，而被臨床所重視，因此近來在臨床多個領域被廣為推崇，但由于PRP 制備方法受到人員素質、設備性能、計算方式等諸多因素制約，導致PRP 質量參差不齊，隨著行內專家共識指導性文件[1]的出現，這一現象得到改觀。由于PRP 制備方法大多以一次離心法、二次離心法及三次離心法等手工法為主，導致血小板回收率參差不齊（從21·5%～98·8%不等），但二次離心法或三次離心法血小板回收率顯著高于一次離心法，Harriso 等[5]通過對6 種離心所得的PRP 分析發現，血小板回收率差異較大，其總體回收率介于（53±18）%至（72±13）%之間，血小板計數值介于（568～1062）×109/L之間，白細胞計數、紅細胞比容等有形成分也各不相同，提示不同離心力參數制備的PRP 質量差異較大；有學者[7-10]采用不同離心參數及全血規格制備了PRP，比較了血小板回收率和純度，結果表明：三次離心法制備的PRP 純度較高，但血小板回收率偏低，不適合用于醫美或其他慢性修復，只適合制備冰凍血小板等。還有研究發現[11-13]：采用不同離心力參數離心法（先1000 g 離心10 min，再1500 g 離心15 min）制備所得的 PRP 血小板回收率最高，值得推廣；但有學者提出了不同看法[14-16]，認為這種方法跟分步離心法并無不同，且血小板回收率未見提升。

為提高PRP 制作水平，獲得穩定的、純度較高的、血小板回收率符合要求的PRP，在總結各類普遍使用的PRP 制作方法之基礎上，本文作者采用二次離心法制備PRP，通過先制備PPP，而后再將PPP 第二次離心取得PRP，結果顯示：血小板回收率顯著高于一次離心獲得的PRP，血小板回收率符合要求，取得滿意效果；PRP 含有數倍于血小板生理濃度的血小板濃縮物，研究認為，PRP 中的血小板計數達到全血3 ～6 倍以上才能起到治療作用[16-17]。有學者在研究后認為，衡量PRP 成品質量的指標主要是血小板富集系數和回收率[18-20]。所以在實際工作中如何把回收率計算準確是亟待解決的問題。直接行PLT 計數的影響因素較多，具體包括：操作人員在工作中的操作會影響PLT 的計數準確度，如操作人員吹打的時間和力度不同；因PRP 中PLT 的濃度不同，PLT離心會聚成塊狀，同樣的力度吹打，血小板散開的程度不同，吹打后涂片用顯微鏡觀察通常會有肉眼無法觀察到的小凝塊；血細胞分析儀的分析原理主要是電容型、電阻抗型、激光型、光電型、聯合檢測型、干式離心分層型和無創型，不管是哪一種類型都無法區分聚集的血小板小塊，再者血細胞分析儀的檢測能力都有一個線性范圍，超過線性范圍的PLT 濃度的標品就會失真。本研究采用分步離心法先取得PPP，再將PPP 離心取得PRP，較好地解決了血小板回收率不足等問題，值得臨床推廣。

現在一般的血細胞分析儀的PLT 計數線性范圍在（0 ～1000）×109/L，采用PRP 制品直接行PLT 計數結果的準確性值得懷疑。用傳統的血小板回收率的計算公式算出的回收率其準確性必然大打折扣。血小板數值直接與臨床治療效果相關聯[4,8-9,16]，因此，制備出高質量的PRP 意義重大。但是，制備PRP 受諸多因素制約，如環境溫度、操作者技術水平、離心次數等等，所以，PRP 制備好后的PLT 計數就顯得非常重要；本研究用改良方法計算的血小板回收率，其公式用到的兩個PLT 計數都不會超出線性范圍，計數的準確性是有保障的，第一次離心的計數，因是低速離心，取血漿的PLT 計數通常是原血血小板計數的一倍左右，涂片鏡檢也沒發現有聚集現象。PPP 的血小板計數通常在100×109/L 左右,在儀器的線性范圍內,其計數的準確性也有保障。所以改良法血小板回收率計算公式的各變量都能準確測得，其計算所得的回收率是準確可靠的。從上述統計結果來看，改良法計算的回收率的平均值是84%，而傳統法計算的回收率平均值是72%，高出12%，兩者差異有統計學意義（P＜0·05）。改良法回收率的計算不需要測PRP 的血小板計數，所以在制作PRP 時就不用取部分PRP 血漿用來計數，從而減少了污染的風險，提高了PRP 血漿質量，尤其在侵入性方式使用PRP 的醫美領域或慢性損傷性修復領域，防止污染PRP 進入人體是影響修復是否達到預期的關鍵因素[17-20]，值得臨床重視。

綜上所述，本研究采用的改良法制備的PRP 成品，血小板回收率比傳統法明顯更優，血液其他有形成分計數與傳統方法比較未見明顯差異，且減少了PRP 被污染的風險，血小板計數值符合醫美、慢性炎癥修復之臨床應用要求，值得推廣。本研究存在的不足之處在于：試驗樣本量不足，導致PRP 質量評價缺乏大數據支撐。關于PRP 制備方法、離心參數、質量評價標準體系文件的建立，依然需要臨床同行繼續努力，這也是本研究組成員今后努力之方向。