Twist調(diào)控人胃癌組織中的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成擬態(tài)作用機(jī)制研究

于淇?張兆堃?鄂思含?李露露?徐萬(wàn)鵬

摘 要｜目的：研究Twist促進(jìn)VM的形成，豐富和完善了血管生成擬態(tài)理論。方法：觀察胃癌組織及正常胃組織Twist、EMT標(biāo)志蛋白（E-cadherin和Vimentin）及VM標(biāo)記物CD34-PAS的表達(dá)情況，分析Twist、EMT標(biāo)志蛋白與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性，研究VM與EMT標(biāo)志蛋白的關(guān)系，Twist與EMT標(biāo)志蛋白的關(guān)系。進(jìn)一步驗(yàn)證Twist通過(guò)促進(jìn)胃癌EMT、從而促進(jìn)VM的形成結(jié)果：EMT標(biāo)志蛋白和VM有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Twist及EMT標(biāo)志蛋白有一定的相關(guān)性。結(jié)論：Twist可能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生，并促進(jìn)胃癌VM的形成。

關(guān)鍵詞｜EMT；Twist；侵襲；相關(guān)性

Copyright ? 2024 by author （s） and SciScan Publishing Limited

This article is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License. https：//creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/

Twist是人類胚胎發(fā)育的主要調(diào)控因子，其中Twist1基因通過(guò)其誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的能力，被證明有利于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。通過(guò)之前的研究表明，很大一部分人類癌癥過(guò)度表達(dá)了Twist1或Twist2基因［1］。胃癌（gastric carcinoma，GC）是一種惡性腫瘤，源于胃黏膜上皮細(xì)胞的異常增生。胃癌的流行病學(xué)表現(xiàn)在不同地區(qū)呈現(xiàn)顯著差異，特別是西北和東部沿海地區(qū)，發(fā)病率比南方地區(qū)明顯偏高。胃癌通常易發(fā)病于50歲以上人群，但隨著現(xiàn)代飲食結(jié)構(gòu)的改變、工作壓力的增大以及幽門螺桿菌感染等多種因素的影響，胃癌呈年輕化趨勢(shì)。盡管在發(fā)達(dá)國(guó)家（如歐美等）胃癌的患病率和死亡率呈下降趨勢(shì)，這與社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高相關(guān)，但在亞洲和拉丁美洲等地，胃癌依然屬高發(fā)疾病。近年來(lái)，胃癌早期診斷率、綜合治療效果、手術(shù)切除率以及術(shù)后生存率都有所提高［2］。

1 腫瘤血管生成與血管生成擬態(tài)

傳統(tǒng)的血管生成理論認(rèn)為，腫瘤的生長(zhǎng)依賴于新血管的形成。一旦實(shí)體腫瘤的直徑超過(guò)2mm，就迫切需要引導(dǎo)血管生成，以獲取足夠的血液供應(yīng)以維持其持續(xù)性生長(zhǎng)；否則，腫瘤細(xì)胞可能因?yàn)槿狈ψ銐虻难豕?yīng)而發(fā)生壞死［3］。抗血管生成治療應(yīng)運(yùn)而生，但隨著抗血管生成藥物的廣泛應(yīng)用，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)并沒(méi)有取得預(yù)期的效果。1999年，美國(guó)Maniotis等［4］在研究高侵襲性人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)時(shí)發(fā)現(xiàn)并命名了一種新的血液供應(yīng)模式——VM。VM的發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)認(rèn)為腫瘤獲得血供的唯一途徑為內(nèi)皮血管的理論，解釋了具有高侵襲性、高轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤的生物學(xué)行為。VM是由腫瘤細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD34陰性）在特定的微環(huán)境下通過(guò)自身塑形及細(xì)胞外基質(zhì)重塑圍成的、內(nèi)有一層基膜樣物質(zhì)（正常血管壁及VM壁的組成部分標(biāo)記PAS陽(yáng)性）的不規(guī)則的網(wǎng)格狀類血管樣管道［5］。三維培養(yǎng)是目前體外實(shí)驗(yàn)研究VM的一個(gè)相當(dāng)重要的評(píng)價(jià)方法［6］，基質(zhì)膠的作用與哺乳動(dòng)物細(xì)胞基底膜類似，是體外研究VM理想的支架來(lái)源之一。

2 EMT與血管生成擬態(tài)

參與形成VM的腫瘤細(xì)胞模擬內(nèi)皮細(xì)胞的功能和表型，而內(nèi)皮細(xì)胞本身屬于間質(zhì)細(xì)胞的一種，因而可能發(fā)生腫瘤細(xì)胞由上皮型向間質(zhì)型內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，這種現(xiàn)象就是EMT［7］。EMT是一定條件下緊密連接的上皮細(xì)胞向連接松散的紡錘體樣間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的動(dòng)態(tài)病理過(guò)程，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生相應(yīng)的變化。通過(guò)EMT，腫瘤細(xì)胞獲得了較高的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色。

3 材料和方法

3.1 研究對(duì)象

收集臨床上經(jīng)手術(shù)切除并經(jīng)病例證實(shí)的原發(fā)性胃癌石蠟標(biāo)本，術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及免疫治療等腫瘤特異性治療。搜集患者年齡、腫瘤直徑、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓形成等資料。另外病理證實(shí)胃良性潰瘍術(shù)后或胃減重手術(shù)后正常胃組織標(biāo)本作為對(duì)照研究。患者簽署受試者知情同意書，并遵守單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

3.2 方法

蛋白免疫組織化學(xué)染色：采用S-P免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Twist、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)，具體操作如下：

（1）石蠟切片厚度3μm，60～65℃烘烤4小時(shí)；

（2）PBS緩沖液沖洗2次，每次5分鐘；

（3）組織抗原修護(hù)；

（4）PBS緩沖液洗滌3分鐘；

（5）每片加50μL過(guò)氧化物酶使溶液閉塞，室溫孵育10分鐘；

（6）PBS沖洗33分鐘；

（7）去PBS，每片加無(wú)免疫性動(dòng)物血清50μL，室溫孵育10分鐘；

（8）PBS沖洗35分鐘；

（9）去PBS，每片加液，室溫溫育；

（10）PBS沖洗33分鐘；去PBS，每片加1滴，室溫孵育10分鐘；PBS沖洗3次，每次3分鐘；

（11）去PBS，每片加新鮮DAB1～2次，顯色3～10分鐘，陽(yáng)性顯色為褐色或黃色；

（12）自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗10～15分鐘；

（13）配制DAB顯色試劑，切片梯度酒精脫水干燥，透明化用二甲苯，按“切片脫蠟，水化”程序反向進(jìn)行，最后中性樹膠封固。

CD34-PAS雙重染色：

（1）包埋好的標(biāo)本用石蠟切片機(jī)切片，厚度4μm；

（2）切片經(jīng)烤片處理、二甲苯脫蠟、梯度酒精至水；

（3）將切片放入pH為6.0的0.1mol/L檸檬酸抗原修復(fù)液中，進(jìn)行沸水浴處理，保持20分鐘，停止加熱后自然冷卻20～30分鐘。

（4）用0.01mol/LPBS清洗3次，每次3分鐘，阻水筆圈畫組織，滴加3%的過(guò)氧化氫，封閉10分鐘，以去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；

（5）用0.01mol/LPBS洗滌3次，每次3分鐘，洗去過(guò)氧化氫，甩干PBS，滴加5%的山羊血清室溫封閉1小時(shí)；

（6）濾紙吸干多余封閉液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果或抗體說(shuō)明書中的建議濃度，滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過(guò)夜；

（7）第二天，使用0.01mol/L的PBS進(jìn)行3分鐘的清洗，共進(jìn)行5次，將一抗去除。將多余的PBS甩去后，滴加二抗，將切片置于室溫下的孵育盒中進(jìn)行30分鐘的孵育；

（8）用0.01mol/LPBS清洗5次，每次3分鐘，洗去多余的二抗，甩去多余PBS，保持切片濕潤(rùn)的狀態(tài)下，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察陽(yáng)性，記錄最佳顯色時(shí)間，其余切片相同時(shí)間顯色；

（9）水洗多余的DAB（DAB為一類致癌物，水洗后的廢液需要加入硫酸-高錳酸鉀水溶液中和，可安全排出）；

（10）去離子水輕洗玻片，置換掉自來(lái)水分，甩干玻片上的水分，滴加高碘酸液，室溫處理10分鐘，去離子水洗2～3次，每次靜置1～2分鐘；

（11）甩去玻片上的水分，4℃取出PAS試劑，直接滴染，室溫孵育10分鐘；注意該步反應(yīng)需要及時(shí)避光；用避光紙蓋住即可，不要移動(dòng)，防止染液流動(dòng)；

（12）PAS染色時(shí)間到后，使用亞硫酸沖洗液清洗玻片3～5次，每次靜置1～2分鐘；

（13）復(fù)染，滴加蘇木素染色液，室溫3分鐘，0.01mol/LPBS洗去多余的染液，3分鐘3次；

（14）進(jìn)行梯度酒精復(fù)水處理：先使用80%酒精浸泡5秒，然后95%酒精浸泡10秒，接著使用100%酒精浸泡3分鐘，之后再用100%酒精浸泡5分鐘。接下來(lái)，使用二甲苯Ⅱ進(jìn)行透明處理5分鐘，然后使用二甲苯Ⅰ進(jìn)行透明處理5分鐘（如果未完全透明，可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間）；

（15）中性樹膠封片，待樹膠干透后，鏡檢。

結(jié)果判定、評(píng)分：免疫組化結(jié)果的判定采用免疫反應(yīng)半定量積分法，總分等于染色強(qiáng)度積分乘以陽(yáng)性細(xì)胞比例積分。染色強(qiáng)度積分按照不顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分進(jìn)行評(píng)分；陽(yáng)性細(xì)胞比例積分通過(guò)在低倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，確保總腫瘤細(xì)胞數(shù)不低于1000個(gè)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例，分別為0分（0%）、1分（1%～10%）、2分（11%～50%）、3分（51%～80%）、4分（>80%）。總分范圍為0～12分，定義0～3分為陰性，3分為陽(yáng)性。CD34-PAS雙重染色及VM判定：CD34陽(yáng)性顆粒在血管內(nèi)皮細(xì)胞漿/膜表達(dá)，PAS陽(yáng)性在血管腔壁基膜表達(dá)，呈紫紅色或櫻桃紅色。具體判定標(biāo)準(zhǔn)為：由CD34陰性腫瘤細(xì)胞（在HE光鏡下確認(rèn)）圍成的內(nèi)有一層不規(guī)則血管狀結(jié)構(gòu)的PAS陽(yáng)性基膜樣物質(zhì)，有時(shí)其內(nèi)可見(jiàn)紅細(xì)胞，管路周圍無(wú)出血、壞死及明顯炎細(xì)胞，判定為VM。其中，CD34和PAS均為正向表達(dá)的規(guī)則環(huán)狀物質(zhì)，被排除為內(nèi)皮血管。

3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以X±S表示計(jì)量數(shù)據(jù)計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)，并加以采納。將檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)定為α=0.05，在p值小于0.05的情況下，會(huì)認(rèn)為差值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 人胃癌組織中VM表達(dá)情況分析

這項(xiàng)研究在術(shù)后對(duì)50名胃癌患者實(shí)施了蠟塊VM表達(dá)的組織檢測(cè)。研究結(jié)果顯示，的確有VM現(xiàn)象存在于胃癌患者身上。研究發(fā)現(xiàn)，50例胃癌患者中，VM表達(dá)（+）的患者有。此外，VM陽(yáng)性表達(dá)與統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有一定意義（p<0.05）的腫瘤組織分化較差、臨床分期較高、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等有關(guān)。

4.2 人胃癌組織中VM蛋白和EMT蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在11例VM陽(yáng)性結(jié)腸癌組織中，Vimentin的高表達(dá)率為63.7%，而E-cadherin的低表達(dá)率為18.2%。相比之下，在VM陰性組中，Vimentin的低表達(dá)率為15.4%，E-cadherin的低表達(dá)率為74.4%（詳見(jiàn)表1）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，VM陽(yáng)性組與陰性組的E-cadherin的胃癌細(xì)胞在表達(dá)方式（p<0.05）上存在顯著差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明，在有VM的胃癌組織中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）更容易發(fā)生在腫瘤細(xì)胞中，表達(dá)的Vimentin和E-cadherin有相關(guān)性。

4.3 Twist和EMT蛋白在胃癌組織中的表達(dá)

在50例胃癌組織標(biāo)本中，Twist蛋白表達(dá)陽(yáng)性的病例數(shù)為35例（70.00%），E-cadherin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的病例數(shù)為19例（38.00%），維門汀蛋白表達(dá)陽(yáng)性的病例數(shù)為24例（48.00%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Twist蛋白在表達(dá)上（p=0.000）在胃癌組織中差異明顯（表2）。

研究的50例胃癌組織標(biāo)本中，35例顯示Twist蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其中19例胃癌組織呈現(xiàn)E-cadherin蛋白表達(dá)陽(yáng)性。此外，在15例Twist蛋白呈陰性表達(dá)的胃癌組織中，有11例患者出現(xiàn)E-cadherin蛋白呈陰性表達(dá)。Spearman等對(duì)這兩種蛋白的相關(guān)性分析表明：Twist蛋白E-cadherin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)系數(shù)為0.544，其相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.010）。此外，35例表達(dá)Twist蛋白陽(yáng)性的胃癌組織中，24例顯示Vimentin蛋白表達(dá)陽(yáng)性；然而，在15例Twist蛋白呈陰性表達(dá)的胃癌組織中，有12例患者出現(xiàn)Vimentin蛋白呈陰性表達(dá)。Spearman等對(duì)這兩種蛋白的相關(guān)性分析表明：Twist蛋白Vimentin蛋白表達(dá)呈正相關(guān)系數(shù)為0.362，其相關(guān)性具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.010）。

5 討論

TWIST基因是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，已被證明在多種癌癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其在胃癌的發(fā)展中具有顯著影響［8］，且該研究表明TWIST通過(guò)調(diào)控細(xì)胞黏附、遷移和侵襲相關(guān)基因，引導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化使癌細(xì)胞失去上皮細(xì)胞獨(dú)有的結(jié)構(gòu)，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特征，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。TWIST還參與了胃癌組織中的易化血管生成擬態(tài)，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生擬態(tài)變化，表現(xiàn)出腫瘤相關(guān)的血管生成特征［9］。這進(jìn)一步支持了腫瘤的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。在分子水平上，TWIST通過(guò)與其他轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路相互作用，調(diào)控了一系列與癌細(xì)胞生物學(xué)特征相關(guān)的基因表達(dá)，這包括促進(jìn)細(xì)胞周期的變化、抑制凋亡、增強(qiáng)細(xì)胞遷移和侵襲等關(guān)鍵過(guò)程［10，11］。TWIST的過(guò)度表達(dá)與胃癌的臨床病理特征、預(yù)后及治療反應(yīng)密切相關(guān)，因此，TWIST基因可能成為胃癌預(yù)后評(píng)估和治療靶點(diǎn)的重要標(biāo)志物［12］。未來(lái)的研究可以重點(diǎn)關(guān)注以下方向：深入挖掘TWIST在信號(hào)通路中的交叉調(diào)控機(jī)制，闡明其與其他關(guān)鍵因子的相互作用；探討TWIST在胃癌早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后中的潛在價(jià)值；開展藥物篩選研究，尋找能夠干預(yù)TWIST作用的新型治療靶點(diǎn)。TWIST作為胃癌發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在診斷、治療和預(yù)后評(píng)估方面具有廣闊的應(yīng)用前景。深入研究TWIST的分子機(jī)制有望為開發(fā)靶向TWIST的治療藥物提供理論基礎(chǔ)，為個(gè)體化治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)奠定基礎(chǔ)。TWIST在人胃癌組織中的作用機(jī)制復(fù)雜而多樣，涉及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和易化血管生成擬態(tài)等多個(gè)方面。未來(lái)的研究和應(yīng)用將有望深化對(duì)TWIST在胃癌中的理解，并為相關(guān)治療策略的制定提供有力支持。

綜上所述，TWIST基因在人胃癌組織中通過(guò)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和易化血管生成擬態(tài)等多個(gè)機(jī)制參與了腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。深入理解TWIST在胃癌中的作用有望為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

參考文獻(xiàn)

［1］Ansieau S，Bastid J，Doreau A，et al．Induction of EMT by twist proteins as a collateral effect of tumor-promoting inactivation of premature senescence［J］．Cancer Cell，2008，14（1）：79-89．

［2］Wang RX，Ou XW，Kang MF，et al．Association of HIF-1α and NDRG2 Expression with EMT in Gastric Cancer Tissues［J］．Open Life Sci，2019，14：217-223．

［3］Folkman J．Tumor angiogenesis：therapeutic implications［J］．N Engl J Med，1971，285（21）：1182-1186．

［4］Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al．Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro：vasculogenic mimicry［J］．Am J Pathol， 1999，155（3）：739-752．

［5］Fan YL，Zheng M，Tang YL，et al．A new perspective of vasculogenic mimicry：EMT and cancer stem cells［J］．Oncol Lett，2013，6（5）：1174-1180．

［6］Lin AY，Ai Z，Lee SC，et al．Comparing vasculogenic mimicry with endothelial cell-lined vessels：techniques for 3D reconstruction and quantitative analysis of tissue components from archival paraffin blocks［J］．Appl Immunohistochem Mol Morphol，2007，15（1）：113-119．

［7］Creighton CJ，Gibbons DL，Kurie JM．The role of epithelial-mesenchymal transition programming in invasion and metastasis：a clinical perspective［J］．Cancer Manag Res，2013，5：187-195．

［8］Xin Y，Ning S，Zhang L，et al．CDC27 Facilitates Gastric Cancer Cell Proliferation，Invasion and Metastasis via Twist-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition［J］．Cell Physiol Biochem，2018，50（2）：501-511．

［9］Zang C，Liu X，Li B，et al．IL-6/STAT3/TWIST inhibition reverses ionizing radiation-induced EMT and radioresistance in esophageal squamous carcinoma［J］．Oncotarget，2017，8（7）：11228-11238．

［10］Wang J，Wang T，Zhang Y，et al．CPEB1 enhances erastin-induced ferroptosis in gastric cancer cells by suppressing twist1 expression［J］．IUBMB Life，2021，73（9）：1180-1190．

［11］Yin Y，Li X，Guo Z，et al．MicroRNA?381 regulates the growth of gastric cancer cell by targeting TWIST1［J］．Mol Med Rep，2019，20（5）：4376-4382．

［12］Yu G，Chen W，Li X，et al．TWIST1-EP300 Expedites Gastric Cancer Cell Resistance to Apatinib by Activating the Expression of COL1A2［J］．Anal Cell Pathol，2022．

Investigation of the Mechanisms by which Twist Regulates Epithelial-mesenchymal Transition and

Vasculogenic Mimicry in Human Gastric Cancer Tissues

Yu Qi1 Zhang Zhaokun1 E Sihan1 Li Lulu2 Xu Wanpeng3

1. Weifang Medical University， weifang;

2. The Hospital affiliated with WeiFang Medical College Department of Pathology， weifang;

3. The Hospital affiliated with WeiFang Medical College Gastrointestinal surgery， weifang

Abstract： Objective： The aim of this study was to investigate the role of Twist in promoting Vasculogenic Mimicry， thereby enriching and enhancing the theory of vasculogenic mimicry. Methods： The expression of Twist， Epithelial-mesenchymal Transition markers （E-cadherin and Vimentin）， and VM marker CD34-PAS were observed in gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues. The correlation between Twist， EMT markers， and clinical pathological features of gastric carcinoma was analyzed. The relationship between VM and EMT markers， as well as Twist and EMT markers， was studied. Furthermore， the involvement of Twist in promoting gastric carcinoma EMT and VM formation was validated. Results： Significant differences were observed in the expression of EMT markers （E-cadherin and Vimentin） and VM marker CD34-PAS. Twist showed a certain correlation with EMT markers. Conclusion： Twist may induce EMT in gastric carcinoma cells and promote the formation of VM in gastric carcinoma. Note The translation provided aims to align with the language style typically used in scientific publications.

Key Words： EMT; Twist; Invasion， Correlation