不同海拔急性髓系白血病患者化療前后血清及骨髓造血因子表達水平差異研究

孫琦，周厚法，李文倩，解友邦，王愛博

1.810016 青海省西寧市，青海大學研究生院

2.277000 山東省棗莊市立醫院消化科

3.810000 青海省西寧市，青海省人民醫院血液科

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一種造血干、祖細胞的惡性克隆性疾病。化療作為AML患者重要的治療手段，在發揮療效的同時也產生一定的毒副作用，其中最常見的毒副作用是骨髓抑制，是導致化療藥物劑量減量、治療受限甚至中止治療的重要原因之一［1］。在臨床中發現中海拔環境下，即使沒有身體因素和年齡因素的影響，給予標準劑量的治療方案后，AML患者的骨髓抑制明顯加重，骨髓造血功能恢復時間明顯延長，最長能達到4～5周。骨髓中各類血細胞的發育增殖、分化受到多種造血因子的調控，主要有正性調節因子，如促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）、FMS樣酪氨酸激酶3配體（FMS-like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3-L）、促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）、白介素（interleukin，IL）-3、IL-6等，負性調控因子如干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等。EPO主要促進紅細胞的生成，對巨核系造血也具有一定的輔助作用［2］。Flt3-L通過刺激造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）的增殖和分化促進造血。IL-3可與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子協同造血，并具有重疊活性，主要作用于早、中期造血祖細胞的增殖、分化。多種造血因子相互作用才能使造血細胞的增殖更新處于穩態，正、負調節的失常在AML化療后骨髓抑制發病機制中具有十分重要的地位。

研究不同海拔AML患者化療后骨髓抑制期間骨髓及血清造血因子表達水平是否存在差異，探討存在差異的造血因子在骨髓抑制恢復中的作用，為導致不同海拔骨髓抑制差異的原因提供研究方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021—2022年青海省人民醫院血液科（中海拔地區1 501～2 500 m）及中國人民解放軍空軍軍醫大學西京醫院血液科（低海拔地區500～1 500 m）首診初治的28例AML患者（非M3型）為研究對象，根據就診醫院海拔高低將AML患者分為中海拔組（13例）和低海拔組（15例）。納入標準：（1）滿足國際最新的細胞形態學（morphology）、免疫學（immunology）、細胞遺傳學（cytogenetics）和分子生物學（molecular biology）分型，即MICM分型診斷模式，分型采用急性白血病FAB標準，明確診斷為AML；（2）采用標準方案化療患者。排除標準：（1）治療相關性AML；（2）合并嚴重急、慢性感染性疾病；（3）存在化療禁忌證或未完成1個周期化療。本研究已獲得青海省人民醫院倫理審查通過（倫理批件號：2022-25），且患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

AML患者均采取常規的誘導緩解治療方案：標準劑量阿糖胞苷［賽德薩，輝瑞制藥（無錫）有限公司，0.1 g］100～200 mg·m-2·d-1×7 d聯合去甲氧柔紅霉素（艾諾寧，瀚暉制藥有限公司，5 mg）12 mg·m-2·d-1×3 d或柔紅霉素（初潔，山東新時代藥業有限公司，20 mg）60～90 mg·m-2·d-1×3 d。

1.3 觀察指標

1.3.1 骨髓抑制分度評估：采用WHO抗癌藥物急性及亞急性毒性反應分級標準評估患者化療第8、14、28天骨髓抑制分度。

1.3.2 造血因子表達水平測定：使用血清生化管于化療前、給予標準初次化療第8天（僅外周）以及第28天收集外周血及骨髓液樣本2 mL，4 ℃下離心（1 600 r/min）10 min后取上清液，4 ℃下超速離心（12 000 r/min）2 min，取上層血清0.1 mL置于無菌無酶凍存管，-80 ℃保存，采用酶聯免疫吸附法對患者血清及骨髓上清液EPO、Flt3-L、TPO和IFN-γ水平進行檢測。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 25.0對數據進行整理分析。正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；偏態分布計量資料以M（P25，P75）表示，兩獨立樣本比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗，兩相關樣本偏態分布樣本比較采用Wilcoxon秩和檢驗，多個相關樣本偏態分布資料比較采用Friedman檢驗，組間存在差異時采用Bonferroni法進行分組成對比較；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗（有序多分類結局）。檢驗標準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

兩組患者性別、年齡及FAB分型比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

表1 兩組AML患者一般資料比較Table 1 Comparison of general data of AML patients in the two groups

2.2 兩組AML患者化療第8、14、28天骨髓抑制分度比較

化療第8天，兩組患者骨髓抑制分度比較，差異無統計學意義（Z=-1.284，P=0.199）；化療第14、28天，低海拔組患者骨髓抑制分度均高于中海拔組，差異有統計學意義（Z=-1.975，P=0.048；Z=-2.049，P=0.040），見圖1。

圖1 中、低海拔AML患者骨髓抑制分度比較堆疊圖Figure 1 Stacked plot comparing myelosuppression scores in AML patients at middle and low altitudes

2.3 兩組AML患者化療前后血清造血因子表達水平比較

2.3.1 兩組AML患者化療前后血清EPO表達水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第8天，兩組患者血清EPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組血清EPO表達水平高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）。（2）組內比較：中海拔組化療第28天血清EPO表達水平低于化療第8天，差異有統計學意義（P<0.05）；低海拔組化療前后血清EPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 兩組AML患者化療前后血清造血因子表達水平比較［M（P25，P75）］Table 2 Comparison of serum hematopoietic factor expression levels in two groups of AML patients before and after chemotherapy

2.3.2 兩組AML患者化療前后血清Flt3-L表達水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第28天，低海拔組血清Flt3-L表達水平均高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）；化療第8天，兩組患者血清Flt3-L表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（2）組內比較：兩組患者化療第8天、化療第28天血清Flt3-L表達水平均高于化療前，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3.3 兩組AML患者化療前后血清TPO表達水平比較：（1）組間比較：化療前、化療第8天、化療第28天，低海拔組血清TPO表達水平均高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）。（2）組內比較：中海拔組化療前后血清TPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；低海拔組患者化療第8天血清TPO表達水平低于化療前，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3.4 兩組AML患者化療前后血清IFN-γ表達水平比較：兩組患者化療前后血清IFN-γ表達水平組間、組內比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.4 兩組AML患者化療前后骨髓造血因子表達水平比較

2.4.1 兩組AML患者化療前后骨髓EPO表達水平比較：化療前，兩組患者骨髓EPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓EPO表達水平高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組患者化療前后骨髓EPO表達水平比較，差異無統計學意義（P≥0.05），見表3。

表3 兩組AML患者化療前后骨髓造血因子表達水平比較［M（P25，P75）］Table 3 Comparison of bone marrow hematopoietic factor expression levels in two groups of AML patients before and after chemotherapy

2.4.2 兩組AML患者化療前后骨髓Flt3-L表達水平比較：化療前，兩組患者骨髓Flt3-L表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓Flt3-L表達水平高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組患者化療第28天骨髓Flt3-L表達水平均高于化療前，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.4.3 兩組AML患者化療前后骨髓TPO表達水平比較：化療前，兩組患者骨髓TPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組骨髓TPO表達水平高于中海拔組，差異有統計學意義（P<0.05）。中海拔組化療第28天骨髓TPO表達水平低于化療前，差異有統計學意義（P<0.05）；低海拔組化療前后骨髓TPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），見表3。

2.4.4 兩組AML患者化療前后骨髓IFN-γ表達水平比較：兩組患者化療前后骨髓IFN-γ表達水平組間、組內比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表3。

3 討論

AML患者化療后最常見的毒副作用是骨髓抑制，這是導致化療藥物劑量減量、治療受限甚至中止治療的重要原因之一［1］。化療后骨髓抑制已嚴重威脅惡性腫瘤患者的生存率及生存質量，需要在預防及管理上做出及時而有效的措施，這也是臨床AML患者治療中的一項棘手工作。李國元等［3］采用隨機自身對照的研究方法針對不同海拔地區化療后骨髓抑制展開研究，發現患者在高海拔時骨髓抑制程度較中海拔嚴重，且使用粒細胞集落刺激因子治療有效率降低。

3.1 EPO表達水平的改變

EPO主要由腎臟和肝臟細胞產生，刺激骨髓內HSC增殖和分化，主要促進紅細胞的生成，對巨核系造血也具有一定的輔助作用［2］。EPO的產生受到多種因素的調節，其中最主要的是氧氣濃度與紅細胞數量［4］。當身體缺氧或紅細胞數量降低時，腎臟會感知到缺氧信號，缺氧誘導因子1α 和EPO基因位于3'末端的增強子中的氧敏感反應元件相結合，激活腎臟上皮細胞中EPO基因的轉錄因子，從而促進EPO基因的表達和轉錄［5］。SAWABE等［6］選取了12例血液系統惡性腫瘤患者并對其血清EPO表達水平進行了多療程長期監測，研究結果顯示化療開始后血清EPO表達水平很快升高，達峰值時間約為12.8 d，并在化療停止后降低，且這種變化與化療方案無關。該研究還對患者血清EPO表達水平與Hb濃度進行了相關性分析，發現在相同Hb濃度下，化療期間EPO表達水平高于化療前，因此推測在化療期間EPO表達水平主要受骨髓抑制而非Hb濃度的影響。

本研究發現化療第8天血清EPO表達水平較治療前有上升趨勢但差異無統計學意義，化療第28天時血清EPO表達水平處于回落階段。化療第8天血清EPO表達水平較化療前有升高趨勢，提示化療后骨髓抑制期間機體造血功能的恢復需要EPO的支持，化療第28天血清EPO表達水平較化療第8天降低可能是由于機體造血功能已處于恢復階段所致。

通過對化療前、化療第8天及化療第28天3個時間點兩組患者血清及骨髓EPO表達水平的分析，化療前，兩組患者血清及骨髓EPO表達水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）；化療第28天，低海拔組血清及骨髓EPO表達水平高于中海拔組（P<0.05）。可能是由于低海拔化療第28天EPO表達水平更高，促進了低海拔AML患者骨髓抑制的恢復。盡管低氧可促進EPO的表達，但BASAK等［7］研究發現久居高海拔地區的健康人與低海拔地區健康人EPO水平差異無統計學意義，研究表明，當低海拔居民訪問高海拔地區時，急性缺氧暴露后血清EPO水平升高，以適應高原低氧環境，當機體通過自身調節適應高海拔環境后EPO水平將恢復到暴露前的水平。因此，推測海拔導致血清EPO水平升高主要集中在從低海拔地區前往高海拔地區的個人，而對于長期居住兩地的健康者來說，血清EPO表達水平差異無統計學意義。本課題研究對象均為長期居住于各自海拔的AML患者，海拔因素在化療期間對EPO的分泌起到的作用及其機制尚未闡明，仍需進一步研究。此外，由于本試驗僅選取了中海拔AML患者，并未納入高海拔患者，且樣本量較小，后續仍需進一步擴大樣本量進行驗證。

3.2 Flt3-L表達水平的改變

Flt3-L主要由骨髓基質細胞、上皮細胞和造血細胞產生，Flt3-L通過與受體結合，與其他造血細胞生長因子協同促進HSC的自我更新及造血祖細胞的增殖和分化，同時也可促進淋巴細胞的增生［8-9］。2001年，BRUSERUD等［10］發現治療前白血病患者（包括AML和ALL）血漿Flt3-L水平與健康對照組相當，在化療期間表達水平升高。SATO等［11］的研究顯示血漿Flt3-L的濃度在化療開始后升高，在第15天達到峰值，然后在第25天降至基線。KUNCMAN等［12］發現直腸腺癌患者放化療后外周血中Flt3-L的濃度在前兩周增加，并在放化療結束前保持在類似水平，且Flt3-L濃度的初始增加量與活性骨髓的劑量/體積相關。2019年，DEMMERATH等［13］將人CD34+細胞移植到3 Gy照射的骨髓抑制小鼠中，使用Flt3-L和TPO反復治療，發現Flt3-L和TPO組合使用可通過抑制促細胞凋亡BCL-2蛋白BIM和BMF的轉錄，在治療第7天導致骨髓中的人類細胞相對增加，脾臟中的人類細胞數量略有增加，在一定程度上促進了體內人的造血再生。

本研究結果顯示，兩組患者化療第8天及化療第28天血清Flt3-L表達水平均較治療前顯著上升，提示化療后骨髓抑制期間機體造血功能的恢復需要Flt3-L的支持，且這一趨勢在骨髓與血清中表現相同。化療第28天，低海拔組血清及骨髓Flt3-L表達水平高于中海拔組（P<0.05）。通過對不同海拔患者臨床資料的分析發現中海拔骨髓抑制分度較低海拔更為嚴重，可能由于低海拔化療后Flt3-L表達水平更高，可促進HSC的增殖并通過增加HSC中Bcl-2一種抗凋亡蛋白促進HSC存活［14］，從而促進了低海拔AML患者化療后骨髓抑制的恢復。此外，有研究指出，當骨髓造血微環境受損時，機體Flt3-L表達水平明顯降低［15］，因此，當患者接受多次化療，導致機體骨髓基質損傷后，Flt3-L水平可一直低于正常水平。由于本研究以初次診斷AML患者為研究對象，對于多周期化療后不同海拔AML患者Flt3-L表達水平是否存在差異仍需進一步研究。

3.3 TPO表達水平的改變

TPO是一種蛋白質類激素，在人體內可由多個部位產生，主要包括肝臟、腎臟、骨髓間充質細胞等，經血液中循環輸送到骨髓，通過與促血小板生成素受體（MPL）結合，形成一種關鍵的造血細胞因子信號復合物，即TPO-MPL復合物，從而激活多種信號通路，主要促進巨核細胞、血小板的生成和增殖［16-17］。近年來的一些研究也證實EPO在HSC的靜止、自我更新、增殖與分化中也起重要作用［18］。DEMMERATH等［13］提出TPO是通過抑制促凋亡效應蛋白促進造血細胞的存活而不是促進造血祖細胞增殖，這將不會導致造血祖細胞過早衰竭。國內學者吳永霞等［19］發現血清TPO水平在化療10 d顯著下降，而化療15 d有所上升，但仍低于治療前。考慮化療前由于白血病細胞浸潤骨髓抑制巨核系造血，機體負反饋導致血清TPO水平升高。但國外學者的研究卻發現AML患者化療后骨髓抑制期間TPO水平顯著增加，但隨后降至健康對照受試者的水平［20］。

目前對于AML患者化療前后TPO表達水平變化仍存在爭議，本研究結果顯示，兩組患者化療后血清及骨髓TPO表達水平較化療前有下降趨勢；化療第28天，低海拔組血清及骨髓TPO表達水平高于中海拔組（P<0.05）。

通過對兩組患者骨髓抑制分度的分析發現，中海拔組患者骨髓抑制更重，考慮可能是由于低海拔化療第28天TPO表達水平更高，促進了低海拔AML患者骨髓抑制的恢復，目前對于不同海拔TPO表達水平的研究較少，海拔因素如何調節TPO的分泌仍需進一步研究。由于本研究樣本量較小，且AML患者血小板低于20×109/L時進行輸注血小板，可能對機體TPO表達水平造成一定影響，后續應擴大樣本量、多時間段監測，并在患者輸注血小板前進行采樣，盡量減少血小板輸注對機體TPO表達水平的影響，進一步驗證兩組患者化療后TPO表達水平的差異。

3.4 IFN-γ表達水平的改變

IFN-γ是造血的重要負調節因子。IFN-γ的上調被認為是骨髓造血祖細胞破壞的關鍵分子事件，在再生障礙性貧血及免疫介導的骨髓衰竭中均發現了TNF-α與IFN-γ的上調［21］。IFN-γ對造血負調控主要表現在以下幾個方面：（1）在體外抑制造血祖細胞的增殖；（2）IFN-γ刺激骨髓中造血祖細胞Fas的表達，通過激活T細胞中Fas/FasL凋亡信號通路損傷造血祖細胞［22］。本研究結果顯示，兩組患者化療前后血清及骨髓IFN-γ表達水平在組間及組內比較均未見明顯差異，提示在化療后骨髓抑制期間骨髓的恢復可能以造血生長因子升高促進造血為主，而不是降低造血負調控因子的表達水平。

4 小結

綜上所述，本研究發現低海拔AML患者化療后骨髓抑制恢復期間造血生長因子EPO、Flt3-L、TPO表達水平高于中海拔AML患者，造血抑制因子IFN-γ表達水平在兩組間無明顯差異，這可能是導致中海拔AML患者化療后骨髓抑制程度重、時間長的重要因素，由于本研究僅對于造血因子表達差異進行了研究，并未深入研究不同海拔相對缺氧的環境特點如何調控差異造血因子的分泌，故今后將進一步探索不同海拔對各差異造血因子的調控機制，為中海拔AML患者化療后骨髓抑制管理提供新思路。

致謝：感謝中國人民解放軍空軍軍醫大學西京醫院血液科為本研究提供協助與支持。

作者貢獻：孫琦提出主要研究目標，負責研究的構思與設計，研究的實施，撰寫論文；孫琦、周厚法、王愛博進行標本的采集，數據的收集與整理，統計學處理，表的繪制與展示；李文倩、解友邦進行論文的修訂；李文倩負責文章的質量控制與審查，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。