苦豆堿通過調控miR－210對脂多糖致心肌細胞凋亡及炎性因子表達的影響

初毅　代寧　曹艷杰

摘要 目的：探討苦豆堿對脂多糖（LPS）致心肌細胞凋亡和炎癥反應的影響。方法：將大鼠心肌H9c2細胞分為NC組（不作任何處理）、LPS組、LPS＋苦豆堿低劑量組、LPS＋苦豆堿中劑量組、LPS＋苦豆堿高劑量組、LPS＋miR－NC組、LPS＋miR－210組、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－NC組、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－210組。通過細胞計數試劑盒－8（CCK－8）、流式細胞術、蛋白免疫印跡法檢測細胞增殖、凋亡及其相關蛋白表達情況；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測白細胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）水平；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT－PCR）檢測miR－210表達水平。結果：不同濃度苦豆堿處理后，LPS處理的心肌細胞活性及Ki－67、Bcl－2、miR－210蛋白表達水平增加，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。過表達miR－210后LPS處理的心肌細胞活性、Ki－67、Bcl－2表達水平增加，細胞凋亡率及p21、Bax表達水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。干擾miR－210表達能逆轉苦豆堿對LPS誘導的H9c2細胞增殖、凋亡及炎性因子的影響。結論：苦豆堿可通過上調miR－210抑制LPS致心肌細胞凋亡和炎癥反應。

關鍵詞 苦豆堿；miR－210；脂多糖；心肌細胞凋亡；炎性因子；白細胞介素－1β；腫瘤壞死因子－α；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.009

心血管疾病為臨床高發病，嚴重威脅著人民的身體健康，常見的心血管疾病有心律失常、心肌缺血、心肌梗死等，近年來中醫藥在治療心血管疾病方面表現出獨特優勢，療效確切，安全性較好［1］。心肌損傷與心血管疾病的發生發展密切相關，而細胞凋亡與炎癥反應在心肌損傷的發生中起重要作用［2－3］。苦豆堿是從豆科植物苦豆草的種子及地上部分提取的一種生物堿，具有抗菌、抗炎、抗心律失常和心肌保護等作用［4］。苦豆堿可通過抑制炎癥反應改善異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌肥厚［5］。苦豆堿可通過激活磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信號通路抗心肌細胞缺血再灌注引起的損傷及炎癥應答［6］；對野百合堿誘導的大鼠肺動脈高壓具有保護作用［7］；可抑制氧化型低密度脂蛋白（ox－LDL）誘導的人臍靜脈血管內皮細胞的內皮功能障礙和炎癥反應［8］。以上研究均表明苦豆堿具有抗損傷及抗炎作用。但苦豆堿對脂多糖（LPS）誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應的影響及機制尚不清楚。miR－210是相關miRNA的一種，對心肌細胞凋亡和改善心臟功能具有重要作用；miR－210有望成為預測或診斷心血管疾病的標志物［9］。miR－210抑制過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡和自噬［10］，miR－210過表達可通過促進心肌細胞增殖和血管生成，促進心肌梗死后的心臟修復［11］。因此，本研究旨在探討苦豆堿是否通過調控miR－210影響LPS誘導的心肌細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大鼠心肌H9c2細胞購于美國ATCC；LPS購于北京百奧萊博科技有限公司；DMEM購于美國Gibco公司；苦豆堿購于上海源葉生物科技有限公司；細胞計數試劑盒－8（CCK－8）試劑盒、凋亡試劑盒購于日本同仁化學研究所；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購于美國Pierce公司；熒光定量試劑盒購于上海經科化學公司；白細胞介素－1β（IL－1β）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于南京森貝伽生物公司。

1.2 細胞處理與分組

H9c2細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，取生長狀態良好的H9c2細胞，將其隨機分為NC組（不做任何處理）、LPS組（加入0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆堿低劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和20 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿中劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和50 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿高劑量組（加入0.5 μg/mL的LPS和100 mg/L苦豆堿）、LPS＋miR－NC組（轉染miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋miR－210組（轉染miR－210＋0.5 μg/mL的LPS）、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－NC組（轉染anti－miR－NC＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆堿）、LPS＋苦豆堿中劑量組＋anti－miR－210組（轉染anti－miR－210＋0.5 μg/mL的LPS＋和50 mg/L苦豆堿）。miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210轉染的具體步驟：取50 μL無血清培養基稀釋miR－NC、miR－210、anti－miR－NC、anti－miR－210的質粒，混勻；同時取50 μL無血清培養基稀釋轉染試劑，混勻后室溫靜置5 min，將上述兩種溶液混合，室溫靜置20 min，然后將其與培養至80%融合度的細胞混合，轉染6 h后進行藥物處理。

1.3 CCK－8檢測細胞增殖

取培養48 h的細胞，加10 μL的CCK－8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm波長處OD值。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡

取各組培養48 h的細胞，預冷后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）漂洗，加入V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）10 μL，再加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）5 μL，避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測相關蛋白表達

提取總蛋白，BCA試劑盒定量；行電泳后聚偏二氟乙烯（PVDF）轉膜，接著封閉在5%脫脂奶粉中，加一抗4 ℃孵育過夜；加二抗室溫孵育90 min，增強化學發光試劑（enhanced chemiluminescence，ECL）發光液顯影，成像后檢測蛋白條帶灰度值，蛋白相對表達水平等于目的條帶和β－actin條帶灰度值的比值。

1.6 ELISA檢測IL－1β、TNF－α水平

各組細胞培養48 h，按照IL－1β、TNF－α試劑盒說明操作，酶標儀檢測450 nm波長處OD值，根據標準曲線計算上清液中IL－1β、TNF－α水平。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT－qPCR）檢測miR－210表達水平

提取各組H9c2細胞總RNA，反轉錄成cDNA，進行RT－qPCR，以U6為內參，相對表達量用2－△△Ct法計算。miR－210正向引物：5′－ATGCCTGTGCGTGTGA－3′，反向引物：5′－GTGCGTGTCGTGGAGTC－3′。

1.8 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同濃度苦豆堿對LPS誘導H9c2細胞增殖、凋亡的影響

與NC組比較，LPS組細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達水平降低，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達水平升高，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。詳見圖1、表1、圖2。

2.2 不同濃度苦豆堿對LPS誘導H9c2細胞炎性因子的影響

與NC組比較，LPS組IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 不同濃度苦豆堿對LPS誘導H9c2細胞miR－210表達的影響

與NC組比較，LPS組H9c2細胞中miR－210表達水平降低（P＜0.05）；與LPS組比較，不同濃度苦豆堿組H9c2細胞中miR－210表達水平升高（P＜0.05）。詳見表3。

2.4 過表達miR－210對LPS誘導H9c2細胞增殖和凋亡的影響

與LPS＋miR－NC組比較，LPS＋miR－210組miR－210表達水平、細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達水平升高，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平降低，差異均有統計學意義（P＜0.001）。詳見表4、圖3、圖4。

2.5 過表達miR－210對LPS誘導H9c2細胞炎性因子的影響

與LPS＋miR－NC組比較，LPS＋miR－210組IL－1β、TNF－α水平降低（P＜0.001）。詳見表5。

2.6 干擾miR－210表達能逆轉苦豆堿對LPS誘導H9c2細胞增殖、凋亡及炎性因子的影響

與LPS＋苦豆堿中劑量＋anti－miR－NC組比較，LPS＋苦豆堿中劑量＋anti－miR－210組miR－210表達水平、細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達水平降低，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平升高，IL－1β、TNF－α水平升高（P＜0.05）。詳見圖5、圖6、表6。

3 討 論心肌細胞凋亡與多種心血管疾病有關，而許多心血管疾病都伴隨著炎癥反應的發生，抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應對防治心血管疾病具有重要意義。最近的研究顯示，中醫藥治療可抑制心肌細胞凋亡和炎癥反應［12－13］。有研究報道，苦豆堿對海馬神經元氧糖剝奪再灌注損傷具有明顯的保護作用［14］。苦豆堿可抑制心肌細胞凋亡，從而減輕冠狀動脈微栓塞引起的心肌損傷［15］；可通過調控核轉錄因子－κB（NF－κB）信號通路，降低炎性因子TNF－α及IL－1β水平，從而改善哮喘小鼠肺功能，減輕哮喘癥狀及炎癥反應［16］；可通過抑制炎癥反應來抑制人肺血管平滑肌細胞增殖［17］。本研究發現，不同濃度苦豆堿處理LPS誘導的心肌細胞后，心肌細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達升高，細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平降低，IL－1β、TNF－α水平降低，提示苦豆堿可減輕LPS誘導的心肌細胞損傷。

研究報道，miR－210可以抑制氧葡萄糖剝奪/再灌注誘導的心肌細胞凋亡［18］。miR－210可減輕心肌梗死后心臟細胞凋亡［19］。本研究結果顯示，不同濃度苦豆堿處理LPS誘導的心肌細胞中，增加miR－210表達水平；過表達miR－210增加LPS處理的心肌細胞活性及Ki－67、Bcl－2蛋白表達水平，降低細胞凋亡率及p21、Bax蛋白表達水平，降低IL－1β、TNF－α水平。表明過表達miR－210抑制了LPS誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應，與以往研究結果相符，miR－210具有抑制心肌細胞凋亡的作用。還有研究報道miR－210具有抗炎作用，如miR－210－3p可通過抑制胰島素樣生長因子2（IGF2）減輕動脈粥樣硬化中的炎癥反應［20］。紫草素可能通過上調miR－210減輕LPS誘導的人腎小管上皮細胞（HK－2）炎性損傷［21］。此外，本研究結果顯示，干擾miR－210表達逆轉苦豆堿對LPS誘導的H9c2細胞增殖、凋亡及炎性因子的影響。綜上所述，苦豆堿可通過增加miR－210抑制LPS致心肌細胞凋亡和炎癥反應。

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（收稿日期：2022－09－23）

（本文編輯郭懷印）

引用信息 初毅，代寧，曹艷杰.苦豆堿通過調控miR－210對脂多糖致心肌細胞凋亡及炎性因子表達的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（1）：51－55.