LncRNA HOTAIR調節(jié)細胞自噬對脊髓損傷模型神經元凋亡的保護作用

趙俊　陳勇　吳春芳

摘要 目的：探討長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）在脊髓損傷凋亡和自噬中的作用及相關機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）和模型組（SCI組）。構建缺氧缺糖誘導的SY－SH5Y細胞模型（OGD模型），將SY－SH5Y細胞分為Control組、OGD組、OGD＋Vector組、OGD＋pcDNA－HOTAIR組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組。通過脊髓損傷運動功能（BBB）評分評估大鼠運動功能的恢復能力；通過雙熒光素酶報告基因實驗分別檢測HOTAIR和miR－17、miR－17和Beclin－1之間的靶向關系；實時定量聚合酶鏈反應（RT－qPCR）檢測大鼠脊髓組織和細胞中HOTAIR、miR－17、Beclin－1 mRNA的表達；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測大鼠脊髓組織和細胞中Beclin－1、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、P62蛋白的表達；流式細胞術檢測各組細胞凋亡情況。結果：與Sham組比較，SCI組大鼠BBB評分下降，脊髓組織中HOTAIR水平降低，miR－17水平升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Control組比較，OGD組處理的SY－SH5Y細胞中HOTAIR水平降低，miR－17水平升高，神經元凋亡率升高，LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中HOTAIR水平升高（P＜0.05），神經元凋亡率降低（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表達升高（P＜0.05），P62蛋白表達降低（P＜0.05），而自噬抑制劑3－甲基腺嘌呤（3－MA）逆轉了這一結果（P＜0.05）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，Beclin－1是miR－17的靶基因，miR－17是HOTAIR的靶基因。與OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組細胞中miR－17表達明顯升高，神經元凋亡率明顯升高，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：LncRNA HOTAIR通過靶向miR－17/Beclin－1通路增強自噬，從而減輕神經元凋亡和改善脊髓損傷。

關鍵詞 脊髓損傷；長鏈非編碼核糖核酸；HOX轉錄反義RNA；細胞自噬；神經元凋亡

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.01.014

脊髓損傷（SCI）是血管外科、胸外科、脊柱外科手術中常見的并發(fā)癥，可引起損傷脊髓節(jié)段肢體運動和感覺功能障礙，嚴重威脅人類健康和生命［1］。神經元凋亡是脊髓損傷中的主要病理特征之一，導致一定程度的神經損傷、壞死或自主神經功能障礙［2－3］。然而，細胞凋亡并不是決定細胞命運的唯一途徑，自噬與凋亡相互作用［4］。自噬又稱Ⅱ型程序性細胞死亡，可清除細胞生長和衰老過程中多余或損傷的細胞器，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［5］。研究表明，在脊髓損傷模型大鼠中，自噬已被證實通過抑制脊髓損傷后的神經元凋亡來減少神經元損傷和促進運動恢復［6］。長鏈非編碼核糖核酸（LncRNA）是一類核苷酸長度超過200的非編碼RNA，它們在多種生物和病理過程中廣泛調節(jié)基因表達。HOX轉錄反義RNA（HOTAIR）位于12號染色體，與多種人類疾病有關，包括癌癥和心肌損傷［7－8］。HOTAIR影響神經元凋亡，HOTAIR通過調節(jié)miR－874－5p促進帕金森病介導的神經元損傷［9］。然而，關于HOTAIR在脊髓損傷中對神經元凋亡的作用機制尚未明確。因此，本研究探討LncRNA HOTAIR在脊髓損傷神經細胞凋亡和自噬中的作用，旨在為脊髓損傷治療提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；pcDNA－HOTAIR、Vector、miR－17 mimic及NC mimic質粒購自漢恒生物科技（上海）有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白質測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自Invitrogen公司；V－異硫氰酸熒光素（Annexin V－FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自Sigma－Aldrich中國公司。流式細胞儀購自BD公司；低氧培養(yǎng)箱購自Thermo Scientific公司；ABI 7500 實時PCR系統(tǒng)購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗動物

雄性SD大鼠，體質量200～230 g，由河南省實驗動物中心提供，飼養(yǎng)在標準溫度（23～25 ℃）、濕度（50%～60%）的環(huán)境條件下，12 h光/暗循環(huán)，所有動物均可自由獲得食物和水。本研究的動物實驗均按照中國衛(wèi)生研究院《實驗動物護理使用指南》進行，并經我院倫理委員會批準。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建脊髓損傷模型

將大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、模型組（SCI組）。模型組構建脊髓損傷模型：將大鼠麻醉后俯臥位于手術臺上，消毒備皮。逐層解剖暴露大鼠脊柱，在T9和T10棘突處行椎板切除術以徹底暴露脊髓。然后用10 g的重物從5 cm高的地方落下?lián)舸蚣顾璞砻妫斐杉顾钃p傷。當觀察到雙下肢癱瘓、尾巴擺動和脊髓血腫形成，表明脊髓損傷模型的成功建立。隨后，用生理鹽水清洗傷口，將肌肉和皮膚分層縫合。Sham組大鼠僅進行椎板切除術。脊髓損傷術后，每天按摩大鼠膀胱2次，直至自主排尿功能恢復。為了驗證HOTAIR在脊髓損傷體內進展中的作用，通過建立脊髓損傷大鼠模型，將5 μL pcDNA－HOTAIR及其陰性對照Vector腺病毒載體用玻璃微移液管注射到大鼠脊髓（每組6只）。48 h后處死大鼠，取脊髓組織進行后續(xù)實驗。

1.3.2 脊髓損傷運動功能（BBB）評分

采用BBB評分評估大鼠運動功能的恢復能力［10］。分別在大鼠脊髓損傷后1、6、12、24、48 h對大鼠的運動進行雙盲觀察。BBB評分是由2名獨立的調查人員進行盲測。將大鼠置于實驗平臺上，對大鼠的后肢運動進行評分和觀察，每次測試持續(xù)4 min。每只大鼠的最終評分取2名研究者的平均分。

1.3.3 實時定量聚合酶鏈式反應（RT－qPCR）

在脊髓損傷后48 h處死大鼠，取損傷部位上下1 cm的脊髓組織，用Trizol試劑提取總RNA。為了量化HOTAIR和miR－17的表達，使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒根據(jù)其說明書將1 μg RNA逆轉錄為cDNA。LncRNA和miRNA表達水平的相對定量在ABI 7500 實時聚合酶鏈式反應系統(tǒng)上進行，并使用miRcute miRNA熒光定量檢測試劑盒通過2－ΔΔCt方法計算。LncRNA和miRNA的相對表達分別歸一化為甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6表達。

1.3.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）

使用RIPA裂解緩沖液從脊髓組織中獲取總蛋白，并使用BCA蛋白質測定試劑盒測定其蛋白質濃度。將樣品用12%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）分離，并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。隨后，PVDF膜用含5%脫脂牛奶的TBST在室溫下封閉1 h，然后用抗Beclin－1、微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3Ⅱ）、P62的一抗在4 ℃孵育過夜。用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次后與辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。條帶通過增強化學發(fā)光（ECL）曝光并使用Image J 軟件進行分析。

1.3.5 細胞培養(yǎng)

將人海馬神經元來源的細胞系SY－SH5Y在添加有Eagle′s最低必需培養(yǎng)基（EMEM）、1%非必需氨基酸、2 mmol/L谷氨酰胺、15%胎牛血清的Ham′s F12培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。進行缺氧葡萄糖剝奪（OGD）試驗以通過減少O2和葡萄糖的補充來模擬神經元損傷誘導的缺血病理條件。神經元在OGD溶液中于94%N2、5%CO2、1%O2的受控低氧培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育1 h。然后神經元在含有5.5 mmol/L葡萄糖的OGD溶液中于37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)24 h進行復氧。

1.3.6 細胞轉染

為了研究HOTAIR和miR－17在神經元凋亡中的作用及其相互作用，將SY－SH5Y細胞分為6組：Control組、OGD組、OGD＋Vector組、OGD＋pcDNA－HOTAIR組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組、OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組。根據(jù)說明書使用Lipofectamine 2000將pcDNA－HOTAIR、Vector、miR－17 mimic及NC mimic質粒轉染到SY－SH5Y細胞中。用OGD處理細胞6 h，然后置于含有1 mmol/L自噬抑制劑3－甲基腺嘌呤（3－MA）的正常培養(yǎng)基中并再給氧24 h，收集細胞并進行后續(xù)實驗。

1.3.7 流式細胞術

用膜聯(lián)蛋白V－FITC/Annexin V－FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒測定SY－SH5Y細胞凋亡，然后進行流式細胞分析。將SY－SH5Y細胞（2×105/孔）接種至6孔板中，待其生長融合至70%～80%。收集細胞并用200 μL的Annexin V－FITC和10 μL的PI染色，最后用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因實驗

將HOTAIR－WT、HOTAIR－MUT序列或Beclin－1－野生型（WT）、Beclin－1－突變型（MUT）序列插入熒光素酶報告載體pmirGLO。隨后，使用Lipofectamine 2000將pmirGLO－HOTAIR－WT、pmirGLO－HOTAIR－MUT以及pmirGLO－Beclin－1－WT、pmirGLO－Beclin－1－MUT分別與NC mimic、miR－17 mimic共轉染到SY－SH5Y細胞中。最后，通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析細胞的熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標準差（x±s） 表示，組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 脊髓損傷大鼠脊髓組織和OGD誘導的細胞中HOTAIR、miR－17表達比較

與Sham組比較，SCI組術后1、6、12、24、48 h的BBB評分均明顯下降（P＜0.05）。術后48 h取脊髓組織進行RT－qPCR實驗，結果顯示，與Sham組比較，SCI組大鼠脊髓組織中HOTAIR水平明顯降低（P＜0.05），miR－17水平明顯升高（P＜0.05）；與Control組比較，OGD組處理的SY－SH5Y細胞中HOTAIR水平明顯降低，miR－17水平明顯升高（P＜0.05）。詳見圖1～圖3。

2.2 HOTAIR對自噬和神經元凋亡的影響

與Control組比較，OGD組細胞中HOTAIR水平明顯降低，神經元凋亡率明顯升高，LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中HOTAIR水平明顯升高，神經元凋亡率明顯降低，LC3Ⅱ蛋白表達升高，P62蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋pcDNA－HOTAIR組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋3－MA組細胞中HOTAIR表達無明顯變化（P＞0.05），神經元凋亡率明顯升高（P＜0.05），LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高（P＜0.05）。詳見圖4～圖6。

2.3 HOTAIR靶向miR－17

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic與HOTAIR－3′－UTR－WT共轉染時的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR－17 mimic與HOTAIR－3′－UTR－MUT共轉染時的熒光素酶活性無明顯性變化（P＞0.05）；RT－qPCR實驗結果顯示，與Vector組比較，pcDNA－HOTAIR組細胞中miR－17表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖7。

2.4 miR－17靶向Beclin－1

雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic與Beclin－1－3′－UTR－WT共轉染時的熒光素酶活性明顯降低（P＜0.05），而miR－17 mimic與Beclin－1－3′－UTR－MUT共轉染時的熒光素酶活性無明顯性變化（P＞0.05）；RT－qPCR和Western Blotting實驗結果顯示，與NC mimic組比較，miR－17 mimic組細胞中Beclin－1的mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。詳見圖8～圖10。

2.5 HOTAIR通過miR－17/Beclin－1通路對自噬和凋亡的影響

與OGD＋Vector組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR組細胞中miR－17蛋白表達明顯降低，神經元凋亡率明顯降低，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達升高，P62蛋白表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與OGD＋pcDNA－HOTAIR＋NC mimic組比較，OGD＋pcDNA－HOTAIR＋miR－17 mimic組細胞中miR－17蛋白表達明顯升高，神經元凋亡率明顯升高，Beclin－1和LC3Ⅱ蛋白表達降低，P62蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖11～圖13。

2.6 HOTAIR過表達對脊髓損傷大鼠神經功能的影響

與Vector組比較，pcDNA－HOTAIR組大鼠在脊髓損傷后12～48 h的BBB評分明顯升高，HOTAIR表達升高，miR－17表達降低，LC3Ⅱ蛋白表達明顯升高，而P62蛋白表達明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。詳見圖14～圖15。

3 討 論

脊髓損傷是一種嚴重的神經創(chuàng)傷，但其發(fā)病機制和關鍵影響因素尚未明確闡明。神經元凋亡是神經元丟失的主要因素，與脊髓損傷的發(fā)展有關［11］。研究表明，自噬與脊髓損傷誘導的神經細胞凋亡密切相關［12］。然而，其機制仍有待闡明。本研究通過構建脊髓損傷體內體外模型來闡明LncRNA HOTAIR在脊髓損傷中的作用及其與自噬和凋亡的關系，這一研究可能為脊髓損傷的治療和預后評估提供新的有效靶點。

LncRNAs對細胞自噬或凋亡的調節(jié)作用已在人類疾病中得到證實。如LncRNA MALAT1通過誘導自噬抑制多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡［13］。LncRNAs還可以調節(jié)脊髓損傷的啟動和進展，主要是通過影響細胞自噬或凋亡，如LncRNA SNHG5通過上調Krueppel樣因子4（KLF4）來增強星形膠質細胞和小膠質細胞的活力促進創(chuàng)傷性脊髓損傷［14］。在急性脊髓損傷中，敲除LncRNA BDNF－AS抑制神經元細胞凋亡［15］。抑制LncRNA Sox2ot可減少細胞凋亡和自噬從而抑制脊髓損傷［16］。因此，調節(jié)LncRNA的表達有可能通過抑制自噬來減輕脊髓損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR在OGD處理的SY－SH5Y細胞中降低，且LncRNA HOTAIR抑制細胞凋亡，而當用自噬抑制劑3－MA刺激時，細胞凋亡率升高，表明LncRNA HOTAIR通過誘導自噬抑制神經元凋亡，揭示了LncRNA HOTAIR在脊髓損傷中的神經保護作用，有利于脊髓損傷大鼠的神經功能恢復。因此，選擇LncRNA HOTAIR進行下一步的研究。

證據(jù)表明，大多數(shù)LncRNAs通過作為miRNAs的競爭性內源性RNA（ceRNA）調節(jié)疾病的起始和進展［17］。LncRNA XIST通過競爭性結合miR－494促進脊髓損傷大鼠神經元凋亡，參與脊髓損傷的發(fā)病機制［18］。MALAT1通過調節(jié)miR－204在脊髓缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經保護作用［19］。此外，研究發(fā)現(xiàn)LncRNAs作為ceRNAs在各種疾病的發(fā)展中調節(jié)自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR在脊髓損傷大鼠模型和細胞模型中低表達，而miR－17高表達，并且LncRNA HOTAIR靶向miR－17并負調節(jié)miR－17的表達。此外，本研究進一步發(fā)現(xiàn)，LncRNA HOTAIR通過靶向miR－17增強自噬從而改善神經元細胞凋亡和緩解脊髓損傷。miR－17是一種新型miRNA，與多種癌癥密切相關。研究發(fā)現(xiàn)miR－17－5p通過靶向Runt相關轉錄因子3（RUNX3）促進胃癌細胞增殖和侵襲性［20］。miR－17通過靶向軸突生長誘向因子4（NTN4）誘導乳腺癌生長和轉移［21］。研究表明在脊髓損傷后的神經元損傷中，敲除miR－17可能有助于脊髓損傷治療［22］。然而，miR－17與脊髓損傷之間的關系尚未闡明。Beclin－1是一種關鍵的自噬相關蛋白和凋亡調節(jié)因子［23］，據(jù)報道，在脊髓神經元中，Beclin－1過表達明顯增強自噬并逆轉機械損傷誘導的細胞凋亡，提示Beclin－1在脊髓損傷中促進自噬和保護神經元免于凋亡的作用［24］。此外，白藜蘆醇通過激活自噬和抑制沉默信息調節(jié)因子1（SIRT1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路介導的細胞凋亡來保護脊髓損傷［3］。以上研究表明，Beclin1在調節(jié)自噬、神經元凋亡和脊髓損傷發(fā)展中具有重要作用。本研究證實了miR－17通過調控Beclin－1在自噬、凋亡和脊髓損傷進展中的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR在脊髓損傷大鼠模型和OGD細胞模型中低表達，而miR－17高表達，過表達LncRNA HOTAIR通過miR－17/Beclin－1途徑增強自噬減少神經元細胞凋亡和改善脊髓損傷。因此，本研究可能為脊髓損傷的治療提供新的策略。然而，本研究仍存在一定的局限性。首先，需要探索更多LncRNA HOTAIR的潛在靶點，尋找對神經元自噬、凋亡、脊髓損傷影響最大的最佳miRNA。此外，許多miR－17的其他靶向基因和miR－17的其他內源性競爭RNA也值得在未來進一步研究。

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（收稿日期：2022－02－12）

（本文編輯郭懷印）

基金項目 河南省醫(yī)學科學研究重點課題計劃基金項目（No.202102310398）

引用信息 趙俊，陳勇，吳春芳.LncRNA HOTAIR調節(jié)細胞自噬對脊髓損傷模型神經元凋亡的保護作用［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（1）：79－87.