谷紅注射液對CYP450 酶的抑制和誘導作用的體內外研究

劉凡琪，王婧媛，張露丹，李自強，黃宇虹

天津中醫藥大學第二附屬醫院，天津 300250

隨著中西醫結合的不斷深入及中西藥聯用的日益普遍，因中西藥相互作用而所引起的安全性風險越來越受到關注。細胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）酶是體內參與藥物及其他外源性物質代謝的主要酶系。CYP450 酶活性被抑制或誘導是藥物代謝性相互作用的主要靶點，尤其是CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A，其表達和功能的改變可引起藥動學乃至藥效學的改變[1]。目前，歐美中等國家及國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）出臺的藥物相互作用研究技術指南[2-4]，強調了CYP450 酶在介導藥物相互作用中的作用，并提供了研究方法、評價指標等的指導，但是在中醫藥的適用性尚不強。

谷紅注射液由乙酰谷酰胺和紅花提取物制成，具有抗血栓形成、改善微循環、抗氧自由基等作用[5]，在臨床上常與氯吡格雷、他汀類藥物等聯用治療心腦血管疾病[6-8]。但谷紅注射液藥物相互作用研究尚不完善，本研究結合中藥多成分、多靶點的自身特性，開展谷紅注射液人肝微粒體體外酶抑制實驗和人原代肝細胞體外酶活和mRNA 誘導實驗，并建立大鼠血漿中7種探針底物同時測定的UPLC-MS/MS法，以比較“Cocktail”探針底物體內藥動學過程的變化，開展體內外關聯性研究。旨在為谷紅注射液與其他藥物臨床上安全、有效地聯用提供依據，為中藥注射劑代謝性相互作用研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑

谷紅注射液（批號20210310，10 mL/支）購自通化谷紅制藥有限公司；對照品非那西丁（批號77440，質量分數≥99%）、槲皮素（批號Q4951，質量分數≥95%）、奧美拉唑（批號O104，質量分數≥98%）、利福平（批號R3501，質量分數≥97%）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH，批號SLCK5429，質量分數≥97%）購自美國Sigma 公司；安非他酮（批號100671-201802，質量分數≥99%）、阿莫地喹（批號101217-201401，質量分數≥91%）、雙氯芬酸（批號100334-201803，質量分數為100%）、氫溴酸右美沙芬（批號100201-201204，質量分數≥94%）、對乙酰氨基酚（批號100018-201610，質量分數≥99%）、噻氯匹定（批號100542-201002，質量分數≥99%）、酮康唑（批號100294-201904，質量分數≥99%）、苯巴比妥（批號171222-201206，質量分數≥99%）、咪達唑侖（批號171265-201402，質量分數≥99%）、羥基紅花黃色素 A（批號111637201810，質量分數為93.10%）、乙酰谷酰胺（批號100859-202003，質量分數為98.40%）購自中國食品藥品檢定研究院；美芬妥英（批號21J49-F1，質量分數≥98%）、6β-羥基睪酮（批號21J052-D2，質量分數為100%）、α-萘黃酮（批號21J136-P1，質量分數≥99%）、磺胺苯吡唑（批號21J122-C3，質量分數≥99%）、奎尼丁（批號21J118-02，質量分數≥98%）購自上海甄準生物科技有限公司；睪酮（ 批號 G1088065，質量分數≥98%）購自Dr.Ehrenstorfer 公司；羥基安非他酮（批號FN11131910，質量分數為100%）、去甲右美沙芬（批號FN04251903，質量分數為100%）購自Cerilliant公司；N-去乙基阿莫地喹（批號2229-086A2，質量分數≥98%）、4-羥基雙氯芬酸（批號2088-058A7，質量分數≥99%）購自TLC 公司；4-羥基美芬妥英（批號107180，質量分數≥98%）購自美國MCE 公司；舍曲林（批號5PBO-HB，質量分數≥99%）購自日本TCI 公司；茶堿（批號C14045635，質量分數≥99%）、甲苯磺丁脲（批號C12652045，質量分數≥99%）、瑞格列奈（批號C12448607，質量分數≥99%）、美托洛爾（批號C14110839，質量分數≥98%）購自上海麥克林公司；羅紅霉素（批號294889，質量分數≥98%）購自J&K 公司；細胞貼壁培養液（批號S03316）、細胞培養液（批號Z99009）購自美國Bioreclamation IVT 公司；RNA 提取試劑盒（批號DP430）、cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號KR116-02）、qRT-PCR 試劑盒（批號FP206-02）購自天根生化有限公司；甲醇、乙腈、甲酸購自美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 體外體系與動物

人肝微粒體（SDL，24 mg/mL）、人原代肝細胞（HVN、QBU 和MHK）購自美國Bioreclamation IVT公司。

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量200～250 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號SCXK（京）2019-0008。動物實驗經中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物倫理委員會審核并批準（批準號No.IRM-DWLL-2022209）。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；AB GHRAP 5500 型質譜儀（美國AB Sciex 公司）；Rotor-Gene Q 型熒光定量PCR 儀（德國QIAGEN 公司）；5430R 型高速離心機（德國Eppendorf 公司）。

2 方法

2.1 谷紅注射液對人肝微粒體7 種CYP450 酶的體外抑制研究

2.1.1 人肝微粒體體外抑制實驗 肝微粒體孵育體系包括人肝微粒體（0.5 mg/mL）、NADPH（1 mmol/L）、體外探針底物（表1）混合液、谷紅注射液或陽性抑制劑、磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.4）。不同體積分數（0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、2.5%、5%、10%）的谷紅注射液或陽性抑制劑（表1）與人肝微粒體預孵育15 min 后，加入探針底物和NADPH，37 ℃孵育30 min。每組樣品3 個平行，孵育體系有機溶劑占比＜1%。冰甲醇（含氧氟沙星20 ng/mL）終止反應，渦旋3 min，13 500 r/min離心10 min，取上清液待測。

表1 實驗所用探針底物、抑制劑、誘導劑Table 1 Probe substrates, inhibitors and inducers used in this study

2.1.2 探針底物的代謝產物含量測定 采用UPLC-MS/MS 方法測定上述7 種探針底物的代謝產物生成量[9]。

（1）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，90%～10% A；3～4 min，10% A；4～4.2 min，10%～90% A；4.2～8.0 min，90% A；柱溫30 ℃；進樣量2.000 μL。

（2）質譜條件：ESI+模式，質譜多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描；氣簾氣275.8 kPa；碰撞氣48.265 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度450 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；碰撞出口電壓13 V；駐留時間50 ms；其他MRM參數見表2。

表2 體外探針底物代謝產物的MRM 參數Table 2 MRM parameters for metabolites of in vitro probe substrates

2.1.3 數據處理 谷紅注射液臨床靜脈滴注常用劑量為10～20 mL/d，一般正常成人循環血液總量有4～5 L，可得到臨床劑量時的理論最大血藥濃度為0.5%。本研究以體積分數作為體外孵育體系的給藥劑量及其半數抑制濃度（ half inhibitory concentration，IC50）的計算[9]。采用GraphPad 8 軟件進行非線性擬合并計算IC50值。

2.2 谷紅注射液對人原代肝細胞CYP450 酶的體外誘導研究

2.2.1 人原代肝細胞的體外誘導實驗 人原代肝細胞復蘇后，用貼壁培養液稀釋成7×105個/mL，按照每孔100 μL 鋪在預鋪I 型膠原的96 孔板中，于37 ℃、5% CO2條件下孵育過夜，貼壁形成單層細胞，然后更換成肝細胞培養液繼續培養。第2 天加入含不同體積分數（0.005%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、5.00%）的谷紅注射液或陽性誘導劑（表1）或陰性對照藥（羅紅霉素10 μmol/L）培養液，以空白培養液為空白對照，連續給藥2 d，取培養液檢測酶活性，收集細胞檢測酶mRNA 表達。采用3 個供體，每個供體平行3 份。

2.2.2 qRT-PCR 法測定CYP 酶mRNA 表達 用RNA 提取試劑盒提取細胞內總RNA，經DNase I 柱消化后，用Fast Quant cDNA 第一鏈合成試劑盒從總RNA 反轉錄合成cDNA。取2～4 μL cDNA 作為模板，利用Super Real Pre Mix試劑盒進行qRT-PCR。引物和探針序列見表3。

表3 CYP450 亞酶的引物和探針序列Table 3 Primers and probe sequences of CYP450 subenzymes

2.2.3 UPLC-MS/MS 法測定CYP 酶活性 采用UPLC-MS/MS 方法測定上述3 種探針底物的代謝產物生成量[10]。

（1）色譜條件：Phenomenex Synegi Hydro RP色譜柱（30 mm×2.1 mm，4 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～1.5 min，95%～5% A；1.5～1.7 min，5% A；1.7～1.71 min，5%～95% A；1.71～2.0 min，95% A；柱溫45 ℃；進樣量5.0 μL。

（2）質譜條件：ESI+模式，MRM 掃描；氣簾氣137.9 kPa；碰撞氣68.95 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度500 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；駐留時間30 ms；其他MRM 參數見表4。

表4 體外探針底物代謝產物的MRM 參數Table 4 MRM parameters of metabolites of in vitro probe substrate

2.2.4 數據處理

（1）酶活性誘導評價：當相對陽性對照活性≥40%時，實驗藥對酶活性具有潛在的誘導作用[2-3]。

相對陽性對照活性＝(實驗組樣本相對活性－陰性對照組樣本相對活性)/(陽性對照組樣本相對活性－陰性對照組樣本相對活性)

（2）mRNA 表達誘導評價：當mRNA 表達的誘導倍數≥空白組2 倍且呈濃度相關性增加，具有潛在的誘導作用[2-3]。

ΔCt＝目的基因的Ct－內參β-actin 的Ct

ΔΔCt＝實驗組或陽性對照組的ΔCt－陰性對照組的ΔCt

誘導倍數＝2?ΔΔCt

2.3 谷紅注射液對大鼠CYP450 酶的體內影響研究

2.3.1 體內實驗 24 只SD 大鼠隨機分為對照組和谷紅注射液低、高劑量組，每組8 只。谷紅注射液低、高劑量組分別尾iv 谷紅注射液0.9、3.6 mL/kg，對照組給予生理鹽水，1 次/d，連續10 d。第10 天給藥30 min 后，給予體內混合探針藥物（表1）溶液。給予探針前（0 min），后5、10、20、30、45 min和1、2、4、6、9、12、24 h，于眼內眥取血0.25 mL，置于肝素鈉離心管，3 000 r/min 離心10 min，得到血漿。取血漿95 μL，加內標工作液5 μL、甲醇300 μL，渦旋3 min，13 000 r/min 離心10 min，取上清液稀釋5 倍，待測。

2.3.2 血漿中7 種探針底物含量測定的UPLCMS/MS 法 UPLC-MS/MS 法同時測定7 種體內探針底物在血漿中的含量。

（1）色譜條件：Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～0.5 min，90% A；0.5～2.5 min，90%～10% A；2.5～4.1 min，10%～90% A；4.1～6.0 min，90% A；柱溫30 ℃；進樣量2.0 μL。

（2）質譜條件：ESI+模式，MRM 掃描；氣簾氣275.8 kPa；碰撞氣48.265 kPa；噴霧電壓5 500 V；加熱器溫度450 ℃；離子源霧化壓力344.75 kPa；離子源加熱輔助氣壓力344.75 kPa；入口電壓10 V；碰撞出口電壓13 V；駐留時間50 ms；其他MRM參數見表5。

表5 體內探針底物的MRM 參數Table 5 MRM parameters of in vivo probe substrates

2.3.3 方法學驗證 參照生物樣品定量分析方法驗證指導原則，對該方法的選擇性、標準曲線范圍、精密度、準確度、提取回收率、基質效應、穩定性等進行驗證。探針藥物茶堿、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾和咪達唑侖的標準曲線范圍分別為10～10 000、1～500、1～1 000、10～10 000、1～1 000、1～500、1～500 ng/mL，最小二乘法線性回歸，權重因子1/χ2。安非他酮、美托洛爾和咪達唑侖的低、中、高質控質量濃度分別為2、25、250 ng/mL；瑞格列奈和奧美拉唑的低、中、高質控質量濃度分別為2、75、750 ng/mL；茶堿和甲苯磺丁脲唑的低、中、高質控質量濃度分別為20、750、7 500 ng/mL，各質控質量濃度分別考察精密度、準確度、提取回收率、基質效應（n＝6）。考察分析物在基質中常溫保存24 h、?80 ℃保存14 d、凍融3 次穩定性（n＝3）。

2.3.4 數據處理 采用Phoenix WinNonlin 8.1 軟件的非房室模型法計算各探針底物的藥動學參數，主要包括最大血藥濃度（Cmax）、0 到最后1 個采血點的藥時曲線下面積（AUC0～t）、0 到∞的藥時曲線下面積（AUC0～∞）、清除率（CL）等。

2.4 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計分析，采用GraphPad Prism 8.4.3 軟件繪圖。計量資料以±s表示，藥動學參數差異采用獨立樣本t檢驗（方差齊）或采用t’檢驗（方差不齊）。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 專屬性 空白血漿、加內標空白血漿及血漿樣本的總離子流圖見圖1，血漿中茶堿、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾、咪達唑侖和苯妥英鈉保留時間分別為1.80、2.39、2.88、2.99、2.28、2.24、2.49、2.75 min，無雜峰干擾，專屬性良好。

3.1.2 標準曲線與定量限 探針藥物在1～500、1～1 000、10～10 000 ng/mL 內線性關系良好，回歸方程和定量限見表6。

表6 標準曲線、線性范圍和定量限Table 6 Standard curve, linear range and limit of quantification

3.1.3 精密度和準確度 各探針底物精密度和準確度良好，結果見表7。

表7 各探針藥物的精密度、準確度、提取回收率和基質效應Table 7 Precision, accuracy, extraction recovery rate and matrix effect of each probe drug

3.1.4 提取回收率 各探針藥物的提取回收率RSD 均＜15%，提取回收率合格，結果見表7。

3.1.5 基質效應 各藥物濃度的內標歸一化基質效應因子的RSD 均＜15%，說明基質效應符合要求，結果見表7。

3.1.6 穩定性考察 各探針藥物在各種處理后質量濃度的RSD 均＜10.0%，表明樣品在常溫下存放24 h、?80 ℃條件下存放14 d 以及凍融3 次后穩定，結果見表8。

表8 各探針藥物的穩定性Table 8 Stability of each probe drug

3.2 谷紅注射液的體外抑制作用

體外陽性抑制劑處理后的各CYP 亞型剩余酶活性均低于50%，探針底物代謝受到明顯抑制，孵育體系合格。不同體積分數（0.05%～10%）的谷紅注射液處理后，CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 和CYP3A4 酶的IC50值分別為1.98%、7.95%、2.85%、5.39%、4.92%、7.76%和3.41%，各CYP450 酶亞型的相對活性均出現不同程度的降低（圖2），但是均大于臨床劑量時的理論最大血藥濃度值0.5%。

圖2 谷紅注射液對人肝微粒體CYP450 酶7 個亞型的抑制曲線 (n = 3)Fig.2 Inhibition curve of Guhong Injection on seven subtypes of human liver microsomal CYP450 enzyme (n = 3)

3.3 谷紅注射液的體外誘導作用

供體HVN、QBU、MHK 的人原代肝細胞與陽性誘導劑共孵育后，其酶相對活性（實驗組酶活性/空白對照組酶活性）為235.5%～4 480%，均高于200%，提示實驗體系合格。如表9 所示，在3 個供體中，谷紅注射液在0.005%～5%對CYP2B6、CYP3A4 酶的相對陽性對照活性均低于40%。而在供體MHK，谷紅注射液在0.5%～5%對CYP1A2 酶相對陽性對照活性高于40%，推測對CYP1A2 酶活性具有一定的誘導作用。

表9 谷紅注射液對人原代肝細胞CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶活性的影響 (±s, n = 3)Table 9 Effect of Guhong Injection on activity of CYP1A2, CYP2B6 and CYP3A4 enzymes in human primary hepatocytes(±s, n = 3)

表9 谷紅注射液對人原代肝細胞CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶活性的影響 (±s, n = 3)Table 9 Effect of Guhong Injection on activity of CYP1A2, CYP2B6 and CYP3A4 enzymes in human primary hepatocytes(±s, n = 3)

體積分數/% CYP1A2 相對陽性對照活性/% CYP2B6 相對陽性對照活性/% CYP3A4 相對陽性對照活性/%HVN QBU MHK HVN QBU MHK HVN QBU MHK 5.000 4.84±4.06 8.24±9.59 72.79±11.34 8.34±3.77 19.64±3.06 8.09±0.93 ＜0 ＜0 ＜0 1.000 ＜0 2.87±9.45 64.59±18.22 0.89±0.27 3.76±1.91 4.56±0.38 ＜0 ＜0 ＜0 0.500 4.58±3.52 2.14±2.27 44.75±13.00 ＜0 1.75±0.59 5.63±1.94 ＜0 ＜0 ＜0 0.100 ＜0 ＜0 8.69±6.94 ＜0 ＜0 0.15±2.18 ＜0 ＜0 ＜0 0.050 ＜0 ＜0 5.33±5.17 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 0.005 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0 ＜0

HVN、QBU、MHK 為3 個供體的人原代肝細胞。HVN, QBU and MHK are three donors of human primary hepatocytes.

陽性對照組對3 個批次的人原代肝細胞的CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4誘導倍數均高于空白對照的2 倍，而陰性對照組均低于空白對照的2 倍，表明孵育體系合格（圖3）。谷紅注射液（0.05%～10%）使CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4酶mRNA 表達倍數分別增加最高達18.74、7.74、5.96 倍，且呈濃度相關性，說明谷紅注射液對CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4的mRNA 表達具有潛在的誘導作用。

圖3 谷紅注射液對人原代肝細胞CYP1A2 (A)、CYP2B6 (B)、CYP3A4 (C) 的mRNA 誘導倍數 (n = 3)Fig.3 mRNA induction multiple of Guhong Injection on CYP1A2 (A), CYP2B6 (B) and CYP3A4 (C) in human primary hepatocytes (n = 3)

3.4 谷紅注射液對大鼠體內CYP450 酶的影響

茶堿、安非他酮、瑞格列奈、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、美托洛爾、咪達唑侖的藥時曲線見圖4，藥動學參數見表10。與對照組比較，谷紅注射液高劑量組中茶堿的AUC0～t和AUC0～∞降低19.67%、20.33%，安非他酮的AUC0～∞降低40.41%，咪達唑侖的AUC0～t和AUC0～∞降低57.88%、57.43%，具有統計學意義（P＜0.05）。谷紅注射液低劑量組中奧美拉唑的AUC0～t和AUC0～∞降低43.14%、41.69%，高劑量組AUC0～t和AUC0～∞降低49.53%、49.60%，具有統計學意義（P＜0.05）。瑞格列奈、甲苯磺丁脲和美托洛爾的藥動學參數無明顯變化。谷紅注射液使大鼠體內CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19 和CYP3A4 酶活性被明顯增加，而CYP2C8、CYP2C9和CYP2D6 的酶活性無明顯變化。

圖4 各探針藥物血藥濃度-時間曲線 (±s, n = 8)Fig.4 Blood drug concentration-time curve of each probe drug (±s, n = 8)

表10 各探針藥物主要藥動學參數 (±s, n = 8)Table 10 Main pharmacokinetic parameters of each probe drug (±s, n = 8)

探針藥物 組別 t1/2/h Cmax/(ng·mL?1) AUC0～t/(ng·h·mL?1) AUC0～∞/(ng·h·mL?1) CL/(L·h·kg?1) Vd/mL茶堿 對照 2.51±0.61 9 771.25±1 422.20 50 230.84±6 686.36 51 021.88±6 479.90 47.74±5.59 169.99±38.22低劑量 2.34±0.67 10 520.00±919.90 47 286.51±6 233.28 47 492.46±6 153.11 51.46±7.18 174.70±63.19高劑量 2.39±0.52 8 707.50±577.27 40 351.04±6 345.27* 40 647.46±6 115.31* 60.30±8.39* 207.38±55.88安非他酮 對照 0.63±0.17 28.33±8.85 20.73±5.56 23.41±6.68 28 263.34±9 484.12 25 904.78±11 552.59低劑量 0.61±0.17 17.01±7.94 13.75±7.08 17.01±7.98 44 674.97±21 679.74 35 096.24±10 271.93高劑量 0.49±0.06 18.94±9.35 14.80±8.23 13.95±6.00* 51 059.67±19 938.07* 35 320.46±11 155.52瑞格列奈 對照 5.16±1.83 532.75±111.01 942.01±234.99 970.62±232.35 328.28±83.20 2 409.88±985.36低劑量 5.97±2.82 461.50±131.93 883.99±205.74 904.26±209.78 354.02±97.79 3 142.47±2 075.29高劑量 3.82±1.06 300.63±76.78 716.52±288.82 731.57±288.08 483.28±202.59 2 755.19±1 777.02甲苯磺丁脲 對照 6.97±0.85 4 573.75±1 039.94 50 220.00±11 799.71 55 774.96±12 906.34 5.76±1.71 57.65±16.05低劑量 5.81±0.93 5 653.75±1 438.97 54 319.41±13 712.80 57 780.27±14 394.44 5.65±1.95 48.50±22.49高劑量 7.62±2.07 4 238.75±1 890.96 47 343.86±20 640.72 55 197.78±27 612.37 6.91±3.26 71.38±35.22奧美拉唑 對照 3.09±3.17 1 266.25±150.58 809.94±182.09 820.22±186.53 3 882.12±997.51 18 423.61±20 106.08低劑量 0.40±0.27 632.25±206.79* 460.55±202.96* 478.27±200.55* 7 681.77±3 839.27* 4 394.56±3 048.41高劑量 1.47±1.51 654.75±286.24* 408.77±199.51* 413.35±203.72* 9 578.44±6 105.20* 16 381.41±13 544.52美托洛爾 對照 0.87±0.30 698.63±195.29 689.64±302.94 696.72±304.40 5 032.49±1 804.60 6 148.77±2 388.02低劑量 0.62±0.13 482.00±162.05 497.88±198.08 501.47±196.97 6 876.67±2 452.76 6 045.28±2 385.21高劑量 0.62±0.06 444.00±92.82 434.25±86.62 443.94±96.37 7 053.46±1 375.27 6 288.09±1 384.48咪達唑侖 對照 1.30±0.73 264.31±125.20 261.79±153.76 267.56±153.40 13 291.24±8 138.37 19 019.76±6 084.75低劑量 0.78±0.21 149.91±86.98 196.23±131.30 233.55±124.49 14 087.75±8 059.33 16 765.89±11 093.63高劑量 0.74±0.20 103.33±29.76* 110.27±45.89* 113.90±45.64* 24 385.51±8 926.78* 26 602.93±11 943.42

與對照組比較：*P＜0.05。*P < 0.05 vs control group.

4 討論

本研究中體外抑制實驗底物和抑制劑的選擇參考FDA 體外藥物相互作用指導原則[2]，抑制劑的濃度經過預實驗確定，還比較了7 個亞型酶抑制劑一起加入以及分成α-萘黃酮、磺胺苯吡唑、噻氯匹定、奎尼丁、酮康唑和舍曲林、槲皮素2 組分別加入，結果發現7 個抑制劑混合加入后，每種亞型酶活性可被明顯抑制。谷紅注射液對人肝微粒體7 種亞酶IC50值均大于其在人體內最大血藥濃度（0.5%），推測其在臨床劑量范圍內，與上述酶底物聯用時發生藥物相互作用的可能性較小。

誘導實驗以代謝酶的mRNA 表達水平作為代謝酶誘導的評價終點，與評價酶活性相比更加敏感，可以降低CYP450 酶誘導假陰性的概率。原代肝細胞被廣泛用于預測CYP450 藥物誘導的潛在作用，并已被FDA 批準為該領域的有效工具[11]。本研究發現谷紅注射液可使人原代肝細胞CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4的mRNA 水平均提高超過2 倍且呈濃度相關性增加，表明其對人原代肝細胞3 種主要亞酶有潛在的誘導作用，與CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4 酶底物聯用時可能會降低其療效。

體內Cocktail 探針藥物法將個體間差異、個體內隨時間變化的生理影響和成本降低，可用于藥物對不同CYP450 亞型活性的研究[12]。谷紅注射液以臨床等效劑量連續給藥后，大鼠體內CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19 和CYP3A4 的酶活性被明顯誘導，與體外誘導實驗結果一致。在腦血管疾病常見藥中，他汀類藥物如阿托伐他汀、辛伐他汀，抗凝藥物華法林，抗血小板藥物氯吡格雷，均為CYP3A4的底物。建議臨床上盡量避免谷紅注射液與上述藥物的聯用，尤其CYP3A4 底物，可能會誘導其代謝加快從而降低療效的風險。

綜上，本研究評估了谷紅注射液體外對人源CYP450 酶抑制和誘導作用，結果顯示谷紅注射液可誘導CYP1A2、CYP2B6和CYP3A4酶的mRNA表達。體內評估了對大鼠CYP450 酶的影響，提示體內與體外結果一致。谷紅注射液對CYP450 酶誘導可能產生的代謝性相互作用及其臨床意義，需要進一步通過臨床試驗證實。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突