雷公藤多苷片與呋塞米聯(lián)用治療腎病綜合征大鼠的藥動學/藥效學研究

杜 犀，潘桂湘，李自強，劉 蓉，呂春曉，劉 佳，王婧媛，黃宇虹

天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300250

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是臨床常見的一組腎臟疾病綜合征，以大量蛋白尿、低白蛋白血癥以及不同程度的水腫、高脂血癥為主要特征，并伴隨腎小管、腎小球等腎實質(zhì)器官的損傷[1-2]。若不能及時控制改善NS 癥狀，其最終將會發(fā)展為慢性腎臟疾病進而造成腎衰竭[3]。在我國臨床治療NS中，常使用雷公藤多苷片緩解大量蛋白尿癥狀[4-5]。由于NS 常伴隨水腫，臨床上常使用袢利尿劑對癥治療。故在實際應(yīng)用中，雷公藤多苷片與袢利尿劑常會發(fā)生合用，但相關(guān)研究卻不足，多憑臨床經(jīng)驗處理，相對缺乏數(shù)據(jù)支持。

雷公藤多苷片主要由二萜類、三萜類及生物堿類活性成分組成，其中二萜類成分雷公藤甲素及生物堿類主要經(jīng)腎臟消除，尿液排出[6]。腎有機陰離子轉(zhuǎn)運體底物袢利尿劑呋塞米，具有加速經(jīng)腎消除的藥物排泄的作用[7]。NS 條件下腎臟功能受損、內(nèi)環(huán)境紊亂，可能會影響從腎臟消除藥物的藥動學行為。因此NS 狀態(tài)下，2 藥的藥動學與健康狀態(tài)相比可能發(fā)生變化并出現(xiàn)相互作用。課題組前期已建立血漿中雷公藤多苷片及呋塞米可靠的檢測方法，本研究采用多柔比星誘導的NS 模型大鼠[8]，探索雷公藤多苷片與呋塞米在健康或疾病狀態(tài)下單用及合用后的藥動學及藥效學特點，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（250～270）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號SCXK（京）2019-0008。動物飼養(yǎng)于動物屏障SPF環(huán)境系統(tǒng)，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風次數(shù)為15 次/h 全新風，光照為12 h 明/暗。動物實驗經(jīng)易生源基因科技（天津）有限公司實驗動物倫理委員會批準（批準號YSY-DWLL-2021167）。

1.2 藥品與試劑

雷公藤多苷片（批號20180603）購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)；呋塞米片（批號1910069）購自天津力生制藥；注射用鹽酸多柔比星（批號1907E2）購自深圳萬樂藥業(yè)；對照品呋塞米（批號100544-201503，質(zhì)量分數(shù)為99.3%）、托拉塞米（批號100605-201402，質(zhì)量分數(shù)為100.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；雷公藤新堿（批號CFS201901）、雷公藤晉堿（批號 CFS201902）、雷公藤次堿（批號CFS201902）、雷公藤定堿（批號CFS201902）、雷公藤春堿（批號CFS201902）購自武漢中標科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均為98%；內(nèi)標多潘立酮（批號1-JTN-136-1，質(zhì)量分數(shù)為99.72%）購自加拿大Toronto Research Chemicals 公司；色譜級乙腈、甲醇購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；甲酸購自美國ROE 公司；醋酸乙酯購自天津渤化化學試劑有限公司；尿蛋白定量測試盒（批號20201222）購自南京建成生物工程研究所；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，CRE）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）試劑盒（批號均為140320110）均購自深圳邁瑞動物醫(yī)療科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號21612）、羊抗兔IgG 二抗（批號L3012-2）購自美國Signalway Antibody 公司；有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白1（organic anion transporter 1，OAT1）抗體（批號Ab131087）購自英國Abcam 公司；OAT3 抗體（批號83500）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

Waters Acquity UPLC 超高效液質(zhì)色譜（美國Waters 公司）串接AB Triple Quad 5500 三重四極桿質(zhì)譜（美國AB 公司）；BS-240VET 型動物專用全自動生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Champchemi 610 plus 型全自動化學/熒光/凝膠成像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）；HistoCore MULTICUT 型病理切片機（德國Leica 公司）；CKX43-LP 型顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 動物造模、分組及給藥

110 只雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，置代謝籠，收集24 h 尿液，檢測尿蛋白呈陰性，符合標準。大鼠尾iv 鹽酸多柔比星4 mg/kg，隔1 周再次注射2 mg/kg 造模，對照組注射生理鹽水。21 d 后代謝籠收集24 h 尿液，測定尿蛋白含量，與對照組相比具有顯著性差異，認為造模成功。

取正常大鼠，設(shè)置對照組（C）、雷公藤多苷片單次給藥組（C-GTW）、呋塞米單次給藥組（CFSM）、5 倍雷公藤多苷片單次給藥組（C-5GTW）、雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米單次合用組（C-GTW＋FMS）、5 倍劑量雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米單次合用組（C-5GTW＋FMS）、累積服用雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米2 周組（C-GTW＋FMS-2W）、累積服用5 倍雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米2 周組（C-5GTW＋FMS-2W），每組6 只。

造模大鼠隨機分為模型組（NS）、雷公藤多苷片單次給藥組（NS-GTW）、呋塞米單次給藥組（NSFSM）、5 倍雷公藤多苷片單次給藥組（NS-5GTW）、累積服用雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米2 周組（NSGTW＋FSM-2W）、累積服用5 倍雷公藤多苷片聯(lián)合呋塞米2 周組（NS-5GTW＋FSM-2W）、累積服用雷公藤多苷片2 周組（NS-GTW-2W）、累積服用5倍雷公藤多苷片2 周組（NS-5GTW-2W），每組6 只。

雷公藤多苷片以體表面積法折算給藥劑量為10 mg/(kg?d)，5 倍給藥劑量為50 mg/(kg?d)。呋塞米給藥劑量為6 mg/(kg?d)，各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig 等體積生理鹽水。

2.2 取材

2.2.1 血液采集 于給藥前（0 h），后10、30 min和1、1.5、2、3、4、6、8、24、30 h，大鼠內(nèi)眥取血至肝素化的離心管中，取血后1 h 內(nèi)以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，置于?80 ℃冰箱中保存，用于藥動學研究。生化指標檢測所用血漿，僅采集對照組、模型組及各累積2 周服用給藥組，在實施藥動學研究采血前1 d 采集。

2.2.2 尿液采集 大鼠至代謝籠中，留取24 h 的尿液，進行尿蛋白定量分析。在實施藥動學研究采血前1 d 采集。

2.2.3 腎組織采集 實驗結(jié)束后，取大鼠左腎組織，浸泡在10%中性福爾馬林緩沖液中進行固定用于病理切片檢查；取右腎組織，于液氮中快速冷凍后分管儲存在?80 ℃，用于腎臟的Western blotting檢測。

2.3 藥動學研究

2.3.1 樣品前處理 取100 μL 大鼠樣品血漿，加入10 μL 內(nèi)標（多潘立酮/托拉塞米10 ng/mL）、1 mL醋酸乙酯，渦旋3 min，10 000 r/min 離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移入干凈EP 管中，氮氣吹干。殘渣以100 μL 20%乙腈水溶液（含0.1%甲酸）復溶，進樣。

2.3.2 標準曲線和質(zhì)控樣品制備 取90 μL 大鼠空白血漿，加入10 μL 標準曲線/質(zhì)控工作液，分別制備成質(zhì)量濃度為含雷公藤多苷片各成分0.1、0.5、1、5、10、100、400、500 ng/mL 的標準樣品，及3、60、375 ng/mL 的質(zhì)控樣本；含呋塞米為0.5、1、5、10、50、400、500 ng/mL 的標準樣品，及1.5、75、375 ng/mL 質(zhì)控樣品。

2.3.3 雷公藤多苷片色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件：流動相為含0.1%甲酸的5 mmol/L 乙酸銨水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～2.0 min，80% A；2.0～2.2 min，80%～45% A；2.2～5.8 min，45% A；5.8～6.0 min，45%～10% A；6.0～8.5 min，10% A；8.5～9.0 min，10%～80% A；9.0～13.0 min，80% A。體積流量0.3 mL/min；進樣器溫度4 ℃；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI 離子源，正離子分析模式，MRM 掃描。參數(shù)設(shè)置：氣簾氣壓力241.325 kPa，碰撞氣壓力48.262 kPa，離子噴霧電壓5 500.00 V，離子源溫度450.00 ℃，輔助氣壓力344.75 kPa。其他參數(shù)見表1。

表1 雷公藤多苷片質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of Tripterygium Glycosides Tablets

2.3.4 呋塞米色譜及質(zhì)譜條件

（1）色譜條件：流動相、體積流量、進樣器溫度及柱溫均同“2.3.3”項。梯度洗脫：0～0.6 min，70% A；0.6～0.8 min，70%～35% A；0.8～1.9 min，35% A；1.9～2.0 min，35%～5% A；2.0～2.5 min，5% A；2.5～2.6 min，5%～70% A；2.6～5.0 min，70% A。進樣量5 μL。

（2）質(zhì)譜條件：ESI 離子源，負離子分析模式，離子參數(shù)設(shè)置：離子噴霧電壓?4 500.00 V，其余設(shè)置同“2.3.3”項。其他參數(shù)見表2。

表2 呋塞米質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of furosemide

2.4 大鼠一般情況及生化指標檢測

觀察大鼠的皮毛光滑度、記錄體質(zhì)量、活動狀態(tài)及進食情況等。使用尿蛋白試劑盒定量分析大鼠24 h 尿蛋白。全自動生化儀檢測血漿ALT、AST、ALP 活性及TP、ALB、TC、TG、BUN、CRE 水平。

2.5 腎組織蘇木素-伊紅（HE）染色

取大鼠新鮮腎臟經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度乙醇逐級脫水，依次透明、浸蠟、石蠟包埋、修整、切片、烤片，石蠟切片脫蠟至水，蘇木素染細胞核，伊紅染細胞質(zhì)，脫水封片后于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 Western blotting 檢測腎臟OAT1 和OAT3 蛋白表達

取大鼠腎臟50 mg，剪碎研磨、冰上裂解，混勻后4 ℃離心，取上清測定蛋白含量。加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入GAPDH 抗體（1∶5 000）、OAT1抗體（1∶600）、OAT3 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜。加入二抗（1∶5 000），室溫避光孵育60 min，洗膜。曝光洗片，采用Image J 軟件分析條帶灰度值。

2.7 藥動學參數(shù)計算及統(tǒng)計學分析

藥動學參數(shù)計算采用WinNonlin 8.1 軟件計算分析，Tmax以中位數(shù)表示，其余參數(shù)以±s表示，缺失值以“—”表示，對Cmax和AUC0～t進行對數(shù)轉(zhuǎn)化后再進行組間差異比較；結(jié)果使用SPSS 25 軟件進行統(tǒng)計，計量資料以±s表示，兩兩組間比較采用獨立t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 藥動學研究

對大鼠血中的雷公藤多苷片成分雷公藤次堿、雷公藤定堿、雷公藤晉堿、雷公藤春堿、雷公藤新堿以及呋塞米進行檢測，計算藥動學參數(shù)并進行組間比較（表3～5），繪制各成分藥-時曲線（圖1）。

圖1 呋塞米及雷公藤多苷片在不同組別大鼠體內(nèi)的藥-時曲線 (n = 6)Fig.1 Plasma concentration-time curves of furosemide and Tripterygium Glycosides Tablets in different groups of rats(n = 6)

表3 單倍劑量雷公藤多苷片給藥的大鼠藥動學參數(shù) (n = 6)Table 3 Pharmacokinetic parameters of rats after single dose administration of Tripterygium Glycosides Tablets (n = 6)

表4 5 倍劑量雷公藤多苷片給藥的大鼠藥動學參數(shù) (n = 6)Table 4 Pharmacokinetic parameters of rats after five-fold doses administration of Tripterygium Glycosides Tablets (n = 6)

表5 呋塞米給藥的大鼠藥動學參數(shù) (n = 6)Table 5 Pharmacokinetic parameters of rats after administration of furosemide (n = 6)

單因素方差分析顯示，雷公藤多苷片的Cmax和AUC 在同一劑量組間均存在顯著性差異，取對數(shù)后，除雷公藤次堿外其余成分均存在顯著性差異。呋塞米組間差異顯著。雷公藤多苷片生物堿類成分藥動學呈現(xiàn)相似趨勢，NS 下暴露明顯增加。在2 個劑量間，無論是對照組還是模型組，5 倍雷公藤多苷片單次給藥組的Cmax和AUC 值均顯著高于雷公藤多苷片單次給藥組的5 倍。與呋塞米合用，因其促排泄作用，雷公藤多苷片各成分暴露均顯著下降。NS 下呋塞米的暴露顯著降低，合用雷公藤多苷片可使呋塞米暴露部分回升。

3.2 大鼠一般情況及生化指標檢測結(jié)果

如表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05），伴隨精神不振、進食不佳、毛色晦暗等特征，尿蛋白含量顯著升高（P＜0.05）。經(jīng)雷公藤多苷片治療后，大鼠體質(zhì)量有所回升，狀態(tài)也有所恢復，尿蛋白含量有所好轉(zhuǎn)但仍與對照組差異顯著。合用呋塞米的組別尿蛋白含量高于未合用組，可能由于呋塞米的促排尿作用，使大鼠尿總量提升造成結(jié)果偏高。NS 大鼠腎功能下降，經(jīng)給藥治療后腎功能有所改善，CRE 恢復明顯。對照組在連續(xù)合并用藥2 周后，肝功能指標升高，說明健康狀態(tài)下連續(xù)合并用藥或存在肝損風險，而疾病狀態(tài)下用藥則符合“有故無殞”理論。

表6 大鼠一般情況及生化指標檢測結(jié)果 (±s, n = 6)Table 6 General condition and biochemical results of rats (±s , n = 6)

表6 大鼠一般情況及生化指標檢測結(jié)果 (±s, n = 6)Table 6 General condition and biochemical results of rats (±s , n = 6)

組別 體質(zhì)量/g 尿蛋白/mg ALT/(U·L?1) AST/(U·L?1) ALP/(U·L?1) TP/(g·L?1)C 337.2±6.6 9.3±3.0 59.2±9.4 98.6±9.4 214.5±11.1 63.2±5.2 C-GTW＋FMS-2W 336.7±20.5# N/A 69.7±11.1# 121.3±9.9*# 292.0±73.9* 74.0±4.1*C-5GTW＋FMS-2W 340.2±31.3# N/A 66.6±4.1# 111.2±12.0# 237.6±53.9 73.5±2.6*NS 306.5±18.6* 38.0±14.1* 54.6±4.4 83.2±23.5 284.6±205.5 69.2±14.2 NS-GTW-2W 348.8±20.0# 26.2±10.2* 67.8±23.2 54.1±14.0*# 152.9±66.4 72.0±22.7 NS-5GTW-2W 339.6±24.6 23.7±4.8* 65.3±14.4 78.3±18.0 189.1±45.2 70.2±16.3 NS-GTW＋FSM-2W 335.8±17.3 30.9±15.4* 58.4±8.7 58.0±15.7*# 198.2±95.3 60.9±4.7 NS-5GTW＋FSM-2W 333.0±50.8 34.4±17.6* 68.7±12.6# 88.9±62.7 259.3±286.5 75.0±4.5*組別 ALB/(g·L?1) CRE/(μmol·L?1) BUN/(mmol·L?1) TC/(mmol·L?1) TG/(mmol·L?1)C 32.7±1.8 33.8±4.3 4.81±0.50 1.66±0.19 0.71±0.16 C-GTW＋FMS-2W 34.0±1.0# 35.5±4.8# 4.68±0.65 1.67±0.22# 0.91±0.31#C-5GTW＋FMS-2W 33.8±1.2# 34.5±2.9# 4.26±0.69 1.83±0.14# 1.27±0.54#NS 28.0±2.0* 59.3±7.8* 5.70±1.50 4.49±1.99* 3.78±1.47*NS-GTW-2W 29.8±4.3 40.9±7.9# 5.08±1.26 6.30±2.73* 4.09±1.69*NS-5GTW-2W 28.6±2.7 42.3±5.2*# 5.48±1.30 5.07±1.23* 3.22±0.65*NS-GTW＋FSM-2W 27.8±2.8* 45.8±4.0*# 7.32±3.16 4.45±1.75* 3.29±0.82*NS-5GTW＋FSM-2W 30.3±3.4 44.4±4.8*# 5.93±2.81 5.39±1.15* 3.74±1.55*

與對照組（C）比較：*P＜0.05；與模型組（NS）比較：#P＜0.05；N/A 表示未測定，不適用。*P < 0.05 vs control group (C); #P < 0.05 vs model group (NS); N/A indicates that it has not been measured and is not applicable.

3.3 各組大鼠腎臟病理變化

如圖2 所示，對照組、C-GTW＋FMS-2W 組、C-5GTW＋FMS-2W 組表現(xiàn)相似，腎臟組織結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小囊大小正常，腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見萎縮、擴張、變性壞死、管型。模型組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)大致正常，腎小球輕度萎縮，腎小囊輕度擴張，腎小管可見輕度萎縮、變性，未見壞死及管型，間質(zhì)可見輕度纖維化、少量炎細胞浸潤。NSGTW-2W 組、NS-GTW＋FSM-2W 組、NS-5GTW-2W 組及NS-5GTW＋FSM-2W 組表現(xiàn)類似，腎臟組織結(jié)構(gòu)大致正常，偶見腎小球輕度萎縮，未見纖維化、變性，偶見腎小囊輕度擴張，腎小管結(jié)構(gòu)正常，未見間質(zhì)纖維化，偶見淋巴細胞浸潤。病理結(jié)果一定程度揭示了2 藥合用對NS 的療效。

3.4 各組大鼠腎臟OAT1 和OAT3 蛋白表達

如圖3 所示，與對照組比較，NS-5GTW＋FSM-2W 組大鼠腎組織OAT1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），NS-GTW＋FSM-2W 組和NS-5GTW＋FSM-2W 組OAT3 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腎臟OAT1 和OAT3 蛋白表達 (±s , n = 3)Fig.3 OAT1 and OAT3 protein expressions in kidney of rats in each group (±s , n = 3)

4 討論

臨床上使用雷公藤多苷片治療慢性腎臟病已有超過40 年歷史[9]，因其療效及毒性關(guān)系，許多團隊關(guān)注其藥動學及藥物合用問題。Wu 等[10]對NS 大鼠雷公藤多苷片藥動學進行了分析，其關(guān)于雷公藤次堿、雷公藤晉堿、雷公藤定堿和雷公藤春堿結(jié)果與本研究吻合，證實雷公藤多苷片對NS 的療效，且出現(xiàn)一定程度肝損傷。本研究明確提示NS 狀態(tài)下CRE、尿蛋白的升高，結(jié)合病理結(jié)果，可一定程度反映腎小球的損傷及濾過率的降低，參考其他研究中藥物因患者腎小球濾過率降低而發(fā)生蓄積的現(xiàn)象，雷公藤多苷片成分血漿暴露升高也可能由腎小球濾過率的降低引起[11]。對于肝損傷本研究中在對照組中合用雷公藤多苷片和呋塞米，肝功能指標AST 和ALP 的活性呈現(xiàn)一定水平的升高，提示肝損風險，而NS 合用組未顯示肝功能異常，提示NS下合用呋塞米可一定程度保護雷公藤多苷片對肝臟損傷。雷公藤多苷片暴露與劑量呈非線性，可能由于給藥頻率為1 次/d，瞬時濃度過高，遠超機體代謝能力所致[12]。

呋塞米是OATs 的特異性底物[13]，腎臟中OAT1/3富集，腎損傷時會導致OATs 表達顯著下降[14]；呋塞米藥品說明書提示NS 狀態(tài)下，由于腸壁水腫，口服吸收率會下降，這些均可能影響呋塞米藥動學行為。本研究中觀察到NS 組中呋塞米暴露顯著降低，經(jīng)雷公藤多苷片治療后有所回升，從藥動學角度分析2 藥合用治療NS，對于呋塞米有一定程度的恢復作用。既往研究表明對健康大鼠飼喂極大劑量雷公藤后表現(xiàn)出腎臟OAT1/3 的抑制作用[15]。但本研究應(yīng)用臨床治療劑量的雷公藤多苷片干預NS大鼠可一定程度恢復其腎臟OATs 的表達，但使用高劑量并合用呋塞米后，則會明顯降低OATs 蛋白表達，增加腎臟負擔，提示可能存在一定風險。

綜上，NS 下腎功能受損，OATs 表達下降，雷公藤多苷片成分暴露升高，呋塞米暴露降低。經(jīng)正常劑量的雷公藤多苷片治療后，OATs 表達有所恢復，CRE 水平降低，證明雷公藤多苷片對NS 的療效，合用呋塞米可降低雷公藤多苷片過高暴露引起的肝損風險，2 藥正常劑量合用安全性較好。臨床實踐中，需要關(guān)注病人肝、腎臟功能變化情況，恰當把控雷公藤多苷片的給藥劑量和頻度，并對癥合用呋塞米，促進2 藥合理聯(lián)用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突