紅紫珠二萜類成分及其抗炎活性研究

張雪兒，黃逸敏，方巧苗，趙鐘祥，林朝展，祝晨蔯，吳愛(ài)芝

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

紫珠屬CallicarpaLinn.植物源于馬鞭草科（Verbenaceae），全球有190 多種，在我國(guó)約有30種可作藥用。該屬植物性涼、味苦澀，具有活血散瘀、消腫止痛功效，可用于治療跌撲腫痛、肺熱咳嗽、熱毒瘡瘍和水火燙傷等。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，萜類、黃酮類和苯乙醇苷類化學(xué)成分在紫珠屬植物中含量豐富，其中萜類化合物是該屬植物中一類重要的活性成分，主要含倍半萜、二萜和三萜[1]。目前該屬植物中已鑒定出的二萜類化合物有200 余種，部分化合物顯示了良好的抗炎和抗菌等生物活性[2-5]。

紅紫珠CallicarparubellaLindl.為馬鞭草科紫珠屬植物，又稱小紅米果，多產(chǎn)于亞熱帶，主要分布在廣西、廣東和江西等地，藥用部位為葉和嫩枝?！吨兴幋筠o典》記載紅紫珠能夠涼血止血、解毒消腫、祛風(fēng)止痛，具有抗炎、促凝血和抗菌等藥理作用，多用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷及各科出血癥。紅紫珠作為嶺南地區(qū)民間常用草藥，現(xiàn)階段對(duì)該植物的研究較少，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

本課題組對(duì)紅紫珠枝葉的甲醇提取物進(jìn)行系統(tǒng)分離純化，得到20 個(gè)二萜類化合物，分別鑒定為kolavic acid-15-metyl ester（1）、rubellapene A（2）、rubellapene B（3）、rubellapene C（4）、13,14,15,16-四降碳-3-克羅-12,18-二羧酸（13,14,15,16-tertranor-3-clerodene-12,18-dioic acid，5）、對(duì)映異海松烷-8(14),15-烯-19-羧酸 [ent-isopimar-8(14),15-dien-19-oic acid，6]、dichrocephnoids C（7）、15-去甲基半日-8(20)12E-二烯-14-甲醛-19-羧酸 [15-norlabda-8(20)12E-diene-14-carboxaldehyde-19-oic acid，8]、8S-kolavic acid 15-methyl ester（9）、粘葉蕕酸（glutinic acid，10）、melanocane B（11）、dodovislactones B（12）、tinotufolin B（13）、amphiacric acid A（14）、patagonic acid（15）、(＋)-15-methoxyfloridolide A（16）、去甲基-左旋哈氏豆屬酸（nor-hardwicknc acid，17）、15-羥基-16-羰基-15,16H-左旋哈氏豆屬酸（ 15-hydroxy-16-oxo-15,16Hhardwickiic acid，18）、(?)-順式-克羅-3,13-烯-16-羥基-15,18-二羧酸-15,16-內(nèi)酯 [(?)-cis-cleroda-3,13-dien-16-hydroxy-15,18-dioic acid-15,16-olide，19]、polylauioid J（20）。其中，化合物5、7～14、16～20 為首次從紫珠屬植物中分離，其余化合物為首次從紅紫珠中分離得到。體外抗炎活性實(shí)驗(yàn)表明，6個(gè)結(jié)構(gòu)差異明顯的二萜類化合物可以抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO 的分泌，化合物1 抑制NO 分泌能力最強(qiáng)。

1 材料

AVANCE-400 型400MHz 核磁共振儀（德國(guó)布魯克光譜儀器公司）；Triple TOF 5600＋高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)AB Sciex 公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津儀器公司）；LC-100 型半制備型高效液相色譜儀（上海伍豐科學(xué)儀器有限公司）；Multiskan FC 酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司）。Kromasil 100-5 C18柱制備型色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱色譜硅膠（100～200、200～300 目，青島海洋化工有限公司）；Sephadex LH 20 凝膠色譜填料（瑞典GE Healthcare 公司）；ODS 色譜填料（日本YMC公司）；MTT 噻唑藍(lán)（美國(guó)Sigma 公司）；地塞米松對(duì)照品、LPS（大連美倫生物科技有限公司）；NO 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）。

實(shí)驗(yàn)所用紅紫珠栽培品于2019 年購(gòu)自于廣西欽州，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)彭光天副教授鑒定為馬鞭草科紫珠屬植物紅紫珠C.rubellaLindl.的地上部分，標(biāo)本（20190419）存放于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院天然產(chǎn)物研究室。

2 方法

2.1 提取分離

干燥紅紫珠枝葉（10 kg）粉碎，120 L 甲醇滲漉提取3 次，提取液減壓濃縮后得到浸膏（1.2 kg）。浸膏加水渾懸，依次用石油醚（3×4 L）、醋酸乙酯（3×4 L）、正丁醇（3×4 L）進(jìn)行萃取，萃取液減壓濃縮得到石油醚部位（290 g）、醋酸乙酯部位（150 g）、正丁醇部位（350 g）和水部位（320 g）。

醋酸乙酯部位（150 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）洗脫，得到5 個(gè)流分組Fr.A～E。Fr.A 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜分離，二氯甲烷-甲醇（2∶1）洗脫，得到3 個(gè)流分組Fr.A-1～A-3。Fr.A-3 經(jīng) ODS 柱色譜，甲醇-水（30%→100%）洗脫后，經(jīng)重結(jié)晶得到化合物13（631.4 mg）。Fr.B 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.B-1～B-2。Fr.B-1 重結(jié)晶后得到化合物1（1.5 g）。Fr.B-2重結(jié)晶后得到化合物14（1.5 g）。Fr.C 經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-二氯甲烷（2∶1→0∶1）洗脫，得到4個(gè)流分組Fr.C-1～C-4。Fr.C-2 經(jīng)制備液相（甲醇-水70∶30）得到化合物15（6.4 mg）。Fr.D 經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-二氯甲烷（4∶1→0∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.D-1～D-2。Fr.D-1 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.D-1-1～D-1-2。Fr.D-1-1 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸60∶40）得到化合物16（10 mg）。Fr.D-1-2 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸60∶40）得到化合物17（17.7 mg）。Fr.D-2 經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2個(gè)流分組Fr.D-2-1～D-2-2。Fr.D-2-1 經(jīng)反相ODS柱色譜，甲醇-水（30%→100%）洗脫，再經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸60∶40）得到化合物4（4.9 mg）和18（12.7 mg）。Fr.D-2-2 經(jīng)ODS 柱色譜，甲醇-水（30%→100%）洗脫，得到2 個(gè)流分Fr.D-2-2-1～D-2-2-2。Fr.D-2-2-2 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸水60∶40）得到化合物19（35.2 mg）。

石油醚部位（290 g）經(jīng)硅膠柱色譜，石油醚-醋酸乙酯（1∶0→0∶1）洗脫，得到4 個(gè)流分組Fr.A～D。Fr.A 經(jīng)反相 ODS 柱色譜，甲醇-水（60%→100%）洗脫，得到3 個(gè)流分組Fr.A-1～A-3。Fr.A-1 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸60∶40）得到化合物5（4.1 mg）。Fr.A-3 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物6（36.8 mg）。Fr.B 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.B-1～B-2。Fr.B-2 經(jīng)正相硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷（8∶1→0∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.B-2-1～B-2-2。Fr.B-2-1 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸水75∶25）得到化合物2（47.7 mg）。Fr.B-2-2經(jīng)反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（60%→100%）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.B-2-2-1～B-2-2-2。Fr.B-2-2-1 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸80∶20）得到化合物7（18 mg）和8（24.8 mg）。Fr.B-2-2-2 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物9（907.5 mg）。Fr.C 經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分Fr.C-1～C-2。Fr.C-1 經(jīng)重結(jié)晶得到化合物10（45.3 mg）。Fr.C-2 經(jīng)反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（40%→100%）洗脫，再經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸70∶30）得到化合物3（9.9 mg）。Fr.D經(jīng)Sephadex LH-20 凝膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.D-1～D-2。Fr.D-1 經(jīng)反相ODS 柱色譜，甲醇-水（40%→100%）洗脫，再經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸75∶25）得到化合物11（13.2 mg）。Fr.D-2 經(jīng)反相ODS 柱色譜，甲醇-水（30%→100%）洗脫，得到2 個(gè)流分組Fr.D-2-1～D-2-2。Fr.D-2-1 經(jīng)制備液相（甲醇-0.1%甲酸65∶35）得到化合物20（10.3 mg）。Fr.D-2-2 經(jīng)制備液相色譜（甲醇-0.1%甲酸水70∶30）得到化合物12（2.2 mg）。

2.2 抗炎活性研究

2.2.1 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 DMEM培養(yǎng)基中加入RAW264.7細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2），移液槍吹打脫落后傳代。培養(yǎng)24 h 后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，計(jì)數(shù)并稀釋細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板，設(shè)置對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、陽(yáng)性對(duì)照組（10、50 μmol/L地塞米松溶液）和實(shí)驗(yàn)組（100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L 供試品溶液），每組3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后，加入MTT 溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO，采用酶標(biāo)儀于490 nm處檢測(cè)吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.2.2 Griess 法檢測(cè)藥物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌水平的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×l05個(gè)/mL，每孔100 μL 接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h 至細(xì)胞貼壁。分別設(shè)置對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組3 個(gè)復(fù)孔，給藥同“2.2.1”項(xiàng)，孵育2 h 后除對(duì)照組外加入LPS（1 μg/mL），培養(yǎng)24 h。取50 μL 細(xì)胞上清液，加入50 μL Griess Reagent I，反應(yīng)10 min 后加入50 μL Griess Reagent II，繼續(xù)反應(yīng)10 min。采用酶標(biāo)儀于540 nm 處測(cè)定A值，計(jì)算NO 釋放量。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色結(jié)晶（甲醇-水），mp 114.6～116.4 ℃；HR-ESI-MSm/z347.230 1 [M－H]?（計(jì)算值347.230 1，C21H31O4）給出分子式為C21H32O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.80 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-3), 1.56 (1H, m, H-8), 1.62 (1H, d,J= 5.4 Hz,H-10), 5.68 (1H, s, H-14), 2.17 (3H, s, H-16), 0.77(3H, d,J= 7.3 Hz, H-17), 1.23 (3H, s, H-19), 0.81(3H, s, H-20), 3.68 (3H, s, H-21)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[6]，故鑒定化合物1為kolavic acid-15-metyl ester。

表1 化合物1～10 的13C-NMR 數(shù)據(jù)Table 1 13C-NMR data of compounds 1—10

為了進(jìn)一步確定該化合物的絕對(duì)構(gòu)型，在二氯甲烷-甲醇中培養(yǎng)獲得單晶，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行X-ray 單晶衍射測(cè)試，得到晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)已保存在英國(guó)劍橋晶體學(xué)數(shù)據(jù)中心（ Cambridge Crystallographic Data Centre，CCDC），發(fā)表號(hào)為2205217。單晶橢球圖見(jiàn)圖1。

圖1 化合物1 的X-射線單晶結(jié)構(gòu)圖Fig.1 X-ray single crystallographic structure of compound 1

單晶X 射線衍射實(shí)驗(yàn)的單晶結(jié)構(gòu)精修參數(shù)：分子式為C21H32O4；相對(duì)分子質(zhì)量為348.46；T＝293(2)K；供試晶體屬斜方晶系，空間群為P212121；晶胞參數(shù)：a＝7.427 60(10) nm，b＝17.135 2(2) nm，c＝31.478 5(4) nm，α＝90°，β＝90°，γ＝90°，晶胞體積V＝4 006.38(9) nm3；晶胞內(nèi)分子數(shù)Z＝8；計(jì)算密度ρcalc＝1.155 g/cm3；μ＝0.624 mm?1；F(000) ＝1 520.0；Radiation＝CuKα (λ＝1.541 78)；Flack parameter＝0.1(6)；Hooft parameter＝0.06(11)。

化合物2：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z371.218 8 [M＋Na]+（計(jì)算值371.218 8，C21H32O4Na）給出分子式C21H32O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.79 (1H, m, H-1a),2.07 (1H, m, H-1b), 1.62 (2H, m, H-2), 1.48 (1H, m,H-3a), 2.07 (1H, m, H-3b), 1.79 (1H, m, H-6a), 2.07(1H, m, H-6b), 1.48 (2H, m, H-7), 1.62 (1H, m, H-8),1.48 (2H, m, H-11), 1.79 (1H, m, H-12a), 2.07 (1H, m,H-12b), 5.65 (1H, s, H-14), 2.16 (3H, s, H-16), 0.86(3H, d,J= 6.7 Hz, H-17), 1.27 (3H, s, H-18), 0.88(3H, s, H-20), 3.68 (3H, s, H-21)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]，故鑒定化合物2 為rubellapene A。

化合物3：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z291.196 3 [M－H]?（計(jì)算值291.196 3，C18H27O3）給出分子式為C18H28O3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.79 (1H, m, H-1a),1.99 (1H, m, H-1b), 2.31 (2H, m, H-2), 6.75 (1H, s,H-3), 1.07 (1H, m, H-6a), 2.71 (1H, d,J= 12.8 Hz,H-6b), 1.07 (1H, m, H-7a), 1.26 (1H, m, H-7b), 1.35(1H, m, H-8), 1.26(1H, m, H-10), (1H, m, H-11a),(1H, m, H-11b), 2.31 (2H, m, H-12), 2.17 (3H, s,H-14), 0.74 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-15), 1.21 (3H, s,H-17), 0.79 (3H, s, H-18)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]，故鑒定化合物3 為rubellapene B。

化合物4：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇，HR-ESI-MSm/z361.201 5 [M－H]?（計(jì)算值361.201 5，C21H29O5）給出分子式為C21H30O5；1HNMR (400 MHz, MeOD)δ: 6.41 (1H, s, H-3), 5.92(1H, s, H-14), 4.90 (2H, d,J= 1.8 Hz, H-15 ), 4.16(1H, m, H-2), 3.41 (3H, s, H-21), 2.55 (1H, m, H-6),2.34 (3H, m, H-1), 2.02 (1H, m, H-1), 1.79 (1H, m,H-11), 1.69 (1H, m, H-10), 1.58 (2H, m, H-10, 11),1.37 (3H, s, H-19), 1.24 (2H, m, H-6, 7), 0.82 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-17), 0.81 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[4]，故鑒定化合物4 為rubellapene C。

化合物5：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z281.167 5 [M＋H]+（計(jì)算值281.167 5，C16H25O4）給出分子式為 C16H24O4；1H-NMR (400 MHz, MeOD)δ: 1.84 (1H, m, H-2), 1.43 (2H, m,H-3), 1.10 (1H, m, H-4a), 2.04 (1H, m, H-4b), 6.54(1H, d,J= 3.9 Hz, H-7), 2.16 (2H, m, H-8), 1.32 (1H,m, H-9a), 1.84 (1H, m, H-9b), 1.58 (1H, m, H-10),2.33 (1H, d,J= 13.0 Hz, H-11a), 2.65 (1H, d,J= 13.0 Hz, H-11b), 0.82 (3H, s, H-12), 0.77 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-13), 1.22 (3H, s, H-14)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[7]，故鑒定化合物5 為13,14,15,16-四降碳-3-克羅-12,18-二羧酸。

化合物 6：白色粉末，易溶于二氯甲烷；HR-ESI-MSm/z325.224 1 [M ＋Na]+（計(jì)算值325.224 1，C20H30O2Na）給出分子式為C20H30O2；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.14 (1H, m, H-1a),1.77 (1H, m, H-1b), 1.58 (1H, m, H-2a), 1.57 (1H, m,H-2b), 1.79 (1H, m, H-3a), 1.67 (1H, d,J= 1.2 Hz,H-3b), 1.92 (1H, dd,J= 2.6, 12.4 Hz, H-5), 1.47 (1H,m, H-6a), 1.28 (1H, m, H-6b), 2.22 (1H, ddd,J= 2.1,4.9, 14.3 Hz, H-7a), 2.12 (1H, dt,J= 5.7, 13.5 Hz,H-7b), 1.81 (1H, m, H-9), 1.58 (1H, m, H-11a), 1.57(1H, m, H-11b), 1.44 (1H, m, H-12a), 1.38 (1H, m,H-12b), 5.22 (1H, brs, H-14), 5.77 (1H, dd,J= 10.6,17.4 Hz, H-15), 4.90 (2H, m, H-16), 1.04 (3H, s,H-17), 1.21 (3H, s, H-18), 0.84 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8]，故鑒定化合物6 為對(duì)映異海松烷-8(14),15-烯-19-羧酸。

化合物7：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z307.190 8 [M－H]?（計(jì)算值307.190 8，C18H27O4）給出分子式為C18H28O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.95 (1H, m, H-1a), 1.82 (1H, m,H-1b), 2.35 (1H, m, H-2a), 2.21 (1H, m, H-2b), 6.77(1H, brs, H-3), 1.36 (1H, m, H-8), 1.29 (1H, dd,J=12.0, 2.0 Hz, H-10), 0.77 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14),0.80 (3H, s, H-16), 1.22 (3H, s, H-17), 3.67 (3H, s,H-18)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[9]，故鑒定化合物7 為dichrocephnoids C。

化合物8：淡黃色油狀物，易溶于二氯甲烷；HR-ESI-MSm/z305.218 1 [M＋H]+（計(jì)算值305.218 1，C19H29O3）給出分子式為C19H28O3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.92 (1H, s, H-9), 6.43 (1H, brt,J=6.5 Hz, H-12), 9.33 (1H, s, H-14), 1.75 (3H, s, H-15),1.25 (3H, s, H-18), 0.68 (3H, s, H-19)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10]，故鑒定化合物8為15-去甲基半日-8(20)12E-二烯-14-甲醛-19-羧酸。

化合物9：淡黃色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z349.230 1 [M＋H]+（計(jì)算值349.230 1，C21H33O4）給出分子式為C21H32O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.83 (1H, dd,J= 2.8,4.7 Hz, H-3), 1.46 (1H, m, H-8), 5.65 (1H, s, H-14),2.16 (3H, brs, H-16), 0.81 (3H, d,J= 5.7 Hz, H-17),0.75 (3H, s, H-19), 1.24 (3H, s, H-20), 3.68 (3H, s,H-21)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故鑒定化合物9 為8S-kolavic acid 15-methyl ester。

化合物10：白色粉末，易溶于丙酮和吡啶；HR-ESI-MSm/z335.203 5 [M＋H]+（計(jì)算值335.203 5，C20H31O4）給出分子式為C20H30O4；1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6)δ: 6.70 (1H, t,J= 3.4 Hz, H-3),5.70 (1H, s, H-14), 1.25 (3H, s, H-17), 0.83 (3H, d,J=6.3 Hz, H-18), 0.77 (3H, s, H-19), 2.15 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[12]，故鑒定化合物10 為粘葉蕕酸。

化合物11：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z317.213 1 [M－H]?（計(jì)算值317.213 1，C20H29O3）給出分子式為C20H30O3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.98 (1H, m, H-1a), 1.02 (1H, d,J=9.5 Hz, H-1b), 1.98 (1H, m, H-2a), 1.59 (1H, m,H-2b), 2.23 (1H, m, H-3a), 1.02 (1H, d,J= 9.5 Hz,H-3b), 1.32 (1H, dd,J= 3.6, 7.9 Hz, H-5), 1.98 (1H,m, H-6a), 1.73 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-6b), 1.98 (2H, m,H-7), 2.23 (1H, m, H-11a), 1.59 (1H, m, H-11b), 1.59(2H, m, H-12), 0.59 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-14), 1.32(1H, m, H-15), 3.57 (1H, dd,J= 7.9, 11.4Hz, H-16a),3.70 (1H, dd,J= 7.1, 11.3 Hz, H-16b), 1.19 (3H, s,H-17), 1.16 (3H, s, H-19), 0.90 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[13]，故鑒定化合物11 為melanocane B。

表2 化合物11～20 的13C-NMR 數(shù)據(jù)Table 2 13C-NMR data of compounds 11—20

化合物12：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z363.209 7 [M＋H]+（計(jì)算值363.209 7，C21H31O5）給出分子式為 C21H30O5；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.76 (2H, m, H-1),2.31 (2H, m, H-2), 6.80 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-3), 2.73(1H, d,J= 13.1 Hz, H-6a), 1.10 (1H, m, H-6b), 1.10(1H, m, H-7a), 1.38 (1H, dd,J= 4.6, 13.0 Hz, H-7b),1.57(1H, m, H-8), 1.57 (1H, m, H-10), 1.57 (1H, m,H-11a), 1.38 (1H, dd,J= 4.6, 13.0 Hz, H-11b), 2.31(2H, m, H-12), 5.88 (1H, s, H-14), 5.65 (1H, s, H-16),0.76 (3H, s, H-17), 1.24 (3H, s, H-19), 0.82 (3H, s,H-20), 3.58 (3H, s, H-21)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[14]，故鑒定化合物12 為dodovislactones B。

化合物13：淡黃色結(jié)晶，易溶于二氯甲烷和甲醇，mp 90.6～92.3 ℃；HR-ESI-MSm/z315.203 8[M－H]?（計(jì)算值315.203 8，C20H27O3）給出分子式為C20H28O3；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.90(1H, m, H-1a), 2.04 (1H, m, H-1b), 2.32 (2H, m, H-2),6.81 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-3), 2.75 (1H, m, H-6a), 1.16(1H, m, H-6b), 1.16 (1H, m, H-7a), 1.31 (1H, m, H-7b),1.58 (1H, m, H-8), 1.51 (1H, dd,J=1.0, 6.6 Hz, H-10),1.55 (1H, m, H-11a), 1.70 (1H, m, H-11b), 2.32 (2H, m,H-12), 6.27 (1H, dd,J= 0.9, 1.9 Hz, H-14), 7.23 (1H, m,H-15), 7.35 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-16), 0.80 (3H, d,J=2.1 Hz, H-17), 1.26 (3H, s, H-19), 0.81 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[15]，故鑒定化合物13 為tinotufolin B。

化合物14：白色結(jié)晶（二氯甲烷-甲醇），mp 164.5～166.4 ℃；HR-ESI-MSm/z333.200 6 [M＋H]+（計(jì)算值333.200 6，C20H29O4）給出分子式為C20H28O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.04 (1H,m, H-1a), 1.75 (1H, m, H-1b), 2.26 (1H, m, H-2a),2.37 (1H, m, H-2b), 6.80 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-3),1.11 (1H, m, H-6a), 2.73 (1H, m, H-6b), 1.30 (1H, m,H-7a), 1.11 (1H, m, H-7b), 1.49 (1H, m, H-8), 1.37(1H, dd,J= 1.5, 6.5 Hz, H-10), 1.49 (1H, m, H-11a),1.75 (1H, m, H-11b), 2.26 (2H, m, H-12), 5.84 (1H, d,J= 1.7 Hz, H-14), 4.75 (2H, d,J= 1.7 Hz, H-16), 0.76(3H, d,J= 6.8 Hz, H-17), 1.23 (3H, s, H-19), 0.81 (3H,s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[16]，故鑒定化合物14 為amphiacric acid A。

化合物15：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z333.198 8 [M ＋H]+（計(jì)算值333.198 8，C20H29O4）給出分子式為 C20H28O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.77 (1H, t,J= 3.9 Hz, H-3), 7.10 (1H, t,J= 1.8 Hz, H-14), 4.77 (2H, d,J= 2.0 Hz, H-15), 0.78 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-17), 1.23(3H, s, H-19), 0.80 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[17]，故鑒定化合物15為patagonic acid。

化合物16：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-Mm/z363.209 3 [M＋H]+（計(jì)算值363.209 3，C21H31O5）給出分子式為C21H30O5；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.84 (1H, dd,J= 8.8, 15.4 Hz, H-1a),2.04 (1H, m, H-1b), 2.28 (2H, m, H-2), 6.77 (1H, d,J= 1.6 Hz, H-3), 1.11 (1H, m, H-6a), 2.72 (1H, dd,J=3.7, 11.7 Hz, H-6b), 1.29 (1H, m, H-7a), 1.45 (1H,d,J= 6.6 Hz, H-7b), 1.50 (1H, m, H-8), 1.50 (1H, m,H-10), 1.70 (1H, m, H-11a), 1.12 (1H, m, H-11b), 2.28(2H, m, H-12), 6.79 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-14), 5.73 (1H,d,J= 1.4 Hz, H-15), 0.77 (3H, d,J= 2.2 Hz, H-17), 1.23(3H, s, H-19), 0.80 (3H, s, H-20), 3.57 (3H, s, H-21)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[18]，故鑒定化合物16 為 (＋)-15-methoxyfloridolide A。

化合物17：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z: 293.183 1 [M－H]?（計(jì)算值293.183 1，C17H25O4）給出分子式為C17H26O4；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 6.39 (1H, d,J= 3.4 Hz, H-3), 0.71 (3H, d,J= 6.7 Hz, H-14), 0.73 (3H, s,H-16), 1.16 (3H, s, H-17)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[19]，故鑒定化合物17 為去甲基-左旋哈氏豆屬酸。

化合物18：白色粉末，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z349.193 7 [M ＋H]+（計(jì)算值349.193 7，C20H29O5）給出分子式為C20H28O5；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.84 (1H, dd,J= 8.8,15.2 Hz, H-1a), 2.05 (1H, m, H-1b), 2.35 (1H, m,H-2a), 2.28 (1H, ddd,J= 1.5, 3.6, 9.5 Hz, H-2b), 6.84(1H, d,J= 1.5 Hz, H-3), 1.14 (1H, m, H-6a), 2.73(1H, dd,J= 3.8, 11.5 Hz, H-6b), 1.31 (1H, d,J= 11.3 Hz, H-7a), 1.45 (1H, m, H-7b), 1.50 (1H, m, H-8),1.50 (1H, m, H-10), 1.70 (1H, m, H-11a), 1.14 (1H, m,H-11b), 2.20 (2H, ddq,J= 1.8, 6.0, 9.6 Hz, H-12),6.80 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-14), 6.10 (1H, d,J= 1.4 Hz,H-15), 0.78 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-17), 1.24 (3H, s, H-19),0.81 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[20]，故鑒定化合物18 為15-羥基-16-氧化-15,16H-左旋哈氏豆屬酸。

化合物19：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z349.193 7 [M＋H]+（計(jì)算值349.193 7，C20H29O5）給出分子式為 C20H28O5；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.85 (2H, m, H-1),2.32 (2H, m, H-2), 6.55 (1H, t,J= 3.8 Hz, H-3), 1.15(1H, m, H-6a), 1.85 (1H, m, H-6b), 1.15 (1H, m,H-7a), 1.51 (1H, m, H-7b), 1.51 (1H, m, H-8), 1.51(1H, m, H-10), 1.15 (1H, m, H-11a), 1.57 (1H, m,H-11b), 2.32 (2H, m, H-12), 5.92 (1H, s, H-14), 6.02(1H, s, H-16), 0.82 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-17), 1.27(3H, s, H-19), 0.88 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[21]，故鑒定化合物19為 (?)-順式-克羅-3,13-烯-16-羥基-15,18-二羧酸-15,16-內(nèi)酯。

化合物20：無(wú)色油狀物，易溶于二氯甲烷和甲醇；HR-ESI-MSm/z365.188 6 [M＋H]+（計(jì)算值365.188 6，C20H29O6）給出分子式為C20H28O6；1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 1.45 (1H, d,J= 6.2 Hz, H-1a), 2.05 (1H, m, H-1b), 2.31 (2H, m, H-2),6.79 (1H, d,J= 3.9 Hz, H-3), 1.45 (1H, d,J= 6.2 Hz,H-6a), 1.79 (1H, m, H-6b), 1.45 (1H, d,J= 6.2 Hz,H-7a), 1.52 (1H, m, H-7b), 1.79 (1H, m, H-8), 1.45(1H, d,J= 6.2 Hz, H-10), 1.13 (1H, m, H-11a), 2.31(1H, m, H-11b), 2.72 (2H, m, H-12), 6.29 (1H,s,H-14), 0.79 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-17), 1.25 (3H, s,H-19), 0.83 (3H, s, H-20)。碳譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[22]，故鑒定化合物20 為polylauioid J。

4 體外抗炎活性評(píng)價(jià)

為了對(duì)二萜類化合物的抗炎作用進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，尋找具有良好抗炎活性的化合物，采用LPS 刺激小鼠RAW264.7 巨噬細(xì)胞作為體外炎癥細(xì)胞模型，選取紅紫珠中分離得到的6 個(gè)結(jié)構(gòu)差異明顯的二萜類化合物（圖2），即化合物1、8、11、13、14、16 進(jìn)行抗炎活性測(cè)試，地塞米松（dexamethasone，DEX）為陽(yáng)性藥。

圖2 6 個(gè)二萜化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Chemical structures of six diterpenoids

4.1 化合物對(duì)細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

采用MTT 法分別測(cè)試6 個(gè)化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組對(duì)比，6 個(gè)二萜類化合物在3.125～100 μmol/L 對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞沒(méi)有顯著的細(xì)胞毒性（P＞0.05）。

4.2 化合物對(duì)NO 水平的影響

采用Griess 法檢測(cè)3.125～100 μmol/L 二萜類化合物對(duì)LPS 刺激小鼠RAW264.7 細(xì)胞中NO 含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。與對(duì)照組比較，給予LPS 刺激后，模型組NO 含量顯著升高。給藥24 h 后，與模型組比較，給藥組NO 含量顯著下降，且呈一定的劑量相關(guān)性，其中，化合物1 在50、100 μmol/L 濃度下，抑制NO 效果尤為顯著（P＜0.001）。對(duì)比結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，化合物1、13、14、16 為克羅烷型二萜，化合物8 為半日花烷型二萜，化合物11 為海松烷型二萜?；衔?、13、14、16 的最大區(qū)別為C-13 位的取代，化合物14 和16 為五元環(huán)內(nèi)酯取代，化合物13 為五元呋喃環(huán)取代，而化合物1 為開(kāi)環(huán)雙鍵取代，推測(cè)C-13位的開(kāi)環(huán)雙鍵有利于增強(qiáng)化合物的抗炎效果。

圖3 不同二萜化合物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO 含量的影響 (n = 3)Fig.3 Effects of different diterpenes on NO secretion in RAW264.7 cells (n = 3)

5 討論

關(guān)于紅紫珠植物化學(xué)成分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，僅肖偉烈課題組從采自貴州省興義市的紅紫珠枝葉獲得了以海松烷型和異海松烷型為主的三環(huán)二萜[22]。本課題組從采自廣西欽州的紅紫珠低極性部位分離得到20 個(gè)二萜類化合物，主要以克羅烷型和半日花烷型二環(huán)二萜為主，其中克羅烷型的化合物1、13和14 分布含量較高，可作為該植物代表性成分。本研究明確了紅紫珠中二萜類成分的結(jié)構(gòu)特征，揭示了其豐量成分，豐富了該植物的化學(xué)成分類型，為進(jìn)一步探討屬間和種間親緣關(guān)系提供了化學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突