經典名方清寧散HPLC 指紋圖譜及其質量標志物（Q-Marker）預測分析

劉玉婷，李 菡，趙宇晴，周晶晶，柯昌華，王燕子，趙倩倩，謝曉林，張德柱，高 鴻，梁承遠*

1.陜西科技大學生物與醫藥學院，陜西 西安 710021

2.陜西盤龍藥業集團股份有限公司，陜西 西安 710025

3.陜西帕尼爾生物科技有限公司，陜西 西安 710082

中醫藥是中華民族的瑰寶，經典名方是我國歷代醫家在不斷的傳承和實踐中凝結的智慧結晶[1]，是中醫理論、方劑發展的核心載體，更是其中的精華[2]。近年來，國家中醫藥管理局秉承“以健康為導向，圍繞優勢病種”的原則，于2018 年發布《古代經典名方目錄（第一批）》[3]，2023 年再度出臺《古代經典名方目錄（第二批兒科部分）》的通知[3]，以發揮中醫藥治療疾病的優勢，推動中醫藥復方制劑的快速發展。近年來，小兒疾病發病率逐年上升，兒童用藥也愈加受到關注，中藥因其療效穩定、藥性溫和、藥物不良反應少等優點，廣泛用于兒科疾病治療。清寧散收錄于《古代經典名方目錄（第二批兒科部分）》，出自清代陳復正所著的《幼幼集成》，全方由桑白皮、甜葶藶、赤茯苓、車前子、甘草5 味藥材組成，“治心肺有熱而令咳嗽，宜從小便利出[4]。”為肅肺利水止咳喘之劑。目前，對清寧散的研究多集中在臨床應用方面，其加減方常用于治療小兒痰熱壅肺型咳嗽、痤瘡等疾病，未其質量標準研究。

中藥復方成分復雜，通過多成分、多靶點、多途徑協同發揮療效[5]，對其單一成分的研究不能代表整體藥效，中藥指紋圖譜能夠全面、定量地反映中藥的化學信息[6]，是中藥及其制劑質量控制的有效手段。為保障中藥質量標準的科學性，需要確認影響其品質的功效關聯物質[7]，劉昌孝院士[8]于2016 年提出質量標志物（quality markers，Q-Marker）概念，從系統角度分析藥物與機體的交互作用，從而體現中醫治療疾病多途徑、多靶點的特點[9-10]。網絡藥理學具有整體性、系統性的特點與中醫藥整體觀、辨證論治原則一致[11-12]，本研究對清寧散的物質構成進行初步研究，并利用網絡藥理學構建“成分-靶點-通路”網絡，綜合預測分析清寧散發揮臨床療效的潛在Q-Marker，揭示其治療疾病的科學內涵，為清寧散及其制劑的質量控制及作用機制研究打下基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-16 型高效液相色譜儀，島津儀器有限公司；Ulti-Mate 3000 型超高效液相色譜-Orbitrap 質譜儀，戴安中國有限公司；LE204E/02 型電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；YM-100S 型超聲波清洗機，深圳市方奧微電子有限公司；FSJ-A05N6 型多功能粉碎機，小熊電器股份有限公司；WFH-203B 型紫外線分析儀，上海精科實業有限公司；JHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱，西安莫吉娜儀器制造有限公司；30MF53L 型煎藥鍋，潮州市潮安區龍光電器有限公司。

1.2 試藥

對照品異鼠李素（批號110860-202012，質量分數99.1%）、甘草苷（批號111610-202209，質量分數95.2%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號111702-202107，質量分數98.4%）、甘草酸銨（批號110731-202122，質量分數94.4%）、槲皮素（批號100081-201610，質量分數99.8%）、綠原酸（批號110753-202119，質量分數96.3%）、京尼平苷酸（批號111828-201805，質量分數98.1%）、桑皮苷A（批號112086-202101，質量分數97.2%）、毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質量分數95.2%）、芹菜素（批號111901-202004，質量分數99.4%），均購自于中國食品藥品檢定研究院；對照品β-胡蘿卜苷（批號PS0811-0025，質量分數98%）、松苓新酸（批號PS0533-0020，質量分數97%）、去氫土莫酸（批號PS1095-0020，質量分數98%）、甘草查耳酮A（批號PS0389-0020，質量分數98%）、桑黃酮G（批號PS1823-0020，質量分數98.5%）、桑辛素（批號PS1304-0025，質量分數98%）、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷（批號PS0618-0020，質量分數98%）、茯苓新酸A（批號PS1094-0010，質量分數97%），均購自于成都普思生物科技股份有限公司；對照品甘草酸（批號20070203，質量分數98.27%）購自于成都普菲德生物技術有限公司；乙腈、磷酸，色譜純，美國Fisher公司；甲醇，天津市天力化學試劑有限公司；超純水，上海娃哈哈飲用水有限公司；其他試劑均為分析純。

方中桑白皮、甜葶藶、赤茯苓、車前子、甘草5 味藥材均購自道地產區或主產區，每味藥材收集于多個產地，總批次不少于15 批次，由青海省藥品檢驗檢測院中藥檢驗員王珺檢驗，留樣標本存放于青海省藥品檢驗檢測院，各藥材基原、藥用部位、產地及采收加工方法均已明確。其中桑白皮來自河南、四川、湖南3 個產地共15 批，均為桑科桑屬植物桑MorusalbaL.的干燥根皮；甜葶藶來自江蘇、安徽、山東3 個產地共15 批，為十字花科播娘蒿屬植物播娘蒿Descurainiasophia(L.) Webb.ex Prantl.的干燥成熟種子，也稱南葶藶；赤茯苓來自安徽、云南、河北3 個產地共15 批，為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 呈淡棕色、淡紅色的干燥菌核；車前子來自廣東、吉林、河北3 個產地共15 批，為車前科車前屬植物車前Plantago asiaticaL.的干燥成熟種子；甘草來自山西、寧夏、新疆3 個產地共15 批，為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

本實驗前期已按照《中國藥典》2020 年版一部各“藥材和飲片”項下各單味藥材項下的檢測方法對藥材進行檢測，各藥材質量均符合要求。藥材來源與批號見表1。

表1 清寧散藥材來源信息Table 1 Source information of Qingning Powder

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～10 min，10%乙腈；10～20 min，10%～20%乙腈；20～30 min，20%～23%乙腈；30～40 min，23%～30%乙腈；40～60 min，30%～40%乙腈；60～80 min，40%～45%乙腈；80～100 min，45%～58%乙腈；100～120 min，58～63%乙腈；檢測波長：0～15 min，254 nm；15～43 min，280 nm；43～120 min，254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min；進樣量25 μL。

2.2 清寧散基準樣品的制備

2.2.1 桑白皮炮制研究 根據《中國藥典》2020 年版炮制通則，確定桑白皮的炮制方法為煉蜜加水稀釋后拌入桑白皮中，悶透后炒至規定程度，以桑皮苷A 的含量為響應值（Y），考察煉蜜量（X1）、悶透時間（X2）、炮制溫度（X3）的影響，單因素實驗表明，每100 千克煉蜜量25 kg、悶透時間4 h、炮制溫度95 ℃時桑皮苷A 含量最高，以上述數據為中心點，采用Box-Behnken 試驗設計原理，設計3 因素3 水平的試驗方案，具體結果見表2。采用Design Expert 13 軟件對試驗結果進行響應面分析，并進行模型擬合，得到線性回歸方程：Y＝1.780＋0.009 7X1－0.009 3X2－0.006 4X3－0.014 5X1X2＋0.028 0X1X3＋0.005 7X2X3－0.427 4X12－0.797 4X22－0.273 2X32，R2＝0.994 9，失擬項P＝0.193 4＞0.05，表明線性回歸模型對數據的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預測和分析，3D 響應面圖見圖1。

圖1 桑白皮炮制的3D 響應面圖Fig.1 3D response surface plots of Morus Cortex processing

表2 桑白皮炮制試驗設計和結果Table 2 Experimental design and results of Mori Cortex processing

最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對所建模型進行參數最優分析，得出最優炮制工藝：每100 千克煉蜜量25.054 kg、悶透時間3.994 h、炮制溫度94.886 ℃，結合實際情況，最終確定桑白皮飲片的炮制方法為取桑白皮，加入25 kg 的蜂蜜以適量沸水稀釋拌勻，悶制4 h，置炒制容器內，95 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份蜜桑白皮飲片，測定桑皮苷A 含量，所得綜合評分平均值為96.13，RSD 為2.58%，符合預測值波動范圍，表明模型預測性良好，穩定可靠。

2.2.2 赤茯苓炮制研究 根據《中國藥典》2020 年版炮制通則，確定赤茯苓的炮制方法為取赤茯苓，加黃酒拌勻，悶透后炒至規定程度，以茯苓新酸A的含量為響應值（Y），考察黃酒量（X1）、悶透時間（X2）、炮制溫度（X3）的影響，單因素實驗結果表明，每100 千克黃酒量16 kg、悶透時間4 h、炮制溫度105 ℃時茯苓新酸A 含量最高，以上述數據為中心點，采用Box-Behnken 試驗設計原理，設計3 因素3 水平的試驗方案，具體結果見表3。采用Design Expert 13軟件對試驗結果進行響應面分析和模型擬合，得到線性回歸方程Y＝0.819 5－0.003 2X1－0.005 3X2＋0.005 8X3＋0.009 3X1X2－0.002 6X1X3－0.002 4X2X3－0.180 8X12－0.281 1X22－0.187 3X32，R2＝0.993 6，失擬項P＝0.952 7＞0.05，表明線性回歸模型對數據的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預測和分析，3D 響應面圖見圖2。

圖2 赤茯苓炮制的3D 響應面圖Fig.2 3D response surface plots of Rubra Poria processing

表3 赤茯苓炮制試驗設計和結果Table 3 Experimental design and results of Rubra Poria processing

最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對所建模型進行參數最優分析，得出最優炮制工藝：每100 千克黃酒量16.469 kg、悶透時間3.990 h、炮制溫度105.153 ℃，結合實際情況，最終確定赤茯苓飲片的炮制方法為取赤茯苓，加16.469 kg 黃酒拌勻，悶制4 h，置炒制容器內，105 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份酒炙茯苓飲片，測定茯苓新酸A 含量，所得綜合評分平均值為95.47，RSD 為2.08%，符合預測值波動范圍，表明模型預測性良好，穩定可靠。

2.2.3 甘草炮制研究 根據《中國藥典》2020 年版，確定甘草的炮制方法為煉蜜加水稀釋后拌入甘草中，悶透后炒至規定程度，以甘草苷和甘草酸銨含量之和為響應值（Y），考察煉蜜量（X1）、悶透時間（X2）、炮制溫度（X3）的影響[13-14]，單因素實驗結果表明，每100 千克煉蜜量25 kg、悶透時間3 h、炮制溫度105 ℃時甘草苷和甘草酸銨含量最高，以上述數據為中心點，采用Box-Behnken 試驗設計原理，設計3 因素3 水平的試驗方案，具體結果見表4。采用Design Expert 13 軟件對試驗結果進行響應面分析和模型擬合，得到線性回歸方程Y＝3.660－0.015 6X1－0.035 4X2－0.006 2X3－0.024 3X1X2＋0.043 6X1X3＋0.011 0X2X3－0.539 8X12－0.891 2X22－0.501 7X32，R2＝0.991 5，失擬項P＝0.295 7＞0.05，結果表明，線性回歸模型對數據的擬合良好，該模型可信度高，能夠可靠預測和分析，3D 響應面圖見圖3。最佳炮制工藝的確定基于Design Expert 13 軟件對所建模型進行參數最優分析，得出最優炮制工藝：每100 kg 煉蜜量24.930 kg、悶透時間為2.980 h、炮制溫度為104.936 ℃，結合實際情況，取甘草，加入25 kg 的蜂蜜以適量沸水稀釋拌勻，悶制3 h，置炒制容器內，105 ℃炒干，取出，放涼。按最佳工藝條件平行制備3 份炙甘草飲片，測定甘草苷和甘草酸銨含量，所得綜合評分平均值為96.18，RSD 為1.97%，符合預測值波動范圍，表明模型預測性良好，穩定可靠。

圖3 甘草炮制的3D 響應面圖Fig.3 3D response surface plots of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma processing

表4 甘草炮制試驗設計和結果Table 4 Experimental design and results of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma processing

2.2.4 甜葶藶炮制研究 按《中國藥典》2020 年版0213 炮制通則項，取甜葶藶，照清炒法炒至有爆聲。

2.2.5 車前子炮制研究 按《中國藥典》2020 年版0213 炮制通則項，取車前子，照鹽水炙法炒至起爆裂聲時，噴灑鹽水，炒干。

2.2.6 基準樣品的制備 根據國家中醫藥管理局于2023 年5 月發布的古代經典名方關鍵信息表[3]，并查閱相關文獻典籍[15-16]確定清代1 錢約折合成現今3.73 g，1 錢等于10 分。根據文獻并結合前期實驗確定清寧散基準樣品的制備方法為稱取上述蜜桑白皮、炒甜葶藶、酒炒赤茯苓、炒車前子各0.42 g，炙甘草0.21 g，以上藥材粗粉混合，粉碎后過120 目篩，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

精密稱取異鼠李素、甘草苷、芥子堿硫氰酸鹽、甘草酸銨、槲皮素、綠原酸、京尼平苷酸、桑皮苷A、毛蕊花糖苷、芹菜素、β-胡蘿卜苷、松苓新酸、去氫土莫酸、甘草查耳酮A、桑黃酮G、桑辛素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、茯苓新酸A、甘草酸適量置于50 mL 量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為128.14、200.32、80.31、20.17、80.12、19.30、100.14、9.87、100.27、50.41、50.35、200.29、15.38、10.26、60.32、100.38、90.37、30.12、25.09 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

取按“2.2.6”項下方法制備得到的清寧散基準樣品0.45 g，置于25 mL 量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，超聲30 min，濾過，取續濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得清寧散基準樣品的供試品溶液。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取同一份清寧散基準樣品，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件連續進樣6 次進行分析，記錄色譜圖。以10 號色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果表明，各共有峰相對峰面積的RSD 值均小于2.87%；相對保留時間的RSD 值均小于0.93%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 取同一份清寧散基準樣品，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別在制樣后0、2、4、8、12、24 h 后，按照“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。以10 號色譜峰為參照峰（S），計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果表明，各共有峰相對峰面積的RSD 值均小于2.93%；相對保留時間的RSD 值均小于0.27%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.5.3 重復性試驗 取同一清寧散基準樣品，按照“2.4”項下方法制備供試品溶液，平行制備6 份，按“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖。以10 號峰為參照峰（S），計算各共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結果表明，各共有峰相對峰面積的RSD 值均小于2.87%；相對保留時間的RSD 值均小于0.89%，表明該方法重復性良好。

2.6 基準樣品指紋圖譜的建立及相似度評價

利用隨機數表法，將蜜桑白皮、炒葶藶子、酒炒赤茯苓、炒車前子、炙甘草5 種飲片的不同批次隨機組合，按照“2.4”項下方法制備15 批清寧散基準樣品（S1～S15），并按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012A），以S1 為參照圖譜，采用中位數法，進行多點校正和Mark 峰匹配，得到15 批樣品疊加圖，共確認39 個共有峰。結果見圖4。與對照指紋圖譜（R）相比，計算得15 批清寧散基準樣品（S1～S15）的相似度分別為1.000、0.998、0.987、0.993、0.996、0.991、0.978、0.957、0.999、0.993、0.967、0.984、0.995、0.988、0.991，均＞0.93，表明基準樣品特征圖譜相似度良好，主要物質群差異性小，形成的基準樣品對照圖譜能夠作為衡量清寧散基準樣品的標準參照物。

圖4 15 批清寧散基準樣品 (S1～S15) 的HPLC 指紋圖譜和對照指紋圖譜 (R)Fig.4 HPLC fingerprint of 15 batches of Qingning Powder substance reference (S1—S15) and reference fingerprint (R)

2.7 共有峰歸屬

按“2.4”項下的供試品溶液制備方法分別制備單味藥材飲片供試品溶液、缺單味藥材飲片陰性樣品溶液和清寧散基準樣品供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。分別將清寧散基準樣品、單味藥材飲片、缺單味藥材飲片供試品溶液進行疊加比較，具體歸屬情況見表5。

表5 清寧散基準樣品共有峰歸屬情況Table 5 Attribution of common peaks of Qingning Powder substance reference

為進一步明確活性成分，按照“2.4”項下的供試品溶液制備方法和“2.1”項下的色譜條件，使用Dionex UltiMate 3000 超高效液相色譜-Orbitrap 質譜儀檢測，測試條件為電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），噴霧電壓3 500 V，鞘氣體積流量40 arb，輔助氣體積流量10 arb，輔助氣溫度300 ℃，毛細管溫度300 ℃，掃描模式為全掃描模式，掃描范圍m/z為100～1 300，得到總離子流圖，見圖5。經質譜與對照品比對，指認18 個色譜峰，分別為1號峰異鼠李素、2 號峰甘草苷、3 號峰芥子堿硫氰酸鹽、4 號峰β-胡蘿卜苷、10 號峰松苓新酸、15 號峰去氫土莫酸、16 號峰甘草酸銨、19 號峰槲皮素、20號峰綠原酸、21 號峰甘草查耳酮A、22 號峰桑黃酮G、24 號峰京尼平苷酸、26 號峰桑皮苷A、29 號峰桑辛素、31 號峰槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、34 號峰毛蕊花糖苷、35 號峰芹菜素、38號峰茯苓新酸A。

圖5 清寧散基準樣品質譜總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of Qingning Powder substance reference

綜上可知，各味藥材飲片特征圖譜中主要物質群可以從飲片-基準樣品較為完整地傳遞，且物質群的歸屬關系清晰，說明清寧散基準樣品的物質群可清晰地追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認率較高。

2.8 化學計量學分析

2.8.1 系統聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將15 批清寧散基準樣品39 個共有峰的相對峰面積數據輸入SPSS 27.0 數據分析軟件，進行HCA，采用組間連接法，以平方歐式距離為評分依據，聚類結果見圖6。結果發現，當平方歐式距離為15 時，15 批清寧散基準樣品被聚為3 類，S1～S3、S5、S6、S8～S14 為第1 類，S4、S15 為第2類，S7 為第3 類，表明15 批基準樣品不完全相同，不同產地藥材質量及成分含量存在一定差異。

圖6 15 批清寧散基準樣品聚類樹狀圖Fig.6 Cluster dendrogram of 15 batches of Qingning Powder substance reference

2.8.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將15 批清寧散基準樣品的18 個特征峰的相對峰面積數據輸入SPSS 27.0 并進行標準化處理，主成分特征值和累積方差貢獻率作為依據進行PCA，結果見表6，其中5 個主成分的特征值＞1，累積方差貢獻率為85.882%，可以較為全面地表征樣品共有峰的信息。旋轉后的共有峰因子載荷矩陣見表7，第1 主成分的主要影響因素來自于峰1～4、16；第2 主成分的主要影響因素來自于峰26、31、34、35；第3 主成分的主要影響因素來自于峰19、22、29；第4 主成分的主要影響因素來自于峰10、26；第5 主成分的主要影響因素來自于峰15。以SIMCA 14.1 進行分析得主成分得分圖，見圖7，15批清寧散基準樣品大致被分為3 類，與聚類分析結果一致。

圖7 15 批清寧散基準樣品PCA 得分圖Fig.7 PCA score plot of 15 batches of Qingning Powder substance reference

表6 PCA 特征值及方差貢獻率Table 6 PCA eigenvalue and variance contribution rate

表7 主成分因子載荷矩陣Table 7 Principal component factor load matrix

2.9 基于網絡藥理學的清寧散功效關聯物質預測分析

2.9.1 基于可測性和可塑性的活性成分篩選 根據相關文獻調研，桑白皮為清寧散君藥，其主要活性成分為黃酮類和香豆素類，包括桑皮苷A、桑辛素、環桑色醇、桑根酮、傘形花內酯、東莨菪素、東莨菪內酯等，具有抗炎鎮痛、抗病毒、降血糖、抗腫瘤、免疫調節等多重藥理作用[17-19]；甜葶藶為臣藥，主要成分為黃酮類和異硫氰酸類，具有改善心血管功能、抗腫瘤、止咳、祛痰、平喘等作用[20-21]；赤茯苓和車前子為佐藥，茯苓的主要化學成分是茯苓多糖，具有抗衰老、提高免疫力、消水利腫等作用[22]，京尼平苷酸、毛蕊花糖苷為車前子的質量控制指標，發揮清熱、利尿通淋、滲濕止瀉、明目、祛痰等功效[23]；甘草為使藥，主要活性成分為三萜類和黃酮類，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等藥理作用[24-25]。

《中國藥典》2020 年版對于組方藥的控制主要為葶藶子的槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷，車前子的京尼平苷酸、毛蕊花糖苷，甘草的甘草苷、甘草酸銨。基于文獻研究結合指紋圖譜及特征圖譜的可測性和可追溯性，確認指紋圖譜中指認出的桑皮苷A、桑辛素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-β-D-龍膽雙糖苷、茯苓新酸A、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷、甘草苷、甘草酸銨8 個活性成分為候選化合物，通過Pubchem Compound 化合物數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8 個候選化合物的Canonical SMILES 編號，為后續清寧散“成分-靶點-通路”網絡的構建做準備。

2.9.2 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction networks，PPI）網絡構建 將8 個候選化合物的的Canonical SMILES 編號分別導入 Swiss Target Prediction 數據庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）進行靶點預測，去除重復靶點，獲得與8 個化合物相關的共計386 個靶點，導入STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，蛋白交互參數評分值為“high confidence＞0.9”，獲得PPI 網絡圖，見圖8。

圖8 靶點PPI 網絡圖Fig.8 Target PPI network

將分析結果網絡圖以TVS 格式導入Cytoscape 3.10.0 軟件，利用軟件中的“Network Analyzer”功能對PPI 網絡圖進行拓撲屬性分析，選取度值（degree）、介數中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3 個重要拓撲參數均大于中位數且度值≥15 的靶點作為核心靶點，經篩選得到共計61 個核心靶點。

2.9.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將通過PPI 網絡篩選得到的61 個核心靶點利用David 6.8 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）對其進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。選擇物種為“Homo sapiens”，GO 功能分析取“P≤0.005”和KEGG 通絡分析取“P≤0.01”，具有統計學意義。

GO 富集分析共獲取92 個GO 條目，其中生物過程（biological process，BP）占63 條；細胞組成（cell composition，CC）占13 條；分子功能（molecular function，MF）占16 條，根據顯著性程度進行部分展示，結果見圖9。BP 顯著富集在細胞對多巴胺的反應、骨化調節、胰島素受體信號調節、DNA 損傷反應信號傳導等過程；CC 顯著富集在膜筏、突觸、細胞外、細胞質膜側、內質網等區域；MF 顯著富集在蛋白質結構域特異性結合、MAP 激酶活性、RNA聚合酶II 核心啟動子近端區域序列特異性DNA 結合、血紅素結合、類固醇激素受體活性等功能。KEGG 富集分析中前20 條與清寧散關聯程度較高的通路如圖10 所示，主要涉及癌癥信號通路、T 細胞受體信號通路、C 型凝集素受體信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、TNF 信號通路、甲狀腺激素信號通路、雌激素信號通路等，表明61 個核心靶點可能是主要通過調節這些通路來起到治療或干預疾病的作用。

圖9 清寧散核心靶點GO 功能富集分析Fig.9 GO function enrichment analysis of Qingning Powder key targets

圖10 KEGG 富集分析結果Fig.10 Results of KEGG enrichment pathway analysis

2.9.4 “成分-靶點-通路”網絡構建及分析及整合分析 將篩選得到的清寧散中8 個活性成分、61 個核心靶點以及20 條信號通路，運用Cytoscape 3.10.0軟件，構建“成分-靶點-通路”網絡關系圖，結果見圖11。結果表明，清寧散中的多個有效成分通過調控不同通路的多個靶點，以發揮疾病治療作用。其中，8 個活性成分中茯苓新酸A、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-18-O-β-D-龍膽雙糖苷、京尼平苷酸、桑辛素的 連接度相對較高；在61 個核心靶點中有絲分裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK3、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、核因子-κB1（nuclear factor kappa B subunit 1，NF-κB1）、腫瘤蛋白p53（tumour suppressor p53，TP53）、原癌基因-JUN（proto-oncogene c-Jun proto-oncogene，JUN）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的連接程度高于其他靶點，在20 條核心通路中，癌癥信號通路、癌癥蛋白多糖信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinaseprotein kinase B，PI3K-Akt）信號通路與、白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路的連接程度相對較高。

圖11 “成分-靶點-通路”網絡圖Fig.11 “Compound-target-pathway” network diagram

清寧散可消除肺瘀血，減輕肺部滲出，改善心肺功能，為肅肺利水止咳喘之劑，現代臨床上常用來治療小兒心肺蘊熱所致發驚、咳嗽等病證[26]。小兒咳嗽的發生涉及多個因素，包括氣道高反應性、氣道上皮受損、炎性反應和咳嗽高敏感性等。其中，炎癥反應在這一過程中起到了關鍵作用[27]。

通過對核心靶點進行整合分析發現，NF-κB 是可以調節廣泛基因表達的核蛋白因子，為控制炎癥反應的核心因子[28]，促進炎癥因子增加，從而加重炎癥反應[29]，在參與炎癥反應，細胞增殖、分化與凋亡，免疫反應和腫瘤形成等相關的基因轉錄調控中有重要作用[30]；MMP9 在肺損傷和疾病發展過程中，可以降解由Ⅳ型膠原等組成的毛細血管和肺泡上皮的基膜[31]，參與炎癥和組織修復的調節[32]；TNF-α 主要由單核巨噬細胞產生的一種肽類炎性介質[33]，能夠使得呼吸道血管內皮細胞表面黏附分子異常表達，增強血管的通透性，引起氣道產生炎性改變和黏膜水腫，導致氣道反應性增加，加劇氣道炎癥反應[34]；MAPK 是細胞外信號從細胞表面傳導到細胞核內部的重要傳遞者[35]，激活后可促進多種因子的表達和釋放，導致炎癥反應失衡[36]。

KECG 通路富集分析結果表明，清寧散8 個活性成分主要涉及癌癥、炎癥因子介導的調節信號通路、離子信號通路等。PI3K-Akt 信號通路是細胞內重要的信號傳導通路，可通過一系列蛋白因子的表達來參與蛋白質的合成、細胞凋亡分化，在炎癥性疾病、惡性腫瘤中均發揮重要作用[37]，研究發現，通過激活PI3K-Akt 信號通路，活化下游NF-κB，使得激活的NF-κB 轉位進核而產生免疫應答[38]，并誘導γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、TNF-α 等多種炎性因子分泌，并介導中性粒細胞募集及趨化因子生成[39]，加速氣道損害進程，加劇肺組織損傷。

IL-17 是由輔助性T 細胞（T helper cell 17，Th17）分泌的主要效應因子，具有強大的募集和中性粒細胞激活作用[40]，可以誘導活化的T 細胞和成纖維細胞、巨噬細胞及上皮細胞產生多種促炎遞質如IL-1、IL-6、TNF-α、MMP 和化學激活素從而引起炎癥，IL-17 受體通過信號轉導復合體Act1-TRAF6 激活下游NF-κB、MAPK 等信號通路[41]，調節促炎介質和細胞因子的產生。環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號通路的活化可以抑制NF-κB 活性，減少巨噬細胞產生TNF-α、免疫細胞釋放白細胞介素，從而阻斷炎癥介質和免疫相關基因的轉錄和表達，減輕肺部炎癥。

由此可見，清寧散中關鍵效應成分通過作用于多個靶點，干預多條通路協同發揮治療/干預疾病的作用。基于指紋圖譜和網絡藥理學研究，清寧散中的桑皮苷A、桑辛素、京尼平苷酸、毛蕊花糖苷等8 個活性成分具有傳遞性和可溯性，且與清寧散的功能屬性密切相關，可預測其為影響清寧散品質的潛在功效關聯物質。

3 討論

清寧散由桑白皮、赤茯苓、車前子、甜葶藶和甘草5 味藥材組成，在基準樣品制備時采用響應面優化法以確定最佳制備工藝，為了能夠盡可能全面的分析其化學成分，對供試品溶液的制備以及色譜條件進行優化考察。結合方中藥材在《中國藥典》2020 年版中供試品溶液的制備方法對提取溶劑（超純水、80%甲醇水溶液、甲醇）和提取方法（超聲時間15、30、45、60 min）進行優化比較，結果表明，以80%甲醇超聲30 min，所得色譜圖所包含的信息量最全面、成分含量最高且基線平穩，因此，選擇80%甲醇超聲30 min 提取。通過考察不用的檢測波長（254、275、280 nm）、體積流量（0.6、0.7、0.8、1.0 mL/min）、洗脫體系（甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液，乙腈-0.1%冰醋酸水溶液）對色譜峰的影響，確立了清寧散指紋圖譜的分析方法為流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫；檢測波長：0～15 min，254 nm；15～43 min，280 nm；43～120 min，254 nm；柱溫30 ℃；體積流量0.8 mL/min。

經典名方組方藥味眾多、成分復雜，本研究以指紋圖譜作為指標，全面考察清寧散原料飲片-基準樣品的關鍵質量屬性的傳遞性。結果顯示，清寧散基準樣品共確認39 個峰，通過液質聯用共指認18個峰，且歸屬關系清晰。從色譜峰個數和峰強度看，甘草對指紋圖譜的貢獻最大，桑白皮、車前子、甜葶藶對指紋圖譜的貢獻度相對較大，赤茯苓對指紋圖譜的貢獻較低。

中藥質量是中藥產業發展的重要保障，網絡藥理學是一種基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡的方法，它能夠系統地觀察藥物對疾病網絡的影響和作用。在中藥領域，網絡藥理學能夠為中藥的全程質量控制和質量溯源提供指標和方法。本研究基于中藥化學和中藥藥理學，整合多學科技術方法，將指紋圖譜與網絡藥理學相結合，通過對經典名方清寧散進行指紋圖譜研究，并構建清寧散“成分-靶點-通路”網絡，不僅對清寧散質量控制指標成分的合理性進行了驗證，而且揭示了清寧散物質基礎的相關性，為后續研究清寧散及其相關復方的作用機制提供思路，也為清寧散的質量控制提供了更全面的參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突