基于UPLC-Q-TOF/MS 鑒定健脾益腸散大鼠體內外源物成分

孔心雨，李 璐，商 晶，劉文君，錢夢雨，王振中，肖 偉,3*

1.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210000

2.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港 222001

3.中藥過程控制與智能制造技術全國重點實驗室, 江蘇 連云港 222001

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸道疾病，臨床表現為腹痛、排便頻率增加、血性腹瀉或有黏液分泌物、體質量下降、疲勞，嚴重者會出現發燒和嘔吐，極大影響患者的生活質量[1]。健脾益腸散（Jianpi Yichang Powder，JPYCS）是出自貴州省名老中醫董菲洛教授的臨床經驗方，對UC 有確切的治療效果[2]。方中黃芪為君藥，具有補氣升陽、托毒生肌的功效；太子參補氣生津、補脾益肺，白術健脾益氣、燥濕利水，白豆蔻溫中行氣、化濕消疲，敗醬草清熱解毒、消癰排膿，木香健脾消食、行氣止痛，共為臣藥；芡實益腎補脾，補骨脂補腎止瀉，茯苓健脾滲濕，共為佐藥；炙甘草益氣和中，調和諸藥為使。諸藥合用，重在健脾胃之氣，滲補澀濁，清熱解毒[3]。目前對JPYCS 的研究主要集中在藥效學方面，已有研究證實該方能夠調節結腸組織中Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、核因子-κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65）、共刺激分子CD40、CD86、CD80、和細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、淋巴細胞功能相關分子1（lymphocyte function-associated antigen-1，LFA-1）、熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）的表達水平[4-7]，發揮免疫炎癥抑制作用，促進腸黏膜修復。其發揮藥效的機制可能還與調控核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、TLR4/髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/NF-κB 信號通路相關，具體的分子機制仍需繼續研究[8]。本實驗室前期基于葡聚糖硫酸鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導建立UC 小鼠模型[9-10]，再次驗證了JPYCS 對UC 的治療作用。

藥物有效性是指“物質清晰、機制明確、量效精準”，解析復方物質基礎功效機制是體現中成藥原創優勢的核心之一，是建立功效成分群保證中藥有效、安全、質量可控的關鍵一步[11]。實驗前期采用UPLC-QTOF/MS 技術對JPYCS 全方的化學成分進行表征，總結了不同結構類型化學成分的裂解規律，以便后續的物質基礎研究。大多數中藥口服給藥后，在體內經過吸收、分布、代謝、排泄過程，進入血液的原型成分、代謝成分或發生變化的內源性成分是中藥復方發揮藥效的直接物質[12]。本實驗基于UPLC-Q-TOF/MS 技術，通過對比空白組和給藥組血漿、尿液、糞便樣品質譜數據的差異，對JPYCS 給藥后在大鼠血漿、尿液、糞便中的原型成分和代謝產物進行鑒定，為進一步研究其作用機制提供了物質基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HSC-24A 氮吹儀（武漢愛佩斯科學儀器有限公司）；Agilent 1290 型超高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Agilent 6538 Q-TOF 質譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Milli-Q 型純水儀（上海密理博有限公司）；Mettle Toledo XS205DU 型電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司），Centrifugue 5424R 型高速離心機（德國艾本德股份公司）；KH2200B 型超聲清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；Vortex-5 型渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與材料

黃芪（批號Y221012）、太子參（批號Y221014）、白術（批號Y220305）、木香（批號Y221016）、白豆蔻（批號Y221013）、茯苓（批號Y220701）、芡實（批號Y220306）、敗醬草（批號Y221015）、補骨脂（批號Y221011）、炙甘草（批號Y220303），均購自亳州市萬珍中藥飲片廠。由康濟大藥房中藥執業藥師吳舟鑒定，黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根，太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，白術為菊科植物AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，木香為菊科植物木香AucklandialappaDecne.的干燥根，白豆蔻為姜科植物白豆蔻AmomumkravanhPierre ex Gagnep.的干燥成熟果實，茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核，芡實為睡蓮科植物芡EuryaleferoxSalisb.的干燥成熟種仁，敗醬草為敗醬科植物黃花敗醬Patrinia scabiosaefoliaFisch.的干燥全草的加工炮制品，補骨脂為為豆科植物補骨脂PsoraleacorylifoliaL.的干燥成熟果實，炙甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根莖的炮制加工，均符合《中國藥典》2020 年版各項要求。

芹菜素（批號7366）、芒柄花苷（批號3811）、黃芪皂苷IV（批號2779）、甘草苷（批號7306）、芹糖甘草苷（批號6969），購自上海詩丹德生物技術有限公司；補骨脂素（批號110739-201918）、異補骨脂素（批號 110738-202016）、木香烴內酯（批號111524-201711 ）、去氫木香烴內酯（ 批號111525-201711），購自中國食品藥品檢定研究院；補骨脂苷（批號Y3J11S20168）、異補骨脂苷（批號Y3J11S20168）、甘草酸（批號P18A11F111597），購自上海源葉生物科技有限公司；夏佛塔苷（批號20191228）、甘草素（批號200708）、芒柄花素（批號200713），購自南京森貝伽生物科技有限公司。以上對照品質量分數均大于 98%。肝素鈉（批號B805BA0008，BBI Life Science）；甲酸（質譜級，美國西格瑪奧德里奇公司）；甲醇（質譜級，美國賽默飛世爾科技公司）。

1.3 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，雄性，體質量（200±20）g，購自杭州醫學院實驗動物中心，合格證編號：20230427Aazz0100000734，許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養環境：室溫（22±2）℃，相對濕度50%～60%，自然光暗周期，自由飲水進食。大鼠分籠飼養，2 只/籠，實驗前適應性飼養1 周。動物實驗倫理批準號：2023042905。

2 方法

2.1 JPYCS 供試品溶液及對照品溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 稱取黃芪15 g、太子參15 g、白術12 g、白豆蔻6 g、木香6 g、敗醬草30 g、補骨脂20 g、芡實12 g、茯苓12 g、炙甘草6 g，混合藥材，浸泡1 h 后加入10 倍量水，加熱回流提取1.5 h，濾渣加入8 倍量水繼續提取1.5 h，合并藥液，減壓濃縮干燥得到干膏，得膏率為20.4%。取0.5 g干膏，加入25 mL 50%甲醇，超聲提取30 min，冷卻至室溫，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，得到待測樣品。

2.1.2 對照品溶液的制備 稱取對照品芹菜素、芒柄花苷、黃芪皂苷IV、甘草苷、芹糖甘草苷、補骨脂素、異補骨脂素、木香烴內酯、去氫木香烴內酯、補骨脂苷、異補骨脂苷、甘草酸、夏佛塔苷、甘草素、芒柄花素少量，加入50%甲醇溶解，配制成各成分質量濃度為10 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 動物實驗及生物樣品采集

將14 只大鼠隨機分為2 組，空白組（n＝4）和給藥組（n＝10）。以0.5%羧甲基纖維素鈉作為給藥溶劑，給藥組大鼠按照70.245 g/(kg·d)（以JPYCS生藥量計算）劑量連續ig 給藥3 d，空白組同時給予等體積0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。

大鼠最后1 次給藥前禁食12 h，不禁水。收集大鼠給藥后0～12 h 內的糞便和尿液。給藥后0.25、0.5、1、2、4、6 h，麻醉大鼠，股動脈取血，置于預先涂有1%肝素鈉的EP 管中，3 500 r/min 離心10 min 取上清液。以上樣品均置于?80 ℃凍存備用。

2.3 生物樣品供試液的處理

2.3.1 血漿樣品制備 給藥組各時間點采集的血漿樣品混合均勻。分別取空白組和給藥組的血漿樣品各2 mL 置于EP 管中，加入6 mL 的甲醇溶液，渦旋混合，12 000 r/min 離心10 min 取上清液，37 ℃氮吹至干，殘留物加200 μL 50%甲醇復溶，12 000 r/min 離心10 min，取上清，得到血漿樣品的供試樣品。

2.3.2 尿液樣品制備 與上述血漿樣品供試樣品的制備方法相同。

2.3.3 糞便樣品制備 將各組糞便樣品混合均勻。分別取空白組和給藥組的糞便樣品0.5 g 置于EP 管中，加入3 倍量50%甲醇溶解，超聲30 min，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，37 ℃氮吹至干，殘留物加200 μL 50%甲醇復溶，12 000 r/min 離心10 min，取上清，得到糞便樣品的供試樣。

2.4 色譜與質譜條件

2.4.1 色譜條件 色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），洗脫梯度（0～10 min，5%～25% A；10～20 min，25% A；20～24 min，25%～35% A；24～36 min，35%～65% A；36～48 min，65%～100% A。體積流量0.4 mL/min，進樣量2 μL，柱溫30 ℃。

2.4.2 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式檢測。離子掃描范圍設置為m/z50～1 500；霧化氣壓力270 kPa；錐孔電壓65 V；OctopoleRFPeak 750 V；毛細管電壓正離子模式4 000 V、負離子模式3 500 V，裂解電壓135 V；干燥氣體積流量10.0 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碰撞能量10、20、40 V；圖譜采集頻率：1.5 spectra/s。

2.5 數據處理

UPLC-Q-TOF/MS 采集的數據由 Agilent MassHunter 軟件（Qualification Analysis10.0）處理分析。通過提取各生物樣品中目標化合物的EIC 離子流圖，質量偏差設置為±2×10?5，對比化合物與對照品保留時間、二級特征碎片離子，并根據測得的精確相對分子質量參考文獻中二級特征碎片離子，推測各成分代謝產物結構及分子式。

3 結果

3.1 原型成分的鑒定

比對給藥樣品與空白樣品色譜峰的保留時間與峰面積，結合二級質譜數據，對JPYCS 在體內的原型成分進行了檢識，其各樣品的EIC 離子峰疊加圖如圖1 所示。在給藥組生物樣品中共檢測到原型成分34個，包括黃酮類成分17 個、香豆素類成分6 個、萜類成分4 個、皂苷類4 個、有機酸類成分2 個、其他成分1 個。其中從血漿中檢測到31 個、尿液中檢測到30 個、糞便中檢測到14 個。具體信息見表1。

表1 大鼠生物樣品中JPYCS 原型成分的UPLC-Q/TOF-MS 數據Table 1 UPLC-Q/TOF-MS data of prototypes of JPYCS in rat biological samples

圖1 大鼠生物樣品中原型化合物提取離子色譜圖 (EICs)Fig.1 Extracted ion chromatograms (EICs) of prototypes in rat biological samples

3.2 代謝產物的鑒定

藥物代謝分為I 相反應和II 相反應，I 相反應指氧化、還原、水解反應，II 相反應指藥物或經I相反應后的藥物代謝產物與內源性結合劑的結合反應。不同結構類型的成分在體內發生的代謝反應不同，通過查閱文獻，對進入體內的原型成分進行代謝產物的預測，提取預測代謝產物的EIC 離子流圖，比對質譜二級碎片進行人工檢識，各樣品的代謝產物EIC 離子峰疊加圖如圖2 所示。在給藥組生物樣品中共確定了79 個代謝產物，其中從血漿中檢測到37 個、尿液中檢測到73 個、糞便中檢測到16 個。具體信息見表2。

表2 大鼠生物樣品中JPYCS 代謝產物的UPLC-Q/TOF-MS 數據Table 2 UPLC-Q/TOF-MS data of metabolites of JPYCS in rat biological samples

圖2 大鼠生物樣品中代謝產物提取離子色譜圖 (EICs)Fig.2 Extracted ion chromatograms (EICs) of metabolites in rat biological samples

3.2.1 黃酮類成分的代謝產物及途徑分析 JPYCS進入大鼠體內的原型成分及代謝成分大多數為黃酮成分，這些黃酮成分按照母核結構的特征分類可分為二氫黃酮類、黃酮類、異黃酮類。在I 相反應中，黃酮類成分易發生氧化、還原反應[13]。黃酮類成分的極性較小，進入機體內后多發生II 相反應，與硫酸、葡糖醛酸、甲基結合以增大極性促進其排出體外[14]。另外，黃酮類成分通常會通過逆狄爾斯-阿德爾（retro diels-alder reacition，RDA）裂解反應，產生系列特征碎片，通過對比原型成分與代謝產物的RDA 裂解碎片可推測其代謝產物，此處以補骨脂二氫黃酮、夏佛塔苷、新補骨脂異黃酮為例，闡述黃酮類化合物的代謝途徑鑒定。

M9～M16 為補骨脂二氫黃酮（P23）的代謝產物。M9、M10 的準分子離子峰 [M＋H]+均為m/z341.138 7，相較 P23 高 16，確定其分子式為C20H20O5。其保留時間分別為34.271、33.305 min，并結合文獻中報道的出峰順序[15]，分別鑒定為補骨脂二氫黃酮的羥 基化和環氧化代謝物。M11 的準分子離子峰 [M＋H]+為m/z501.176 2，相較P23 高176，并存在碎片m/z325.143 3 [M＋H－GlcUA]+、269.081 2 [M＋H－GlcUA－C4H8]+、149.023 4 [M＋H－GlcUA－C4H8－C8H8O]+，與P23 經RDA 裂解產生的特征碎片m/z269.081 4 [M＋H－C4H8]+、149.023 0 [M＋H－C4H8－C8H8O]+一致，鑒定其為補骨脂二氫黃酮與葡糖醛酸結合后的代謝產物。同理，M12 的準分子離子峰 [M＋H]+為m/z421.071 7，相較M9 高80，確定其分子式為C20H20O8S，特征碎片與文獻報道一致[15]，鑒定其為M9 與硫酸結合后的產物。M14、M15 的準分子離子峰 [M＋H]+均為m/z323.128 7，相較M10 低18，提示其為M10碳骨架重排后脫去1 分子H2O 形成的產物。其保留時間分別為39.824、40.465 min，在反相色譜柱中，二氫黃酮類化合物保留時間先于查耳酮類化合物，因此推測二者結構如圖3 所示。

圖3 補骨脂二氫黃酮可能的代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of bavachin

M17、M18 為夏佛塔苷（P10）的代謝產物。M17 的準分子離子峰 [M－H]?為m/z561.126 0，相較P10 低2，存在碎片m/z517.135 9 [M－HC2H4O]?，鑒定其為夏佛塔苷糖環脫氫后的代謝產物。M18的準分子離子峰 [M－H]?為m/z531.150 7，相較P10 低32，存在碎片m/z355.119 0 [M－HC6H8O6]?，鑒定其為夏佛塔苷糖環脫氧后的代謝產物。夏佛塔苷屬于黃酮苷類成分，進入體內后可經糖苷酶水解，脫去葡萄糖基和阿拉伯糖基轉化為芹菜素。據文獻報道[16-17]，芹菜素可在腸道內吸收，經歷I 相反應后，在Ⅱ相酶作用下，發生葡萄糖醛酸化和硫酸化反應。M19～M24 為芹菜素（P18）的代謝產物，與文獻中的代謝規律相符。夏佛塔苷、芹菜素在體內的代謝途徑見圖4。

M35～M43 為新補骨脂異黃酮（P27）的代謝產物。新補骨脂異黃酮與補骨脂二氫黃酮的結構類似，側鏈都為直鏈異戊烯基，因此代謝途徑上有一定的相似性。M35、M36 的準分子離子峰 [M＋H]+為m/z339.125 7，與P28 相比，相差16，確定分子式為C20H18O5。二者均有特征碎片m/z137.020 7 [M＋HC13H14O2]+，因此推測羥基連接在異戊烯基上，查閱文獻報道[15,18-19]可知，直鏈異戊烯基可在體內肝微粒體酶的作用下發生環氧化反應，也可在體內代謝成2-羥基-3-甲基-3-丁烯基片段，因此推測M35、M36 的結構如圖5 所示。新補骨脂異黃酮的主要代謝途徑與補骨脂二氫黃酮類似，主要的代謝包括氧化、還原、環合、脫氧、硫酸結合、葡糖醛酸結合。

3.2.2 香豆素類成分的代謝產物及途徑分析 大鼠血漿、尿液、糞便中檢測到的香豆素類成分均源于補骨脂，補骨脂素、異補骨脂素及其苷為補骨脂藥材的主要功效成分，補骨脂苷和異補骨脂苷在體內可經腸道菌群的作用脫葡萄糖基化轉化成相應的苷元補骨脂素和異補骨脂素[20]，進而發生氧化、還原、葡萄糖醛酸化等一系列反應。M51～M60 為補骨脂素（P14）的代謝產物。M51 的準分子離子峰[M＋H]+為m/z203.034 0，相較P14 高16，確定分子式為C11H6O4，存在碎片m/z175.038 2 [M＋HCO]+, 147.043 6 [M＋H－2CO]+，與P14 的裂解規律一致，鑒定其為補骨脂素羥基化代謝物。M56 的準分子離子峰 [M＋H]+為m/z221.044 0，相較M51 高18，存在碎片m/z203.033 4 [M＋H－H2O]+、175.039 6[M＋H－H2O－CO]+，鑒定M56 是M51 水合反應后的代謝產物。M56 進一步在體內發生還原反應則產生代謝產物M57，發生羥基化反應則產生代謝產物M58。根據上述代謝規律，推測補骨脂素在體內的代謝途徑如圖6 所示。

圖6 補骨脂素可能的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathways of psoralen

3.2.3 萜類成分的代謝產物及途徑分析 大鼠血漿、尿液、糞便中檢測到的萜類成分主要源于木香，去氫木香內酯和木香烴內酯都是倍半萜類成分，但是其在體內發生的代謝反應并不相同，M64-M74 為去氫木香內酯（P24）的代謝產物，M75-M79 為木香烴內酯（P25）的代謝產物。根據文獻報道[21]，去氫木香內酯在大鼠體內主要發生I 相反應，包括羥基化、水合、脫氫、脫水。P24 進入大鼠體內后連續2 次羥基化形成M64、M66，連續發生2 次水合反應形成M67、M69，連續發生2 次脫氫形成M70、M72。M74 的準分子離子峰 [M＋H]+為m/z392.153 4，確定其分子式為 C20H25NO5S，且存在碎片m/z185.132 4 [M＋H－NAC－H2O]+、157.099 8 [M＋H－NAC－H2O－CO]+，與P24 的裂解規律一致，鑒定M74 為去氫木香內酯與乙酰半胱氨酸結合的代謝產物。根據上述代謝規律，推測去氫木香內酯在體內的代謝途徑見圖7。木香烴內酯主要發生II 相反應，包括半胱氨酸結合形成M76、乙酰半胱氨酸結合形成M77、谷胱甘肽結合形成M79，與文獻報道的木香烴內酯在體內可能發生的代謝途徑相同[22]。

圖7 去氫木香內酯可能的代謝途徑Fig.7 Metabolic pathways of dehydrocostuslactone

4 討論

本實驗通過UPLC-Q-TOF/MS 技術對JPYCS給藥后進入體內的原型成分和代謝產物進行檢識，共檢識出34 個原型成分和79 個代謝產物，包括黃酮類、香豆素、萜類和皂苷類成分，在體內的代謝反應主要為氧化、還原、甲基化、葡糖醛酸結合、硫酸結合等。

JPYCS 是通過多成分、多靶點發揮治療UC 的作用。現代藥理研究發現，黃酮類成分可以誘導保護性細胞因子和酶，通過調節芳香烴受體來增強抗炎作用[23]。毛蕊異黃酮、芒柄花素是黃芪中主要的黃酮類成分，可經羥基化、脫羥基反應進行相互轉化[24]。本實驗發現，芒柄花素在體內能夠發生硫酸結合、葡糖醛酸結合等反應，繼而以尿液的形式排出體外。毛蕊異黃酮及其葡萄糖苷也是黃芪中的主要黃酮類成分之一，但其原型成分并未在本實驗生物樣品檢測到，可能與毛蕊異黃酮及其葡萄糖苷在體內代謝迅速有關[25]。

香豆素類成分主要來源于補骨脂，補骨脂在UC 的臨床治療中為高頻用藥，補骨脂素能減少肝臟膽汁酸合成及其在結腸處的聚集，從而改善膽汁酸對結腸的損傷[26]。本實驗發現，補骨脂素主要發生的代謝反應有氧化、還原、水合、硫酸結合、葡糖醛酸結合等，而補骨脂苷只以原型形式被檢測到，推測補骨脂苷在體內脫糖基轉化為補骨脂素，對腸道損傷發揮保護作用。

萜類成分主要來源于木香，有研究表明，大鼠給藥木香后，木香烴內酯和去氫木香內酯會在結腸處積累，改善腸道菌群均勻性和多樣性，木香烴內酯還可通過抑制HIF-1α 介導的糖酵解調節Th17 細胞的分化來緩解UC 的治療[27-28]。本實驗中，在體內不僅檢測到去氫木香內酯和木香烴內酯的原型成分，在血漿、尿液中也檢測到其多種形式的代謝產物。推測木香烴內酯和去氫木香烴內酯可能是JPYCS 發揮UC 藥效的重要成分。

皂苷類成分是黃芪中的主要活性成分。其中，黃芪皂苷IV 能夠預防和改善DSS 誘導UC 發生的氧化應激損傷[29]。本實驗在給藥組血漿、尿液、糞便組中均檢測到了原型成分黃芪皂苷IV，但并未識別到相關代謝產物，黃芪中其他皂苷類原型成分也未被檢識到。有研究表明黃芪皂苷I～III 和黃芪甲苷可在人源腸道菌群中代謝轉化[30]，推測是由于皂苷類化學成分的相對分子質量較大，口服給藥后吸收率較低，導致在實驗生物樣品中含量低，難以被檢測到；也可能與本實驗的生物樣品前處理方法導致該類成分的回收率較低有關，應進一步優化生物樣品的前處理方法；排泄途徑能有效反映藥物作用方式，藥物及其代謝產物主要經腎臟從尿液中排出或經膽汁從糞便排出，膽汁中的代謝產物易富集[31]，因此后續應增加膽汁中代謝成分的鑒定。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS 技術，表征了JPYCS 給藥后在體內的移行成分，后期可基于本實驗提供的物質基礎繼續研究JPYCS 體內發揮藥理活性的作用機制，促進其更廣泛的臨床應用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突