超聲輔助低共熔溶劑提取萊菔子中蘿卜硫素的工藝優化及其銅綠假單胞菌生物膜抑制活性研究

梁佩云，黃鈺景，陳浩銘，曹昊恒，吳銀冰，陳婷婷，陳楚汕，范紅霞，鄭俊霞

廣東工業大學生物醫藥學院，廣東 廣州 510006

萊菔子，別名“蘿卜子”“菜子頭”，為十字花科萊菔屬植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子，歸肺、脾、胃經，具有消食除脹、降氣化痰等眾多功效，其主要活性成分為異硫氰酸酯及硫代葡萄糖苷等，其中蘿卜硫素是萊菔子中含量較大的異硫氰酸酯類化合物，因此，從萊菔子中提取蘿卜硫素應用于藥品和食品領域具有重大意義[1-4]。目前，蘿卜硫素的提取主要以溶劑萃取法、酶解法和現代提取技術為主。

溶劑萃取法常用的提取溶劑為二氯甲烷[5-9]、醋酸乙酯[10-15]、丙酮[16]、熱乙醇溶液[17]等，然而，有機溶劑易揮發、有毒，對環境有害，此外，廢液處理成本高。酶解法是目前人們從植物中獲得天然蘿卜硫素的主要方法[18]，但酶的活性極易受到環境影響和酶的成本較高，且硫苷酶解后存在大量副產物，后續的純化工作復雜。

現代提取技術主要包括超臨界流體萃取[19]、超聲波輔助提取[9]和微波輔助提取[20]等儀器分析技術的應用，有效的縮短了蘿卜硫素提取時間，提高了提取效率，但對儀器分析的準確度要求高，難以實現大范圍推廣。因此，尋找綠色溶劑用于萊菔子中蘿卜硫素的提取倍受重視。

綠色溶劑的開發促進了現代綠色化學的發展，與傳統有機試劑相比，低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs）具有熔點低、綠色、無毒以及可提高中藥化合物提取率等突出優點，是提取中藥活性成分的理想試劑，具有廣闊的開發前景和商業應用前景[21-23]。低共熔溶劑是指由一定化學計量學比的氫鍵受體（hydrogen bond acceptor，HBA）和氫鍵供體（hydrogen bond donors，HBD）組合而成的低共熔混合物，其凝固點顯著低于各個組分純物質的熔點[24-29]。針對DESs 諸多優點，研究人員已將其運用于食品、藥品等領域，作為一種綠色提取介質，用于酚酸類[30]、生物堿類[31]、多糖類[32]等活性成分的提取，但DESs 提取萊菔子中活性成分研究仍然有限，且國內報道不多。

因此，本實驗采用超聲輔助低共熔溶劑提取技術[18,33]，研究不同低共熔溶劑對萊菔子中的蘿卜硫素提取率的影響，并利用響應面對工藝進行優化；同時采用大孔吸附樹脂法回收萊菔子中的蘿卜硫素和DESs 溶劑，評價該方法的可持續利用度，以期為DESs 提取該成分提供可靠的理論基礎，具體流程如圖1 所示。

圖1 DESs 提取萊菔子中蘿卜硫素的流程Fig.1 DESs extraction process of sulforaphane from Raphani Semen

1 儀器與材料

1.1 儀器

Forma 3111 型超純水系統，深圳洪森環保科技有限公司；1260 Infinity II 型高效液相色譜儀，支元儀器有限公司；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺，蘇州安泰公司；YXQ-LS-70A 型高壓滅菌鍋、THZ-300 型恒溫培養搖床，上海一恒醫療器械有限公司；DWHL100 型?80 ℃超低溫冰箱，美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 材料

萊菔子藥材購于廣州市場，經暨南大學生物醫藥研究院王一飛教授鑒定，為十字花科萊菔屬植物蘿卜RaphanussativusL.的干燥成熟種子。D-101 大孔樹脂、AB-8 大孔樹脂、氯化膽堿、乙酸、乙二醇、丙三醇、乳酸、檸檬酸、尿素、乙酰胺等均購于廣州化學試劑廠；蘿卜硫素對照品，批號CKA454，質量分數99.0%，購于德國Sigma 公司；水解酪蛋白胨（MH）肉湯和MH 瓊脂購于青島海博生物技術有限公司；結晶紫、酸水解酪蛋白、二甲基亞砜（DMSO）等均購于廣州市光華科技股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 試劑、緩沖液和培養基的配制

2.1.1 A10 溶液、BT 溶液的配制

（1）A10 溶液：由4.785 g Na2HPO4·12 H2O、2.994 g KH2PO4、2.992 g NaCl、1.995 g (NH4)2SO4用超純水溶解并定容至100 mL，即得。

（2）BT 溶液：由5.549 0 g CaCl2·2H2O（C）、4.760 5 g MgCl2·6H2O（M）、0.135 1 g FeCl3·6H2O（F）先分別加入蒸餾水定容至50 mL，再按500 μL M、50 μL C、500 μL F、450 mL 蒸餾水混合，即得。

2.1.2 PBS緩沖溶液 準確稱取磷酸氫二鈉1.44 g，磷酸二氫鉀0.2 g，氯化鉀0.2 g，氯化鈉8.0 g 后加入去離子水溶解，調節pH 值至7.4，用超純水定容至1 L，高溫高壓滅菌后，冷卻，備用。

2.1.3 最簡（ABTGC）培養基（含有葡萄糖和酸水解酪蛋白）配制 ABTGC 培養基由A10 溶液、BT溶液、20%葡萄糖溶液及20%酸水解酪蛋白溶液混合配制而成。A10 和BT 溶液分別用高壓蒸汽滅菌，冷卻至室溫后，準確取450 mL BT 溶液，加入50 mL A10 溶液，并加入5 mL 20%葡萄糖及5 mL 20%酸水解酪蛋白（20%葡萄糖及20%酸水解酪蛋白用濾過除菌），混合均勻后置于?4 ℃冰箱，備用。

2.2 前處理

萊菔子樣品用去離子水洗凈，并在40 ℃干燥后，用中藥粉碎機粉碎并過篩（60 目），備用。根據文獻報道，用加熱攪拌法制備DESs，HBD 和HBA按一定物質的量比在80 ℃左右下加熱攪拌，直至形成均一、透明的液體。HBD 和HBA 組合形成不同種類的DESs，如表1 所示。常見的DESs 是由不同配體與氯化膽堿按照一定物質的量比形成的，主要由于氯化膽堿價格便宜、來源廣泛、無毒且可生物降解。參考文獻報道的方法處理新購買的大孔吸附樹脂[30]，將其裝入潔凈的樹脂柱內，以95%乙醇洗至流出液加3 倍量水后無白色混濁現象，改用蒸餾水沖洗至無醇味，備用[34]。

表1 不同種類的DESsTable 1 Different kinds of DESs

2.3 對照品溶液的制備及線性關系考察

精密稱取蘿卜硫素對照品5.0 mg，置于5 mL量瓶中，加入色譜級甲醇稀釋至刻度，配制成1.0 mg/mL 的蘿卜硫素對照品溶液，然后用1.0 mg/mL對照品溶液分別配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的系列對照品溶液，進行HPLC 分析。

色譜條件[18,23]：色譜柱為Cosmosil Cholester 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈；體積流量0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長201 nm；進樣量10 μL；洗脫梯度設置為0～10 min，10%～80%乙腈；10～15 min，80%～100%乙腈。色譜圖見圖2。

圖2 不同質量濃度的蘿卜硫素對照品溶液在201 nm 下的HPLC 圖Fig.2 HPLC diagram of sulforaphane standard solution with different concentrations at 201 nm

各質量濃度的標準溶液經色譜分析后，以標準溶液的質量濃度為橫坐標（X），對照品溶液的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到線性回歸方程Y＝1×107X＋5×106，r2＝0.999 5，結果表明蘿卜硫素在0.1～0.6 mg/mL 呈現良好的線性關系。

2.4 萊菔子中蘿卜硫素提取率的計算

精密移取萊菔子提取液0.5 mL，加入色譜級的甲醇溶液0.5 mL，搖勻，在201 nm 下測定溶液中的蘿卜硫素的峰面積。將峰面積代入標準曲線求得相應的蘿卜硫素質量濃度，再利用如下公式計算萊菔子中蘿卜硫素的提取率。

提取率＝CVD/M

C為據標準曲線計算求得的蘿卜硫素質量濃度，V為上清液的體積，D為稀釋倍數，M為樣品質量

2.5 萊菔子中蘿卜硫素的提取

精密稱量萊菔子粉末5.00 g 置于錐形瓶中，按照液料比10∶1 加入DESs 50.0 mL（含水量為30%），混合均勻，靜置2 h 后，放入超聲儀中，在35 ℃、350 W 下超聲提取30 min，冷卻至室溫，溶液轉移至離心管內，8 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），棄沉淀，量取并記錄上清液的體積。同時，選取文獻報道[2-3]的萊菔子常用的提取方法（95%乙醇超聲提取法），在同等條件下，與本研究的低共熔溶劑提取法進行比較。

2.6 DESs 種類的選擇

稱取5.0 g 萊菔子粉末8 份于提取器中，分別按照液料比10∶1 加入95%乙醇和物質的量比2∶1 的DESs（DESs-1、DESs-2、DESs-3、DESs-4、DESs-5、DESs-6、DESs-7），其含水量均為30%（含水量指水與溶劑的體積比），超聲溫度30 ℃、超聲時間30 min、超聲功率350 W 進行DESs 的選擇，實驗重復3 次。結果見圖3 和表2，各種低共熔溶劑的提取率均高于有機試劑95%乙醇對萊菔子中蘿卜硫素的提取率，且7 種低共熔溶劑中DESs-3（乳酸-氯化膽堿）的提取率較其他低共熔溶劑高，故本實驗選取DESs-3（乳酸-氯化膽堿）作為提取溶劑。

表2 提取溶劑對蘿卜硫素提取率的影響Table 2 Effects of extractants on the extraction rate of sulforaphane

圖3 95%乙醇提取液和DESs 提取液在201 nm 下的HPLC 圖Fig.3 HPLC images of 95% ethanol extracting solution and DESs extracting solution at 201 nm

2.7 單因素試驗考察各影響因素對蘿卜硫素提取率的影響

在確定最佳DESs 的種類的基礎上，按照“2.5”項下提取方法，精密稱量萊菔子粉末5.00 g 置于錐形瓶中，按照液料比10∶1 加入DESs（乳酸與氯化膽堿物質的量比2∶1）50.0 mL（含水量為30%），混合均勻，靜置2 h 后，放入超聲儀中，在35 ℃、350 W 下超聲提取30 min，冷卻至室溫，溶液轉移至離心管內，8 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），棄沉淀，量取并記錄上清液的體積。依次考察乳酸與氯化膽堿物質的量比、含水量、液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率對蘿卜硫素提取率的影響。分析上述6 個單因素對萊菔子中蘿卜硫素提取的影響程度，并選擇其中對萊菔子中蘿卜硫素提取率影響程度最大的4 個因素的各自最佳水平進行后續Box-Behnken 設計（Box-Behnken design，BBD）實驗。

2.7.1 乳酸與氯化膽堿物質的量比對蘿卜硫素提取率的影響 不同乳酸與氯化膽堿物質的量比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為7.273 3、9.863 2、15.504 9、15.068 9、8.411 4、4.103 7 mg/g。隨著乳酸比例的增加，提取液中蘿卜硫素含量快速上升，當乳酸與氯化膽堿的比例為3∶1 時，提取率達到最大值，繼續增加乳酸量，蘿卜硫素提取率又下降。其原因可能是，在常溫下DESs 的黏度很大，增加乳酸的量可降低DESs 的黏度和表面張力，從而增加目標組分的擴散和質量轉移能力，使得蘿卜硫素的提取率升高；但隨著乳酸含量的增多，氯化膽堿含量逐漸降低，又會導致目標組分與DESs 的相互作用減弱，從而使得提取率下降。因此，選擇乳酸與氯化膽堿的物質的量比為3∶1，作為物質的量比因素的最佳水平。

2.7.2 含水量對蘿卜硫素提取率的影響 不同含水量10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、60%時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為2.272 8、3.685 0、10.016 0、11.117 5、15.209 1、14.409 2、12.460 4、6.433 2 mg/g。當含水量為40%時，蘿卜硫素提取率最大。含水量是影響DESs 提取效率的重要參數，具有調節DESs 的黏度和極性作用。增大含水量會降低DESs 的黏度，同時也會影響DESs的極性，黏度的降低可增加溶劑與萊菔子的接觸，進而增加萊菔子中蘿卜硫素的提取率；然而含水量過高會使DESs 中的氫鍵被破壞，削弱了DESs 與萊菔子間的相互作用。故選擇40%為含水量因素的最佳水平。

2.7.3 液料比對蘿卜硫素提取率的影響 不同液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為9.140 1、16.459 1、17.165 0、13.475 6、5.258 4、4.253 3、2.236 3 mg/g。隨著液料比的降低，蘿卜硫素提取率呈現先增加后降低的趨勢，其可能是因為DESs 的體積決定了萊菔子粉末是否能充分浸潤、目標化合物能否有效溶出。隨著液料比的降低，萊菔子粉末充分浸潤，蘿卜硫素提取率不斷增加，當液料比達到20∶1 時，蘿卜硫素提取率達到最大值；此時再降低液料比，增加溶液量，會使得超聲破壞萊菔子細胞壁的效果變差，導致部分蘿卜硫素無法溶解到溶液中，從而使得其提取率下降。因此，選擇20∶1 作為液料比因素的最佳水平。

2.7.4 超聲時間對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲時間10、20、30、35、40、45、50、60 min 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為5.154 3、9.068 1、13.026 4、16.382 6、17.709 4、16.802 2、13.795 3、9.028 2 mg/g。在10～40 min 時間段內提取率隨著超聲時間的增加而上升，原因是超聲時間越長，超聲對于萊菔子細胞壁的破壞程度越大，蘿卜硫素溶解增多，提取率上升；在40～60 min 的時間段內提取率下降，可能是因為隨著超聲時間的增加，蘿卜硫素的溶解率逐漸接近飽和，而其他化合物溶出增多；也可能是超聲時間過長對蘿卜硫素的穩定性有一定影響，故提取率下降。因此，選擇40 min 作為超聲時間因素的最佳水平。

2.7.5 超聲溫度對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲溫度25、30、35、40、45、50、60 ℃時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為2.575 0、3.013 1、8.647 2、13.785 3、14.539 1、13.407 7、11.936 8 mg/g。隨著超聲溫度的升高，蘿卜硫素的提取率先升后降，這是因為隨著超聲溫度的升高，會進一步增加萊菔子細胞壁的破壞程度，加大溶劑與萊菔子中蘿卜硫素的傳質能力；但隨著超聲溫度再升高，反而會使化合物降解，故提取率下降。因此，選擇40 ℃作為超聲溫度因素的最佳水平。

2.7.6 超聲功率對蘿卜硫素提取率的影響 不同超聲功率200、250、300、350、400、450、500 W 時，萊菔子中蘿卜硫素的提取率分別為3.962 8、5.056 2、5.209 5、6.182 4、10.356 4、9.753 1、7.624 3 mg/g。隨著超聲功率的升高，萊菔子中蘿卜硫素的提取率呈現先上升后下降的趨勢。原因可能是隨著超聲功率的升高，高密度渦流和大氣泡的產生增加，介質的物理和化學作用增強，提取率提高；但當功率超過一定值時，提取率開始降低，這是因為當功率過高時，產生的高密度渦流和大氣泡將使得目標組分的結構發生變化，從而導致提取率下降。因此，選擇400 W 作為超聲功率因素的最佳水平。

結合單因素實驗的結果，以萊菔子中蘿卜硫素提取率為響應值比較可知，各因素對萊菔子中蘿卜硫素提取的影響程度：超聲時間＞液料比＞物質的量比＞含水量＞超聲溫度＞超聲功率。

2.8 BBD 實驗優化提取工藝

2.8.1 BBD 實驗設計 采取3 水平4 因素BBD 實驗優化萊菔子中蘿卜硫素的提取條件。在單因素實驗的基礎上，以蘿卜硫素提取率為響應值，選取乳酸（HBD）與氯化膽堿（HBA）物質的量比（X1）、含水量（X2）、液料比（X3）和超聲時間（X4）因素中影響最大的3 水平，分別以?1、0、+1 編碼，因素與水平設計見表3，且超聲溫度和超聲功率分別為40 ℃和400 W。利用Design-Expert 軟件對各種因素進行回歸擬合，優化萊菔子中的蘿卜硫素的提取條件。

表3 BBD 實驗設計與結果Table 3 Experiment design and results of BBD

2.8.2 響應面（RSM）優化提取條件結果分析 采用BBD 實驗涉及到3 個水平、4 個因素，具有5 個重復數據用于評價模型變異性和穩定性。BBD 實驗表格設計及其實驗數據如表3 所示，實驗結果如表4 和圖4 所示，在數據分析軟件中，根據實驗數據，采用多元回歸擬合分析，以提取率Y為響應值。就能夠獲得如下的2 次多項回歸方程Y＝21.97＋1.16X1＋0.71X2＋0.82X3＋0.19X4＋2.40X1X2＋0.22X1X3－2.29X1X4＋0.81X2X3－1.12X2X4＋1.45X3X4－5.07X12－3.87X22－2.52X32－3.18X42。根據提取率方程的方差分析的結果（表4）可以看出，該回歸模型顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P＞0.05），表明模型擬合程度好，模型回歸系數R2＝0.969 8，調整后R2＝0.939 5，表明該模型與實際提取過程的擬合度良好，方程的可靠性較高。通過對方差數據進行分析，可以得出，在物質的量比（X1）、含水量（X2）、液料比（X3）以及提取時間（X4）4 個1 次項中，物質的量比和液料比對提取率具有極顯著影響（P＜0.01），含水量對提取率具有顯著影響（P＜0.05），分析各個因素的主效應關系為X1＞X3＞X2＞X4。2 次項交互作用X1X2、X1X4對提取率具有極顯著的影響（P＜0.01），X3X4、X2X4對提取率具有顯著影響（P＜0.05），X1X3、X2X3對提取率的影響不顯著（P＞0.05）。各個交互因素對提取率影響的顯著性順序排列為X1X2＞X1X4＞X3X4＞X2X4＞X2X3＞X1X3。根據回歸模型的方程，得到的最優提取工藝條件為乳酸與氯化膽堿物質的量比為3.16∶1、含水量為40.82%、液料比為20.96∶1、超聲時間為39.94 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率400 W；最佳提取率為22.20 mg/g。

表4 響應面回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis for response surface regression mode

圖4 X1、X2、X3、X4 交互作用對萊菔子中蘿卜硫素提取率影響的響應面Fig.4 Response surfaces (3D) of effects of interaction of X1, X2, X3 and X4 on extraction rate of sulforaphane from Raphani Semen

2.9 最優提取條件的驗證及DESs 重復利用實驗

2.9.1 最優提取條件的驗證 在DESs 最佳提取條件下提取5.00 g 萊菔子，然后測定萊菔子中蘿卜硫素的提取率，并與預測值相比較，從而評價該模型模擬的準確度。在最佳提取條件下進行多次實驗可得萊菔子中蘿卜硫素的提取率為22.01 mg/g，實驗值與預測值（22.20 mg/g）接近，說明該模型模擬結果準確可靠，為萊菔子中蘿卜硫素的進一步開發利用提供了一定的理論依據。

響應面分析以及最佳工藝的測定是該研究中決定性的步驟，也是對整個研究的總結，其準確度直接影響了研究的結果。在該步驟中，通過對軟件的熟練應用，對響應面實驗結果進行了處理，得到了2 次多項回歸方程、直觀的響應面圖、并且完成了本研究的最終目的得到提取萊菔子中蘿卜硫素的最佳工藝條件。為超聲輔助低共熔溶劑提取萊菔子中的蘿卜硫素求出了一種綠色、環保、高效的蘿卜硫素提取工藝。

2.9.2 DESs 重復利用實驗 取已處理好的3 種不同型號的大孔樹脂（D-101、AB-8、HPD600）進行萊菔子中蘿卜硫素回收實驗。在DESs 最佳提取條件下，精密移取DESs 提取液10 mL，分別加入不同型號的大孔樹脂3.0 g 和6.0 g，混合均勻后，在室溫下于搖床振搖12 h（150 r/min），至大孔樹脂充分吸附溶液后，取上清液用于測定萊菔子中蘿卜硫素的吸附率；對吸附飽和的大孔樹脂進行濾過，大孔樹脂中加入與DESs 提取液等量95%乙醇，振搖6 h（150 r/min），濾過大孔樹脂，得95%乙醇解吸附溶液；DESs 溶劑回收利用，用于下一次萊菔子中蘿卜硫素的提取，測定其重復利用的蘿卜硫素提取率。

綠色化學的發展在很大程度上得利于溶劑的回收。DESs 作為合成溶劑，其蒸氣壓較低，常規減壓濃縮不適合回收溶劑。因此，尋找合適的回收方法對DESs 的進一步發展至關重要。目前報道的文獻中，DESs 可用超臨界CO2、固相萃取等方法進行回收，但其存在價格昂貴或操作復雜的劣勢[35-36]。相比于前者，大孔樹脂吸附法具有操作簡單、成本低廉等優勢，已被用于回收DESs[37]。

本研究考察3 種不同型號的大孔樹脂（AB-8、D-101、HPD600）對萊菔子中蘿卜硫素吸附率的影響，結果表明（表5），3 種樹脂具有一定的吸附率，隨著樹脂的增加，吸附率明顯增加且效果較好，其中，AB-8 吸附率最高達97.49%。當樹脂用量均為3.0 g 時，檢驗結果表明AB-8 吸附效果顯著優于D-101 和AB-8。同時，采用95%乙醇對吸附飽和后的AB-8 解吸附，解吸附率達82.63%。因此，采用大孔樹脂回收NADESs 簡單、有效。蘿卜硫素經大孔樹脂吸附后，DESs 溶液可被回收利用，用于下一循環繼續提取。扣除殘留于DESs中的蘿卜硫素影響，本實驗回收后的DESs 第2 次用于提取萊菔子中的蘿卜硫素，其提取率達20.92 mg/g（n＝3），回收利用率為95.05%。由此說明，DESs 經大孔樹脂吸附后，溶劑完整性較好，可再次回收利用。

表5 不同大孔樹脂對萊菔子中蘿卜硫素吸附率比較 (n = 3)Table 5 Comparison of adsorption rates of sulforaphane in Raphani Semen by different macroporous resins (n = 3)

2.10 銅綠假單胞菌生物膜抑制實驗

2.10.1 銅綠假單胞菌最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）實驗 稱取適量樣品，用分子生物學級DMSO 溶解，配制256 mg/mL 的母液（蘿卜硫素質量分數為22.01 mg/g），并用MH肉湯培養基稀釋至一定質量濃度備用（最終培養基中DMSO 不超過0.2%）；將過夜培養的菌液，用MH肉湯培養基稀釋至在600nm 波長處的吸光度（A600）值為0.01，備用。

細菌MIC 的測定：復蘇PA 菌株，統一采用CLSI 推薦的微量肉湯稀釋法檢測DESs 提取物和抗菌藥物（阿奇霉素）的MIC，質控菌株為銅綠假單胞菌[38]。準確移取100 μL 含樣品的培養基加入到96 孔板中，并二倍稀釋至一系列質量濃度，接種100 μL 稀釋后的菌液，同時設置空白組（只加培養基）、對照組（含0.02% DMSO 菌液）、陽性對照組（阿奇霉素），置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后，觀察各質量濃度對應孔的渾濁程度，出現澄清現象時即為細菌的MIC。

檢測提取物與陽性對照（阿奇霉素）的MIC，探究提取物對細菌的正常生長是否存在影響，是為了確保其對銅綠假單胞菌生物膜的抑制作用不是通過抑制細菌生長活性實現的，而是基于其他機制的調控達到抑制效果。實驗結果表明，與陽性對照組（阿奇霉素）相比，萊菔子的提取物對銅綠假單胞菌具有抑制活性，其MIC 值為256 μg/mL。在遠大于MIC 的濃度下研究對細菌的調控，很大程度上避免了對細菌耐藥性產生的誘導，可作為群體感應活性抑制劑的初步篩選。

2.10.2 銅綠假單胞菌生物膜抑制實驗 采用結晶紫法測定萊菔子提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性[38-39]。將含萊菔子提取物的母液用ABTGC培養基稀釋至一定質量濃度，備用（最終培養基中DMSO 含量不超過0.2%）；將過夜培養的菌液用ABTGC 培養基稀釋至A600＝0.01，備用。

準確移取100 μL 含藥培養基于96 孔板中，并接種100 μL 稀釋后的菌液，同時設置空白組（只加培養基）、對照組（含0.02% DMSO 菌液），陽性對照組（阿奇霉素），96 孔板外周用200 μL 空白培養基封邊，每組數據設置6 個復孔；用封口膜包裹96孔板周邊，防止培養基揮發，并置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h；24 h 后，棄去孔板中菌液，并用PBS 溶液洗凈多余浮菌后晾干；向96 孔板中加入120 μL 甲醇，室溫固定20 min；棄去甲醇，晾干后加入120 μL 0.1%結晶紫染料，染色15 min；棄去結晶紫染料，并用PBS 溶液洗滌至無多余紫色染料溶出；烘干后，向孔板中加入120 μL 33%冰醋酸溶液，置于搖床上振蕩搖勻后，測定A570，計算生物膜的抑制率。

生物膜的抑制率＝(A對照－A藥敏)/(A對照－A空白)

采用結晶紫染色法，檢測萊菔子DESs 提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制活性，實驗結果如表6 所示，4～256 μg/mL 質量濃度下提取物均能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，且呈良好的量效關系，在最高質量濃度256 μg/mL 下，萊菔子提取物的生物膜抑制率達到53.84%，表明其具有開發為新型群體感應抑制劑的潛力。

表6 萊菔子提取物對銅綠假單胞菌生物膜的抑制率Table 6 Biofilm inhibition rate of extracts from Raphani Semen against P.aeruginosa

3 討論

本實驗考察了超聲輔助綠色提取溶劑DESs 用于萊菔子中的蘿卜硫素的提取，發現由氯化膽堿和乳酸合成的溶劑為最佳溶劑。經單因素實驗和響應面法優化得到超聲輔助提取萊菔子中蘿卜硫素的最佳條件：物質的量比為3.16∶1、含水量為40.818%、液料比為20.962∶1、超聲時間為39.937 min、超聲溫度40 ℃、超聲功率400 W；且最佳提取率為22.199 mg/g。同時，在最佳實驗條件下驗證，萊菔子中的蘿卜硫素的提取率達22.013 mg/g，與預測值（22.199 mg/g）接近，說明該模型模擬結果準確可靠。此外，DESs 經大孔樹脂吸附后，溶劑完整性較好，可再次回收利用，說明DESs 提取法具有重復使用、高效、綠色環保等優點。

本研究對DESs 提取液采用群體感應抑制活性實驗表明，萊菔子提取液對銅綠假單胞菌生物膜具有一定的抑制活性。生物膜的形成已成為銅綠假單胞菌耐藥性增加的主要原因之一，避開傳統抗生素的作用靶點，研究特異性針對生物膜的新型抗菌藥物已成為研究熱點。群體感應系統是細菌間進行交流的“語言系統”，調控生物膜的形成和分散過程。當細菌相互聚集且數量達到一定閾值時，可分泌大量的高絲氨酸內酯類自誘導信號分子，這些信號分子可與菌體相應的雙組分調控受體相結合，并通過信號傳導調控生物膜的形成[40-41]。因群體感應系統在生物膜形成中起決定性作用，群體感應抑制劑的研發已成為研究的熱點，而本實驗結果表明，萊菔子DESs 提取物能抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，是一種潛在的群體感應抑制劑。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突