基于代謝組學(xué)和腸道菌群研究黃芪甲苷對心肌梗死大鼠的作用

閆俊元，鐘鑫勤，趙玉翠，王小瑩

天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617

心肌梗死是指因冠狀動脈出現(xiàn)阻塞，心臟肌肉因缺乏血液供應(yīng)出現(xiàn)壞死，使心臟功能受損的一種病癥。臨床表現(xiàn)一般為胸痛為主、呼吸短促、心絞痛等[1-2]。其主要發(fā)作原因為冠狀動脈脂肪物質(zhì)的堆積，進而造成冠狀動脈的堵塞[3]。近些年，心肌梗死因具有極高的患病率和死亡率，已成為影響全球人類健康的重要因素之一[4-5]。目前全球公認的治療手段為服用阿司匹林、硝酸甘油和抗高血壓藥物，治療機制為分解血凝塊、降低血壓以及降低心臟需氧量[3]。雖然這些藥物具有較好的藥效，但也伴隨著較多的不良反應(yīng)。阿司匹林會伴隨腸胃不適以及耐藥性[6]，β 受體阻斷劑的不良反應(yīng)包括直立性低血壓、心動過緩、誘發(fā)支氣管痙攣、加重慢性支氣管炎癥等[7]。因此，目前臨床采用化學(xué)藥物治療心肌梗死的策略仍有改善空間。近些年，中醫(yī)藥治療逐漸得到大眾認可[8]。

2.2 不同b值下的診斷指標(biāo) 對不同b值下肺部結(jié)節(jié)良惡性的相關(guān)診斷指標(biāo)進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，b值為400 s/mm2時特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值均為最高，而b值為400或800 s/mm2時，其敏感度均為91.28%，不同b值間敏感度相比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫味甘，歸肺脾經(jīng)，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌的功效[9-10]。中醫(yī)臨床中，通常用黃芪與其他中藥配伍進行心血管病治療。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪桂枝五味加減方在臨床上可以改善心肌病患者的心功能[11]；防己黃芪湯加麻黃可以顯著改善慢性心衰患者病情[12]。黃芪甲苷是黃芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、促進血管生成的藥理作用[13-14]。黃芪甲苷可以通過抑制Toll 樣受體4（Toll-like factor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路緩解心肌梗死導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)，改善心功能指標(biāo)[15]。此外，黃芪甲苷能夠通過抑制miRNA-1 介導(dǎo)的炎癥和自噬，從而抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）導(dǎo)致的心功能不全[16]。雖然目前關(guān)于黃芪甲苷對心肌梗死治療效果的研究相對完善，但是治療機制以及量-時-效關(guān)系方面還有很多可以探究的空間。因此，本研究旨在利用藥效學(xué)指標(biāo)探究黃芪甲苷量-時-效關(guān)系，并且利用非靶向代謝組學(xué)探討其治療機制通路，為今后臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（220±10）g，購自北京維通利華動物實驗中心，動物許可證編號SCXK（京）2016-0011。動物飼養(yǎng)于SPF 級動物房，自由進水飲食。動物實驗經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號TCM-LAEC2020089）。

對于搜集時已初步理解的內(nèi)容，學(xué)生只要抓住教師的重點觀點和內(nèi)容，去掉無用信息，比對自己的理解和老師的講解有哪些差距，找到欠缺的方面，加深課本內(nèi)容的理解，課后就可以節(jié)約復(fù)習(xí)時間。

對照組給予頭孢曲松治療，靜脈給予注射用頭孢曲松鈉（上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H10983036，1.0 g/支，批號 SH6345、SH6314），每次80 mg/kg，每日1次。

1.2 藥品與試劑

黃芪甲苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%，批號AB0162-1000）購自埃法生物有限公司；10%多聚甲醛（批號3501）購自北京益利精細化學(xué)品有限公司；無水乙醇、二甲苯、苯胺藍、鹽酸、氨水、中性樹脂、生理鹽水（批號10009259、10023418、71003644、10011018、10002108、10004160、69900793）購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；蘇木素-伊紅染液（批號G1076）購自武漢谷歌生物科技；磷鎢酸、磷鉬酸（批號3705、3790）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；PBS 緩沖液、十二烷基硫酸鈉、Tris、甘氨酸、過硫酸銨、聚山梨酯20、MRS 肉湯（批號P1020、S8010、T8060、G8200、A1030、T8220、M8540）購自北京索萊寶生物科技有限公司；肌酸激酶（creatine kinase，CK）、心肌鈣蛋白T（cardiac troponin-T，CTn-T）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）ELISA 試劑盒（批號MM-20460R1、MM-0795R1、MM-0873R1）購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；甲醇、乙腈、蛋白酶抑制劑（批號R40121、4340863、36978）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；異丙醇、Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP 底物、PVDF 膜（批號34863、WBKLS、IPVH00010）購自Merck 公司；2-氯-L-苯丙氨酸（批號B25643）購自上海源葉生物科技生物有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號AR1189）購自博士德生物工程有限公司；RIPA 強裂解液、SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（批號P0013B、P0015L）購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司；磷酸酶抑制劑（批號K1015）購自APExBio 生物科技有限公司；酪氨酸激酶2（Janus kinase2，JAK2）、p-JAK2、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、JAK1抗體（批號AF6022、AF3024、DF6087、AF5012）購自 Affinity 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗（批號ABS132004、ABS20163）購自北京愛必信生物技術(shù)有限公司；信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）、p-STAT6 抗體（批號ab217998、ab263947）購自英國Abcam 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號14786）購自美國CST 公司；Stripping Buffer（批號CW0056S）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA 抽提試劑盒（批號D6538）購自美國Bio-Tek 公司。

1.3 儀器

MX-F 型渦旋混合器（Servicebio Technology 公司）；JA1003 型千分之一電子天平（上海恒平科技儀器有限公司）；MDF-F-682 型?80 ℃低溫冰箱（Panasonic 電器有限公司）；BCD-256KT 型?20 ℃冰箱（青島海爾股份有限公司）；PL6500 型4 ℃冰箱、Legend Micri17R 型高速冷凍離心機、EVOS M7000 型細胞成像系統(tǒng)、UHPLC 液相色譜系統(tǒng)、質(zhì)譜儀、NanoDrop2000 型超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；DK-98-11A 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）；INFINIRE M200型多功能酶標(biāo)儀（Nano Quant公司）；Vevo2100型小動物超聲實時影像系統(tǒng)（加拿大Visual Sonics公司）；CN6-180 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技公司）；DNP-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（蘇州威爾實驗有限公司）；R500 型動物呼吸麻醉機（瑞沃德生命科技有限公司）；臺式快速離心濃縮干燥器（太倉市華美生化儀器廠）；氮氣吹掃儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；ES1000 型熱蓋金屬?。ê贾萑鹫\儀器有限公司）；552BR070914 小型垂直電泳槽、基礎(chǔ)電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；組織研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司）；多功能成像分析系統(tǒng)（美國GE 公司）；PCR 儀（美國ABI 公司）；MISEQ測序儀、HISEQ 測序儀、Illumina MiSeq Platform（美國Illumina 公司）；微型熒光計（美國Turner Bio Systems 公司）。

2 方法

2.1 黃芪甲苷對心肌梗死大鼠的量-時-效關(guān)系考察

2.1.1 心肌梗死大鼠的模型建立及心功能評價 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，術(shù)前禁食12 h，根據(jù)體質(zhì)量腹腔麻醉后進行手術(shù)，在心臟處從外皮依次分離至胸肌，在左胸第4 肋間處用止血鉗撐開胸廓，肉眼可見心臟；將心包膜破開，擠壓右胸使心臟暴露于胸壁外；持提前備好浸沒于生理鹽水的5/0 無損傷絲線結(jié)扎冠狀動脈左前降支。結(jié)扎后再次撐開胸廓令心臟跳回胸腔，松開止血鉗使胸肌和外皮恢復(fù)閉合，排空空氣后關(guān)閉胸腔，以2/0 無損傷絲線分別縫合肌層及皮膚。假手術(shù)組采用同樣方法開胸腔擠出心臟，以5/0 絲線只穿過不結(jié)扎，之后進行排氣縫皮。手術(shù)操作后將大鼠仰面朝上平躺放至電熱毯，待其蘇醒后放回鼠籠進行常規(guī)飼養(yǎng)。

傳統(tǒng)的節(jié)日和節(jié)俗歷史悠久，源遠流長，集中體現(xiàn)了中華傳統(tǒng)文化的核心價值，生動展示了中國人豐富多彩的精神世界，是民族特色和民族個性的具體反映。 同時，它們與民眾生活密切相連，深具活力和影響力，是活態(tài)的傳統(tǒng)文化表現(xiàn)形式，并在世代傳承中起到加強血緣和社會紐帶、促進團結(jié)與文化認同的作用。 它們記錄著中華民族數(shù)千年的歷史，凝聚了民眾的生活和情感，以全民參與的方式傳承文化血脈、提振民族精神、強化歷史記憶，具有深刻的意義和深遠的影響。 絢麗多彩的節(jié)日，是我國人民代代傳承的珍貴文化，也是世界文明的瑰寶。 它們照亮了五千年的歷史，也照耀著未來的天空。

所有大鼠造模1 d 后進行心動超聲檢測。運用超高分辨率小動物超聲實時影像儀檢測大鼠左心室功能，將大鼠放置于小動物麻醉盒中進行氣體麻醉，麻醉后將大鼠用膠帶綁于操作臺，操作臺向右下傾斜30°，調(diào)整探頭，利用B 型超聲切面獲得左心室、主動脈和二尖瓣瓣葉圖像，進一步切換至M 超聲界面，并調(diào)整取樣線的位置，截取M 界面超聲圖像，通過對大鼠收縮期和舒張期進行測量，獲得左室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室短軸縮短率（left ventricular fraction shorting，LVFS）、左心室后壁（left ventricular posterior wall，LVPW）等。采用射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF）數(shù)值＜55%作為造模成功評判標(biāo)準(zhǔn)，予以保留分組，不符合條件的大鼠予以剔除。

2.1.2 動物分組、給藥及給藥后心功能評價 取8只正常SD 大鼠作為空白組，經(jīng)過假手術(shù)操作的8只大鼠作為假手術(shù)組，將造模成功的大鼠分為模型組及黃芪甲苷低、中、高劑量（10、20、40 mg/kg）組和阿托伐他?。?0 mg/kg）組，每組8 只。各給藥組ig 相應(yīng)藥物（5 mL/kg），對照組、假手術(shù)組和模型組ig 等體積的水，1 次/d，連續(xù)給藥14、28 d。給藥后心功能評價方法同“2.1.1”項。

2.1.3 樣品采集 各組大鼠分別于各組時間點取材。大鼠麻醉后腹主動脈取血，分離血清，放置于?80 ℃冰箱。取血后迅速取下心、肺、肝、脾、腎，每組隨機取3 只大鼠的心臟放入10%多聚甲醛固定，用于病理染色。其余迅速放入凍存管，置于液氮過夜，放入?80 ℃冰箱保存。分別于給藥14、28 d 采集各組大鼠糞便樣本，用75%乙醇消毒的鑷子和無菌EP 管取大鼠新鮮糞便2～3 粒，放于?80 ℃冰箱保存。

2.1.4 ELISA 檢測血清中CK、CTn-T、LDH 水平根據(jù)試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中CK、CTn-T、LDH 水平。

節(jié)慶型濱水動態(tài)人文景觀活動主要包括水上飄色、龍舟活動、各水神誕、行通濟、水陸法會和中秋賞月等等活動。其中，（圖3、表2）是對節(jié)慶型傳統(tǒng)濱水動態(tài)人文景觀活動的活動類型、活動時間、主要行為、主要載體及活動性質(zhì)的初步總結(jié)。

（1）HE 染色：取病理切片，二甲苯脫蠟2 次，無水乙醇清洗2 次，梯度乙醇沖洗，自來水洗，然后用蘇木素染色，10%鹽酸乙醇分化，再用稀氨水返藍，伊紅染色，脫水，二甲苯處理后封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

3.2.2 差異代謝物鑒定與篩選 通過數(shù)據(jù)庫的對比與分析，鑒定得到化合物，進一步篩選給藥后回調(diào)代謝物。通過比較篩選找出給藥后回調(diào)的代謝物共有48 個差異代謝物（表4）。

2.2 黃芪甲苷治療心肌梗死的作用機制研究

2.2.1 樣品預(yù)處理 根據(jù)結(jié)果，選取給藥28 d 后空白組、模型組、黃芪甲苷中劑量組大鼠血清進行后續(xù)實驗。吸取50 μL 血清樣品，加入200 μL 預(yù)冷的色譜純乙腈，4 ℃、13 000 r/min 離心10 min。吸取上清液，真空干燥，用含內(nèi)標(biāo)物（2-氯-L-苯丙氨酸）的100 μL 乙腈-水（3∶1）復(fù)溶后，4 ℃、13 000 r/min 離心15 min，吸取上清液至進樣瓶中，上機并進行分析。

2.2.2 LC-MS 檢測

（1）色譜條件：Waters Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相A 為95%水＋5%乙腈（含0.1%甲酸），流動相B 為47.5%乙腈＋47.5%異丙醇＋5%水（含0.1%甲酸）。正離子梯度洗脫程序：0～3 min，0～20% B；3～4.5 min，20%～35% B；4.5～5 min，35%～100% B；5～6.3 min，100% B；6.3～6.4 min，100% B～100% A；6.4～8 min，100% A。負離子梯度洗脫程序：0～1.5 min，0～5%B；1.5～2 min，5%～10% B；2～4.5 min，10%～30%B；4.5～5 min，30%～100% B；5～6.3 min，100% B；6.3～6.4 min，100% B～100% A；6.4～8 min，100%A。體積流量0.40 mL/min；進樣量4 μL；柱溫40 ℃。

（2）質(zhì)譜條件：樣品質(zhì)譜信號采集采用正負離子掃描模式，掃描范圍為m/z70～1 050。鞘氣體積流量為50 arb，輔助氣體積流量為13 arb，輔助氣加熱溫度為425 ℃，正模式離子噴霧電壓設(shè)置為3 500 V，負模式離子噴霧電壓設(shè)置為?3 500 V，離子傳輸管溫度為325 ℃，歸一化的碰撞能為20、40、60 V 循環(huán)碰撞能。一級質(zhì)譜分辨率60 000 Hz，二級質(zhì)譜分辨率7 500 Hz，采用DDA 模式采集數(shù)據(jù)。

2.2.3 數(shù)據(jù)處理 采用代謝組學(xué)軟件Progenesis QI進行峰提取、對齊、鑒定等，最終得到含保留時間、峰面積、質(zhì)荷比以及鑒定信息的數(shù)據(jù)矩陣。并通過該軟件特征峰進行搜庫鑒定，將MS 和MS/MS 質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配，設(shè)定MS 誤差小于1×10?5，同時根據(jù)二級質(zhì)譜匹配得分鑒定代謝物。所用數(shù)據(jù)庫包括http://www.hmdb.ca/、https://metlin.scripps.edu/等主流公共數(shù)據(jù)庫以及平臺自建的數(shù)據(jù)庫。將相關(guān)代謝物代入Ingenuity Pathway Analysis 數(shù)據(jù)庫進行分析。

2.2.4 Western blotting 檢測心肌組織IL-6、JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT6、p-STAT6 蛋白表達 取給藥28 d各組大鼠左心室樣品加入裂解液破碎，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，吸取上清液進行蛋白定量，100 ℃加熱10 min 使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中封閉90 min，分別加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗滌3 次，加入二抗孵育2 h，TBST 洗滌3 次，顯色曝光。

2.3 黃芪甲苷對大鼠腸道微生物多樣性的改善作用研究

2.3.1 DNA 抽提和PCR 擴增 根據(jù)結(jié)果，取給藥28 d 后空白組、模型組、黃芪甲苷中劑量組大鼠糞便進行后續(xù)實驗。根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒說明書進行操作提取DNA，對V3～V4 可變區(qū)進行PCR擴增，擴增程序為95 ℃、3 min，隨后27 個循環(huán)（95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s），最后72 ℃、10 min。擴增體系總體積為20 μL。

轉(zhuǎn)發(fā)錦鯉的背后，是人們對吉祥歡樂、好運的向往，盡管只有千萬分之幾乃至更低的中獎幾率，這種人性的需求是不會過時的。此外，轉(zhuǎn)發(fā)一條企業(yè)的相關(guān)微博，并不需要很高的成本，也不需要花費很多的時間成本，因此即便是小概率的中獎幾率，加上錦鯉的寓意以及吸引力極強的禮單，使得人們都抱有試一試的心態(tài)，是一種“高投機性行為”。

3.1.2 各組大鼠心臟形態(tài)及病理觀察 如圖3、4 所示，給藥14、28 d 的空白組、假手術(shù)組大鼠心臟形態(tài)正常，而模型組大鼠心臟的左前降支冠狀動脈區(qū)域明顯有大面積的梗死，心室部位變白梗死，心室壁顯著變薄，心臟結(jié)構(gòu)松散；各給藥組大鼠心臟結(jié)構(gòu)趨近正常，心室壁厚度也有明顯改善。

2.3.3 生物信息學(xué)分析 基于Illumina HiSeq 測序平臺對擴增的16S 區(qū)域特點構(gòu)建相對應(yīng)的小片段文庫進行雙末端測序。通過對Reads 拼接濾過，使用UPARSE 軟件（ version 7.1 http://drive5.com/uparse/），通過97%的相似度對序列進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類，且在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。對序列進行注釋并設(shè)定閾值為70%根據(jù)數(shù)據(jù)庫對其進行比對，同時采用α 多樣性分析、β 多樣性分析等比較各組之間的差異，挖掘心梗對腸道微生物的影響以及黃芪甲苷對心梗大鼠腸道微生物的改善作用。

2.3.4 益生菌豐度體外驗證實驗 黃芪甲苷用MRS 肉湯配制0.500 000、0.250 000、0.125 000、0.062 500、0.031 250、0.015 625 mg/mL 的給藥溶液，在96 孔板中分別加入100 μL 最佳稀釋倍數(shù)的Lactobacillus_johnsonii菌液以及100 μL 藥液，放入酶標(biāo)儀中，設(shè)置25 個循環(huán)，每循環(huán)2 h，波長600 nm，溫度37 ℃，測定吸光度（A）值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對心梗大鼠的量-時-效關(guān)系

3.1.1 黃芪甲苷對心肌梗死大鼠心功能的影響 給藥14 d 后，如圖1 所示，與空白組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠左心室容積明顯擴張，左室壁顯著變窄，收縮能力減弱。如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠EF、FS 顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷中、高劑量組大鼠EF、FS 均顯著改善（P＜0.05、0.01、0.001）。

表1 給藥14 d 各組大鼠EF 和FS (±s )Table 1 EF and FS of rats in each group after 14 d of administration (±s )

表1 給藥14 d 各組大鼠EF 和FS (±s )Table 1 EF and FS of rats in each group after 14 d of administration (±s )

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 EF/% FS/%空白 — 8 79.170±5.705 49.723±5.698假手術(shù) — 8 77.391±4.226 47.730±4.229模型 — 8 35.900±10.519*** 18.121±5.903***黃芪甲苷 10 8 55.030±12.162 30.261±8.179##20 8 60.937±10.254## 34.378±7.619###40 8 58.798±12.352# 32.609±8.427###阿托伐他汀 20 8 63.672±11.047## 36.341±7.842###

與假手術(shù)組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001，下表同。**P < 0.01 ***P < 0.001 vs sham group; #P < 0.05 ##P < 0.01 ###P <0.001 vs model group, same as below tables.

圖1 給藥14 d 各組大鼠超聲M 模式圖Fig.1 Ultrasonic M-mode long axis section of rats in each group after 14 d of administration

給藥28 d 后，如圖2 所示，相比于給藥14 d組，模型組左心室損傷更加嚴(yán)重，且各給藥組可明顯改善。由表2 可知，與假手術(shù)組相比，模型組EF、FS 顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，黃芪甲苷低、中、高劑量組的EF、FS 均顯著改善（P＜0.01、0.001）。

表2 給藥28 d 各組大鼠EF 和FS (±s)Table 2 EF and FS of rats in each group after 28 d of administration (±s)

表2 給藥28 d 各組大鼠EF 和FS (±s)Table 2 EF and FS of rats in each group after 28 d of administration (±s)

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 EF/% FS/%空白 — 8 82.280±4.603 52.947±5.191假手術(shù) — 8 81.628±5.544 52.242±6.262模型 — 8 34.486±7.032*** 17.456±3.941***黃芪甲苷 10 7 51.176±10.003## 27.604±6.153##20 6 58.390±10.871### 32.681±7.613###40 7 52.452±13.357### 29.021±10.069##阿托伐他汀 20 8 50.888±10.315## 27.516±6.677##

圖2 給藥28 d 各組大鼠超聲M 模式圖Fig.2 Ultrasonic M-mode long axis section of rats in each group after 28 d of administration

2.3.2 Illumina Miseq 測序 PCR 產(chǎn)物利用Axy Prep DNA Gel Extraction Kit 進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用Quanti Fluor?-ST 進行檢測定量。PE 2×300 文庫為上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司根據(jù)Illumina MiSeq 平臺標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段所構(gòu)建。

2.1.5 心臟病理染色

圖3 給藥14 d 各組大鼠心臟形態(tài) (A)、HE 染色 (B) 和Masson 染色 (C)Fig.3 Cardiac morphology (A), HE staining (B) and Masson staining (C) of rats in each group after 14 d of administration

圖4 給藥28 d 各組大鼠心臟形態(tài) (A)、HE 染色 (B) 和Masson 染色 (C)Fig.4 Cardiac morphology (A), HE staining (B) and Masson staining (C) of rats in each group after 28 d of administration

HE 染色結(jié)果顯示，空白組、假手術(shù)組心臟形態(tài)規(guī)整，心肌細胞形態(tài)正常，無嚴(yán)重細胞破損情況；模型組心室部位有大面積梗死，并有心室腔擴大、心室壁變薄的現(xiàn)象，梗死區(qū)域心肌細胞壞死現(xiàn)象嚴(yán)重，大部分細胞發(fā)生炎性浸潤、水腫，細胞形態(tài)不整齊；與給藥14 d 模型組比較，給藥28 d 模型組更加嚴(yán)重；給藥14 d 黃芪甲苷低、中劑量組相比模型組改善作用不明顯；給藥14 d 黃芪甲苷高劑量組恢復(fù)較明顯，心室壁變厚，梗死面積縮小，炎性浸潤減少；給藥28 d 黃芪甲苷低劑量組改善效果不明顯，而給藥28 d 黃芪甲苷中、高劑量組改善效果較好，炎性浸潤明顯減少。

Masson 染色結(jié)果顯示，模型組膠原纖維沉積最嚴(yán)重，且給藥28 d 的模型組更嚴(yán)重。給藥14 d 黃芪甲苷低劑量組膠原纖維沉積略有減少，心室腔以及心室壁有所改善；給藥14 d 黃芪甲苷中、高劑量組和阿托伐他汀組改善效果非常明顯，膠原纖維沉淀明顯減少。與給藥28 d 模型組比較，黃芪甲苷低劑量組和阿托伐他汀組的改善效果并不明顯；而黃芪甲苷中、高劑量組改善明顯。

Graham的本職工作是音樂制作人，在攝影方面他是個新手，但這絲毫不會阻礙他的全情投入。他平時最常用的一臺相機是索尼 Sony A7 II，對他而言，電子取景器是必不可少的功能之一。倫敦相機交易所在Bristol的鮑德溫街有一家分店，Graham和Craig都是這家店的客戶。而這家分店正好有多余的索尼相機可以提供，趁此便利，Graham在本次拍攝中取來了一臺最新的索尼A9，想要感受一下這臺旗艦級相機。

3.1.3 各組大鼠心梗標(biāo)志物水平 如表3 所示，給藥28 d，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中心梗標(biāo)志物CK、CTn-T、LDH 水平顯著升高（P＜0.01、0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷各劑量組心梗標(biāo)志物水平均顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。綜合結(jié)果可知，給藥28 d 治療效果優(yōu)于給藥14 d，且給藥28 d 黃芪甲苷中劑量組效果最優(yōu)，因此后續(xù)代謝組學(xué)和腸道菌群研究采用給藥28 d 空白組、模型組、黃芪甲苷中劑量組的樣品進行實驗。

實施創(chuàng)新驅(qū)動戰(zhàn)略，關(guān)乎東營市經(jīng)濟社會發(fā)展全局和“兩個率先”進程，必須在工作推進上有更大力度，在政策支持上有更大舉措，在營造環(huán)境上有更大作為。圍繞“黃藍兩大戰(zhàn)略”和“兩個率先”目標(biāo)任務(wù)要求，應(yīng)當(dāng)加快探索對策措施，有效促進科技與經(jīng)濟社會銜接融合，推動區(qū)域發(fā)展向創(chuàng)新驅(qū)動轉(zhuǎn)變。

表3 給藥28 d 各組大鼠血清中CK、CTn-T 和LDH 水平 (±s)Table 3 CK, CTn-T and LDH levels in serum of rats in each group after 28 d of administration (±s)

表3 給藥28 d 各組大鼠血清中CK、CTn-T 和LDH 水平 (±s)Table 3 CK, CTn-T and LDH levels in serum of rats in each group after 28 d of administration (±s)

組別 劑量/(mg·kg?1) n/只 CK/(ng·L?1) CTn-T/(ng·L?1) LDH/(ng·L?1)空白 — 8 148.533±8.769 39.434±3.008 26.381±0.306假手術(shù) — 8 157.700±5.602 38.524±1.893 25.153±0.981模型 — 8 170.890±6.211** 47.475±4.482*** 29.296±1.468***黃芪甲苷 10 7 150.895±3.732### 41.229±2.100## 26.788±1.284###20 6 151.295±9.257### 39.032±3.297## 26.495±0.708###40 7 154.723±3.157## 42.188±3.687# 26.474±0.710###阿托伐他汀 20 8 169.804±8.639 46.336±5.329 28.391±0.333

3.2 黃芪甲苷治療心肌梗死的作用機制研究

3.3.1 物種組成分析 如圖8 所示，與空白組比較，模型組 unclassified_f_Oscillospiraceae、g_Adlercreutzia、g_Papillibacter、g_Rodentibacter屬水平豐度顯著降低（P＜0.05），g_Dubosiella、g_Dorea屬水平豐度顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組unclassified_f_Oscillospiraceae、g_Adlercreutzia、g_Papillibacter、g_Rodentibacter屬水平豐度顯著升高（P＜0.05），g_Dubosiella、g_Dorea屬水平豐度顯著下調(diào)（P＜0.05）。

圖5 正 (A)、負 (B) 離子模式下質(zhì)控樣本的總離子流圖Fig.5 Total ion flow of quality control sample under positive (A) and negative (B) ion modes

（2）Masson 染色：與HE 染色操作步驟相同，直至稀氨水返藍后用麗春紅染色，用冰醋酸水溶液浸洗，用磷鉬酸分化，苯胺藍染后脫水，二甲苯浸洗后封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

表4 黃芪甲苷給藥后回調(diào)差異代謝物Table 4 Callback of differential metabolites after administration of astragaloside IV

3.2.3 差異代謝物影響的相關(guān)基因 利用IPA 對48個回調(diào)差異代謝物進行網(wǎng)絡(luò)分析，構(gòu)建“代謝物-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖6），可知代謝物參與的相關(guān)靶點及通路。其中，STAT6 經(jīng)過磷酸化發(fā)揮調(diào)控免疫、炎癥反應(yīng)的作用，且其他靶點也多與炎癥相關(guān)，如IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）等。

圖6 給藥后回調(diào)差異代謝物網(wǎng)絡(luò)分析Fig.6 Network analysis of callback differential metabolites after administration

3.2.4 黃芪甲苷對心肌梗死大鼠心臟組織中IL-6/JAK/STAT6 通路相關(guān)蛋白表達的影響 如圖7 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟組織IL-6、p-JAK2/JAK2、p-STAT6/STAT6 和JAK1 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05、0.001）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組IL-6 和JAK1 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），黃芪甲苷低劑量組p-JAK2/JAK2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），黃芪甲苷低、中劑量組p-STAT6/STAT6 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖7 黃芪甲苷對心肌梗死大鼠心臟組織中IL-6/JAK/STAT6 通路相關(guān)蛋白表達的影響 (±s , n = 3)Fig.7 Effect of astragaloside IV on expressions of IL-6/JAK/STAT6 pathway related-proteins in cardiac tissue of rats with myocardial infarction (±s , n = 3)

3.3 黃芪甲苷對大鼠腸道微生物多樣性的改善作用

3.2.1 總離子色譜 正、負離子模式下，質(zhì)控樣品的總離子色譜圖見圖5。表明該檢測條件下，峰形良好，分布相對均勻。

圖8 屬 (A)、種 (B) 水平物種組成組間差異Fig.8 Genus (A) and species (B) level differences between groups of species composition

與空白組比較，模型組 unclassified_f_Oscillospiraceae、uncultured_bacterium_g_Adlercreutzia等菌種水平豐度顯著下調(diào)（P＜0.05 ），uncultured_bacterium_g_Dubosiella、uncultured_bacterium_g_Dorea等菌種水平豐度顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷中劑量組unclassified_f_Oscillospiraceae、uncultured_bacterium_g_Adlercreutzia等菌種水平豐度顯著上調(diào)（P＜0.05），uncultured_bacterium_g_Dubosiella、uncultured_bacterium_g_Dorea等菌豐度顯著降低（P＜0.05）。

3.3.2 差異代謝物與腸道菌群結(jié)果聯(lián)合分析 將腸道生物多樣性結(jié)果與48 種代謝物進行聯(lián)合分析，屬水平物種g_Dubosiella、g_norank_f_Muribaculaceae與4-乙烯基苯酚硫酸鹽、2-苯乙醇葡萄糖醛酸等代謝物呈正相關(guān)（P＜0.05、0.01）；與3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸、12-羥基十七烷酸等代謝物呈負相關(guān)（P＜0.05）；屬水平物種g_Intestinimonas、g_Roseburia、Oscillospiraceae與苯甲酸、N-乙?；鶎Π被郊姿帷ⅠR尿酸等代謝物呈負相關(guān)（P＜0.05，圖9）。

為確認SL-ASIA量表測量的有效性，本文將3個村寨獲得的樣本按各村寨人數(shù)比例隨機分成人數(shù)基本相同的兩組（Ecklund，2005；Reynolds，Ecklund &Terrance，2011）。使用一組樣本借助探索性因子分析檢驗侗寨原住民的文化適應(yīng)情況及內(nèi)在維度，使用另一組樣本借助驗證性因子分析來交叉驗證第一組樣本里提出的維度模型，以觀察和確認派生出的各個維度的內(nèi)部一致性。

圖9 屬水平代謝組學(xué)和微生物組學(xué)聯(lián)合分析Fig.9 Combined analysis of metabolomics and microbiome at genus level

3.3.3 益生菌體外驗證 0～12 h，各質(zhì)量濃度的黃芪甲苷可在體外上調(diào)益生菌Lactobacillus_johnsonii種水平豐度，且0.062 500 mg/mL 的黃芪甲苷促進益生菌生長程度最明顯（圖10）。

圖10 0～12 h 內(nèi)Lactobacillus_johnsonii 生長程度Fig.10 Degree of Lactobacillus_johnsonii growth in 0—12 h

4 討論

目前臨床中治療心肌梗死的常用藥為β 受體阻滯劑[17-18]，可通過降低心肌細胞收縮力的負性肌力等作用，減少心肌耗氧量[19]。但此類藥物的臨床治療需要在患者發(fā)病短時間內(nèi)使用小劑量治療并長時期使用才可降低患者發(fā)病率及死亡率[20]，且在停藥之后會出現(xiàn)心絞痛等嚴(yán)重不良反應(yīng)[21]。中醫(yī)藥治療因具有多成分、多靶點且不良反應(yīng)較小的特點，逐漸得到大眾認可。防己黃芪湯是中醫(yī)臨床治療心血管疾病的常用方之一，課題組前期已探討防己黃芪湯加減方對心血管疾病的治療作用，本研究擬探究其君藥黃芪的主要有效成分的量-時-效關(guān)系及作用機制，為新藥開發(fā)及組分中藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

阿東心里一直都悲傷著。聽羅爹爹跟母親嘮叨，像他們活著時那樣說話，便心生感動。再聽到后面兩句，他險些想笑了。

綜上,對任意的ε>0,存在N,當(dāng)n>N時, ρG(xn,1)

在體內(nèi)實驗中，通過檢測超聲心動圖，發(fā)現(xiàn)相比給藥14 d 模型組，給藥28 d 模型組更嚴(yán)重；且給藥14 d 黃芪甲苷中、高劑量組EF、FS 有明顯改善，給藥28 d 黃芪甲苷各劑量組均可顯著改善EF、FS，由此證明黃芪甲苷可以改善左前降至結(jié)扎手術(shù)所致心肌梗死的心臟收縮能力，且給藥28 d 效果優(yōu)于給藥14 d。根據(jù)病理染色發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠心臟左心室腔明顯擴張，炎性浸潤嚴(yán)重，正常區(qū)域也伴隨著細胞水腫的現(xiàn)象，且給藥28 d 模型組比給藥14 d 更嚴(yán)重；給藥14 d 僅黃芪甲苷高劑量組改善較明顯，炎性浸潤顯著減少，梗死面積變??；而給藥28 d 黃芪甲苷中、高劑量組均可明顯改善，梗死面積明顯減少，且心肌纖維化明顯改善。研究表明，心肌梗死過程中，早期的炎癥是誘導(dǎo)壞死心肌修復(fù)的必然條件，但壞死細胞誘導(dǎo)的過度且長時間炎癥會導(dǎo)致不可逆的持續(xù)性損傷和壞死區(qū)域擴大，甚至導(dǎo)致心肌纖維化，造成心衰[22]。據(jù)報道，黃芪甲苷可通過促進損傷細胞自噬，從而抑制其誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，防止進一步加重病情[16]。CK、CTn-T 和LDH 在臨床中通常可作為預(yù)測心肌梗死的指標(biāo)[23-26]。黃芪甲苷可以顯著減少給藥28 d 大鼠血清中心梗標(biāo)志物，且中劑量組效果最優(yōu)。綜合結(jié)果判斷量-時-效關(guān)系，認為給藥28 d 治療效果優(yōu)于給藥14 d。

根據(jù)非靶向代謝組學(xué)結(jié)果可知，黃芪甲苷給藥后可回調(diào)血清內(nèi)48 種回調(diào)代謝物水平，而其中部分代謝物的作用已有文獻記載，例如吉馬酮代謝物在給予黃芪甲苷后相比模型組顯著升高，此類代謝物具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等藥理作用，可以抑制模型大鼠IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達，并且上調(diào)TGFβ1 和IL-10 水平發(fā)揮抗炎活性[27]。模型組腎上腺素紅代謝物含量顯著升高，給予黃芪甲苷后降低，研究表明腎上腺素紅會顯著降低大鼠心率和冠狀動脈血流量[28]。將48 個回調(diào)代謝物進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，結(jié)果表明主要與苯丙氨酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝等相關(guān)。其中，苯丙氨酸代謝與心血管疾病有密切聯(lián)系。血漿中苯丙氨酸水平升高也是預(yù)測臨床心衰患者死亡率的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[29]。通過IPA 數(shù)據(jù)庫分析出的靶點圖發(fā)現(xiàn)，STAT6、整合素αM（integrin alpha M，ITGAM）、IL-6、IL-1β 等靶點多與炎癥相關(guān)。且據(jù)報道，重要代謝物吉馬酮可以通過調(diào)控JAK/STAT 通路誘導(dǎo)人肝癌HepG2 細胞凋亡[30]，而且還可以通過抑制IL-6、NF-κB 等通路上游細胞因子發(fā)揮抗炎作用[27,31]。此外，JAK/STAT 通路與苯丙氨酸代謝密切相關(guān)[32]，可通過STAT 酪氨酸突變?yōu)楸奖彼醽硪种艻L-6 的信號傳導(dǎo)，密切參與炎癥反應(yīng)[33]。因此，下一階段實驗針對IL-6/JAK/STAT6 這一通路進行驗證。Western blotting 結(jié)果顯示，黃芪甲苷可以顯著抑制心臟組織IL-6 表達，進而導(dǎo)致抑制JAK2 和STAT6的磷酸化。在篩選JAK 其他亞型時，發(fā)現(xiàn)心臟組織中JAK1 表達有顯著的變化趨勢。與假手術(shù)組比較，模型組JAK1 蛋白表達水平顯著升高，黃芪甲苷中劑量組JAK1 蛋白表達水平顯著降低。研究表明，JAK1 總蛋白的激活會誘導(dǎo)JAK2 的磷酸化[34-35]。此外，Chen 等[36]研究發(fā)現(xiàn)，JAK1 總蛋白表達量與細胞自噬程度呈正相關(guān)，而黃芪甲苷具有調(diào)控自噬作用，可以通過抑制過度自噬，從而達到減少損傷的效果[37-39]。推測黃芪甲苷不僅通過 IL-6/JAK2/STAT6 信號通路抑制心梗炎癥反應(yīng)，還可通過抑制JAK1 總蛋白表達，抑制對JAK2 蛋白的促磷酸化作用，并且調(diào)控細胞自噬，減緩病情加重。

由表1及表2可知,所測CO2濃度誤差百分比控制在2%以內(nèi),溫度的誤差百分比在4%以內(nèi),可以滿足航站樓環(huán)境參數(shù)采集要求。

腸道菌群與心血管疾病之間有密切聯(lián)系，心肌梗死的發(fā)生會導(dǎo)致腸道菌群組成改變，而菌群多樣性的改善也會調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物水平，輔助治療心肌梗死[40]。結(jié)果表明，黃芪甲苷可以回調(diào)部分菌群豐度，且文獻記載部分屬水平菌群有明確作用。研究表明，在給予預(yù)防肥胖的藥物后小鼠腸道微生物菌群中unclassified_f_Oscillospiraceae 豐度顯著上調(diào)[41]。并且在谷維素緩解高脂肪高膽固醇飲食導(dǎo)致的高膽固醇脂血癥實驗中，unclassified_f_ Oscillospiraceae 的豐度也會因高脂血癥減輕而上調(diào)[42]，而高脂肪飲食是導(dǎo)致心肌梗死、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要因素[43]，由此預(yù)測此屬菌群的上調(diào)會發(fā)揮預(yù)防肥胖的作用。g_Adlercreutzia可化學(xué)吸收IL-1β、IL-6，證明g_Adlercreutzia菌屬水平增加可以減輕機體的炎癥，緩解病情[44-46]。表明黃芪甲苷通過上調(diào)g_Adlercreutzia豐度發(fā)揮抗炎作用，改善心肌梗死。丁酸鹽是g_Papillibacter的代謝產(chǎn)物[47]，而丁酸鹽可以抑制機體炎癥和氧化應(yīng)激[48]。表明黃芪甲苷通過上調(diào)g_Papillibacter豐度增加代謝產(chǎn)物丁酸鹽，從而抑制心肌梗死炎癥及氧化應(yīng)激。g_Dubosiella屬豐度上升通常伴隨著腸道炎癥[49]，抑制產(chǎn)生短鏈脂肪酸的細菌生長，短鏈脂肪酸可維持腸道穩(wěn)態(tài)和緩解炎癥反應(yīng)，增強腸道屏障完整性[50]，因此抑制這類細菌生長可發(fā)揮抗炎反應(yīng)。g_Dorea的豐度與肥胖程度呈正相關(guān)[51]，而肥胖是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要因素之一。此外，將這48 種回調(diào)代謝物與腸道菌群屬水平結(jié)果進行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)unclassified_f_Oscillospiraceae 和g_Dubosiella菌群不僅與部分回調(diào)代謝物呈相關(guān)性，而且在給與黃芪甲苷后屬水平豐度有明顯改善。因此推測黃芪甲苷可通過改善腸道菌群，調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝物水平。在種水平菌群結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷組體內(nèi)Lactobacillus_johnsonii水平豐度有上調(diào)趨勢，而Lactobacillus_johnsonii在體內(nèi)具有抗炎、抗菌作用[52]。體外驗證實驗結(jié)果表明，黃芪甲苷可以顯著促進Lactobacillus_johnsonii生長。綜合量-時-效關(guān)系、作用機制以及腸道菌群結(jié)果推測，黃芪甲苷具有促進部分益生菌生長、改善腸道菌群的作用，回調(diào)體內(nèi)代謝物水平，通過調(diào)控心肌IL-6/JAK/STAT6 信號通路，發(fā)揮抗炎以及調(diào)控自噬作用，從而改善心功能。

本研究探究了黃芪甲苷對心肌梗死大鼠的量-時-效關(guān)系，利用非靶向代謝組學(xué)和IPA 數(shù)據(jù)庫分析其作用靶點，采用Western blotting 方法進行IL-6/JAK/STAT6 通路驗證，并且探究黃芪甲苷對心梗大鼠腸道菌群的改善作用，為黃芪治療心血管疾病提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突