腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標志物研究

尚津鋒，焦家康，路穎慧，閆明雪，王璟邑，理扎·沙布爾江，崔一然，劉 欣*

1.北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488

2.首都醫科大學附屬北京中醫醫院藥學部，北京 100010

心腦血管疾病屬于常見的慢性病范疇，多發于中、老年人群，近年來發病有年輕化的趨勢，具有發病隱匿、病因復雜等特點，常造成心、腦、腎等多個靶器官的結構或功能損害，嚴重威脅人類健康[1-2]。目前，我國心血管疾病的年齡標準化患病率總體增加，缺血性心臟病和缺血性卒中的發病率也顯著增加[3]。總之，心腦血管疾病的發病率與致死率均有明顯的上升趨勢。人是復雜的生物體，胚胎時期心和腦同時發育，因此在生理或病理狀態下，各器官發育和損傷是相互關聯的，心和腦之間尤為明顯[4]。近年來，隨著心腦研究不斷深入，神經心臟病學興起，研究心臟和大腦互相損傷成為熱點話題[5]。臨床和實驗證據表明，腦損傷和心臟功能障礙之間存在因果關系。比如，腦梗死后心律失常不僅是急性期致死的主要原因，還是中后期預后不良的先兆，有效防止腦梗死后心律失常是改善預后的關鍵[6]。故在不同病理狀態同一機體條件下研究腦、心同治，更接近疾病本質[7]。以此為基礎，辨識和確認腦、心共同的失衡特定分子機制，是“心腦同治”的關鍵科學問題之一。

基于“心腦同治”理念，腦心軸（神經系統和心血管系統之間的雙向串擾）的研究越來越多[8]。而主要負責學習和記憶的海馬在調節神經系統和心血管系統之間的雙向串擾中起著關鍵作用[9]。由于腦心軸的雙向性，神經系統疾病導致海馬神經元死亡，同時心血管疾病也伴隨著海馬損傷[10]。從大腦海馬的角度，研究心腦相互作用機制具有重要意義。此外，先天免疫細胞與動脈粥樣硬化的缺血性并發癥密切相關，從先天免疫系統角度有助于研究缺血性腦卒中、心肌梗死等缺血性損傷[11-12]。因此，免疫和炎癥是“心腦同治”的生物學基礎之一，研究關鍵靶點作為免疫和炎癥標志物，有助于深入闡明心腦血管疾病的發病機制。本研究結合前期研究基礎，基于大鼠心肌缺血模型和腦缺血模型，驗證腦心通膠囊“心腦同治”作用。同時，以海馬為切入點，預測并驗證大腦海馬中“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標志物。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，體質量（260±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2018-0001。動物于室溫22～25 ℃、相對濕度50%～60%、12 h 明暗交替環境中適應性飼養3 d。動物實驗由北京中醫藥大學學術委員會實驗動物倫理分委員會進行倫理審批（批準號BUCM-4-2022032201-1048）。

1.2 藥品與試劑

腦心通膠囊（批號211258）購自陜西步長制藥有限公司，水合氯醛（批號K2125780）購自阿拉丁生化科技股份有限公司；卡托普利（批號2109052）購自輔仁藥業集團有限公司；銀杏提取物（批號6280219）購自德國威瑪舒培博士藥廠；2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）磷酸緩沖液（批號01223Z031）、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（批號20220307）購自北京索萊寶科技有限公司；戊二醛固定液（批號C13397109）購自上海麥克林生化科技有限公司；812 包埋劑（批號90529-77-4）購自SPI 公司；蛋白定量染液（批號WC320333）購自北京華興博創生物技術中心；二硫蘇糖醇（批號2923C501）、碘代乙酰胺（批號0736C278）購自美國Amresco 公司；胰蛋白酶（批號0000490995）購自美國Promega 公司；乙腈（批號0000221770）購自美國J.T.Baker 公司；甲酸（批號BCBM11920）購自美國Sigma-Aldrich 公司；RNA 提取試劑盒（批號017E211JA）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；qRT-PCR 單鏈合成試劑盒（批號Q10923）、染料法熒光定量預混試劑（批號Q30716）購自北京全式金生物技術股份有限公司；蛋白預制膠（批號2022C0GT202107）、快速封閉液（批號20220916）購自蘇州新賽美生物科技有限公司；聚偏二氟乙烯膜（批號K5CA1684L）、快速電轉液（批號20230203）購自美國Bio-Rad 公司；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（批號4970S-18/19）購自美國CST 公司；Toll 樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）抗體（批號1092471）、Toll 樣受體9（Toll-like receptor 9，TLR9）抗體（批號5878610）、α-干擾素（interferon-α，IFN-α）抗體（批號9591070）均購自Affinity 公司；TLR4 抗體（批號10005089）、TLR7 抗體（批號00087567）均購自美國Proteintech 公司；干擾素調節因子3（interferon regulatory factor-3，IRF3）抗體（批號BA12138785）、IRF7 抗體（批號AI08126969）均購自北京博奧森生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號GR3359225-3）購自英國Abcam 公司。

1.3 儀器

MADLAB-4C/501H 型多功能生理信號采集記錄儀（北京眾實迪創科技發展有限公司）；XR220 Pluse 型全自動生化分析儀（新銳醫療設備有限公司）；HT7800/HT7700 型透射電鏡（日本Hitachi 公司）；SThermo Scientic Easy nLC 1000 system 型高效液相色譜系統、Orbitrap Fusion Lumos 型質譜系統（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；CFX96 型實時熒光定量PCR 儀、powerpac basic041BR326356 型電泳儀電源、ChemiDoc MP imaging system 型化學發光成像系統（美國Bio-Rad 公司）；TS-2000A 型脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 心肌缺血和腦缺血模型的制備

2.1.1 心肌缺血模型的制備 采用結扎左前降支冠狀動脈（left anterior descending coronary artery ligation，LAD）模型為心肌缺血模型。開胸暴露心臟，從左心耳下方入針，將左心耳和肺動脈圓錐的交界和心尖連線上作為縫扎的中點，縫扎的方向平行于左心耳的邊緣。除假手術組外，其余各組大鼠均進行LAD，結扎后可見下方大面積心肌表面顏色變為蒼白，室壁運動明顯減弱。假手術組只穿線不結扎，其余操作和模型組相同。

2.1.2 腦缺血模型的制備 采用大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型為腦缺血模型。各組大鼠ip 10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，MCAO 模型組分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，插入線栓，至標記進入頸內動脈與頸總動脈分叉處，術后保溫。假手術組除不插線栓外，其余與模型組大鼠操作一致。

2.2 分組與給藥

根據前期研究基礎，篩選出LAD 造模14 d 是心損及腦的關鍵時間點，MCAO 造模1 d 是腦損及心的關鍵時間點[13-14]。將120 只大鼠隨機分為8 組，每組15 只，包括研究心肌缺血的假手術組、LAD模型組、腦心通（110 mg/kg）組和卡托普利（10.125 mg/kg）組，以及研究腦缺血的假手術組、MCAO 模型組、腦心通（220 mg/kg）組和銀杏提取物（50 mg/kg）組。其中，用于心肌缺血研究的模型組、腦心通組和卡托普利組均進行心肌缺血造模，用于腦缺血的模型組、腦心通組和銀杏提取物組進行腦缺血造模。腦心通和陽性藥劑量由前期實驗研究確定。所有動物每天8: 00 和20: 00 時各ig 給藥1 次，持續最佳天數，最佳天數的第2 天7: 00 時ig 給藥1 h后造模，假手術組和模型組大鼠灌胃空白溶劑。

2.3 藥效學指標

2.3.1 心電圖檢測 在進行整體實驗前，檢測所有實驗動物的心臟功能，以保證所有實驗動物的心臟功能在實驗前均正常。將大鼠麻醉后，用多功能生理信號采集記錄儀采集心電圖。

2.3.2 心肌酶譜測定 麻醉大鼠，進行腹主動脈取血，3 000 r/min 離心15 min，分離出血清，使用全自動生化分析儀檢測血清中心肌酶天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活性。

2.3.3 神經功能評分評價神經功能 造模后應用盲法對大鼠進行神經功能評分。神經功能評分采用Bederson 評分標準。0 分：無神經損傷癥狀；1 分：懸尾實驗不能完全伸展對側前爪；2 分：前肢抵抗對側推力能力下降；3 分：向對側轉圈。

2.3.4 腦組織含水率測定 斷頭處死大鼠，迅速取腦，采用干-濕質量法測定腦含水率。將腦組織立即稱定質量得濕質量；然后將鋁箔包好的腦組織烘干24 h，恢復到室溫后稱定質量得干質量，計算腦組織含水率。

腦組織含水率＝(濕質量－干質量)/濕質量

2.3.5 TTC 法測定梗死率 大鼠斷頭處死，取心臟做2 mm 冠狀切片，在2% TTC 磷酸緩沖液中染色，置于10%中性甲醛內固定后整齊排列，掃描正反面。利用Image J 軟件測量紅、白區域的面積，計算心梗死率。

心梗死率＝心梗死組織體積/總心體積

大鼠斷頭處死，取全腦做2 mm 冠狀切片，在2% TTC 磷酸緩沖液中染色，置于4%多聚甲醛內固定后整齊排列，掃描腦片正反面。利用Image J 軟件測量紅、白區域的面積，計算腦梗死率。

腦梗死率＝腦梗死組織體積/總腦體積

2.3.6 HE 染色觀察病理變化 按照HE 染色試劑盒說明書進行操作，取心肌組織和腦海馬組織，經過脫蠟、染色、脫水、透明、固封等步驟進行HE 染色，并用透射電鏡觀察病理改變。

2.3.7 透射電子顯微鏡觀察線粒體變化 麻醉大鼠后，進行0.9%氯化鈉溶液灌注，灌注后取1 mm3心室左下方心肌組織或大腦海馬組織經固定、室溫脫水、滲透包埋、聚合、超薄切片、染色，置于透射電鏡下觀察心肌細胞或海馬神經元的線粒體形態。

2.4 生物信息學預測免疫炎癥標志物

腦心通由黃芪、赤芍、丹參、當歸、川芎、桃仁、紅花、乳香、沒藥、雞血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龍、全蝎、水蛭共16 味中藥組成。本草組鑒（HERB）數據庫（http://herb.ac.cn/）是集高通量實驗數據和參考文獻于一體的天然藥物數據庫平臺，包含SymMap、TCMID 2.0、TCMSP 2.3 等多種數據庫，提供中藥材、中藥有效成分、靶基因、疾病、高通量實驗和參考挖掘數據等瀏覽、搜索、查看、下載等功能[15]。本研究運用HERB 數據庫檢索腦心通所含中藥的靶點，運用Genecards 數據庫（https://www.genecards.org/）[16]、TTD 數據庫（https://db.idrblab.net/ttd/）[17]獲取腦缺血和心肌缺血的靶點。利用Venny工具對腦心通、心肌缺血、腦缺血3 個靶點集取交集，從而獲取腦心通“心腦同治”靶點。運用STRING 數據庫[18]和Cytoscape3.8.0 的cytoHubba 插件[19]構建蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡并分析核心靶點，最終對核心靶點進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

2.5 蛋白質組學篩選差異表達蛋白

從各組心肌組織和腦組織中提取蛋白質并進行蛋白定量、酶切和脫鹽。通過高效液相色譜系統進行梯度洗脫、蛋白質分析，組分凍干后以20 μL 2%甲醇-0.1%甲酸復溶，離心，吸取上清采用夾心上樣法按10 μL 上樣體積進行上樣處理，Loading Pump體積流量設置為300 nL/min，上樣15 min；上樣后按分離體積流量600 nL/min 進行分流。液相分析條件：流動相A 為0.1%甲酸水溶液，B 為80%乙腈-0.1%甲酸，加載泵體積流量設定為300 nL/min。加載樣品15 min；分離體積流量設定為600 nL/min，梯度洗脫：0～8 min，5%～10% B；8～58 min，10%～24% B；58～70 min，24%～32% B；70～71 min，32%～95% B；71～78 min，95% B。質譜分析條件：Nanospray Flex（NSI）離子源，離子噴霧電壓為2.0 kV，離子傳輸管溫度為320 ℃，質譜全掃描范圍為m/z300～1 400；一級質譜分辨率設為120 000，最大增益控制（automatic gain control target，AGC）為5×105，最大注入時間為50 ms；二級質譜分辨率設為15 000，AGC 為5×103，最大注入時間為35 ms。以P＜0.05、差異倍數（fold change，FC）≥1.2 為標準，篩選心肌組織和腦組織中的差異表達蛋白。

2.6 qRT-PCR 檢測IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 的mRNA 表達

根據預測和蛋白質組學結果，采用qRT-PCR 檢測關鍵靶點的mRNA 表達量。利用RNA 提取試劑盒提取大鼠海馬組織總RNA。參照單鏈合成試劑盒說明書合成第一鏈cDNA，以cDNA 為模板進行qRT-PCR，體系20 μL，擴增條件為94 ℃預變性1 min，94 ℃變性5 s，50～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40 個循環。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，按2?ΔΔCt法計算IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α的mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.7 Western blotting 檢測IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 蛋白表達

根據生物信息學預測和蛋白質組學研究，采用Western blotting 對關鍵的免疫炎癥相關蛋白進行驗證。將大鼠的大腦海馬勻漿，提取核蛋白，離心取上清液，檢測蛋白質濃度，上樣、電泳、電轉、封閉后，用非標記一抗及HRP 標記的二抗對其進行孵育、檢測。以β-actin 作為對照，用Image J 軟件計算IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白的相對表達水平。

2.8 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統計分析。采用單因素方差分析中最小顯著性差異法進行多組比較。對于非正態數據采用非參數分析。圖表使用GraphPad Prism 8 軟件生成，數據以±s表示。

3 結果

3.1 腦心通膠囊改善LAD 大鼠的心臟和腦損傷

如圖1 所示，與假手術組比較，模型組大鼠的心梗死率及血清AST、LDH 活性均顯著升高（P＜0.01），心電圖出現明顯的病理改變，說明LAD 大鼠心臟出現損傷；與模型組比較，腦心通組和卡托普利組大鼠心梗死率和血清心肌酶活性均顯著降低（P＜0.01），且心肌組織損傷減少、線粒體損傷減輕。如圖2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠的海馬組織出現部分病理改變，神經元數量減少，線粒體體積增大，線粒體嵴數量減少，腦含水率升高（P＜0.05）；與模型組比較，腦心通組和卡托普利組海馬組織神經元的病理學改變減少，腦組織水腫減輕。

圖1 心肌缺血狀態下各組大鼠的心梗死率 (A)、心電圖 (B)、心肌酶譜 (C)、心肌組織HE 染色 (D) 和超微結構 (E)(±s , n = 6)Fig.1 Myocardial infarction rate (A), electrocardiogram (B), myocardial enzyme spectrum (C), HE staining (D) and ultra microstructure (E) in myocardium of rats in each group under myocardial ischemia (±s , n = 6)

圖2 心肌缺血狀態下各組大鼠的腦海馬組織HE 染色 (A)、超微結構 (B) 和腦組織含水率 (C) (±s, n = 6)Fig.2 HE staining (A), ultra microstructure (B) of cerebral ehippocampus tissue and rate of water content in brain tissue(C) of rats in each group under myocardial ischemia (±s , n = 6)

3.2 腦心通膠囊改善MCAO 大鼠的腦和心臟損傷

如圖3 所示，與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率、神經功能評分、腦組織含水率均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組大鼠腦梗死率、神經功能評分、腦組織含水率均顯著降低（P＜0.05、0.01），且海馬CA1 區病理損傷明顯減少。與假手術組比較，模型組心電圖紊亂，心肌細胞排列稀疏，細胞間隙變大，細胞胞體皺縮，心肌纖維紊亂；與模型組比較，各給藥組大鼠的心電圖紊亂情況減少、心肌組織損傷減輕。

圖3 腦缺血狀態下各組大鼠的腦梗死率 (A)、神經功能評分 (B)、腦組織含水率 (C)、腦組織HE 染色 (D) 和超微結構(E) (±s , n = 6)Fig.3 Cerebral infarction rate (A), neural function score (B), rate of water content in brain tissue (C), HE staining (D) and ultra microstructure (E) in brain tissue of rats in each group under cerebral ischemia (±s , n = 6)

透射電鏡實驗主要觀察心肌組織的肌節、肌纖維、線粒體形狀、線粒體嵴結構、基質密度等的變化情況。如圖4 所示，假手術組均未見異常，其肌節保持完整，肌纖維及線粒體均排列緊密，線粒體連續外膜明顯。與假手術組比較，造模1 d 后細胞內線粒體出現腫脹，形成不規則空泡，嵴歪曲、斷裂，甚至溶解；與模型組比較，腦心通組線粒體腫脹、嵴歪曲、斷裂現象減少，有所改善。心肌酶譜結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠血清中AST、LDH 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中AST、LDH 活性顯著降低（P＜0.01）。

圖4 腦缺血狀態下各組大鼠的心電圖 (A)、心肌組織HE 染色 (B)、超微結構 (C) 和心肌酶譜 (D) (±s , n = 6)Fig.4 Electrocardiogram (A), HE staining (B), ultra microstructure (C) in myocardium and myocardial enzyme spectrum(D) of rats in each group under cerebral ischemia (±s , n = 6)

3.3 生物信息學預測“心腦同治”的免疫和炎癥標志物

如圖5 所示，運用HERB 數據庫檢索腦心通16味中藥的靶點，得到黃芪166 個靶點、赤芍75 個靶點、丹參173 個靶點、當歸39 個靶點、川芎36 個靶點、桃仁24 個靶點、紅花142 個靶點、乳香58個靶點、沒藥204 個靶點、雞血藤91 個靶點、牛膝89 個靶點、桂枝519 個靶點、桑枝75 個靶點、全蝎7 個靶點、水蛭18 個靶點、地龍0 個靶點，去重得到腦心通939 個靶點。Genecards 數據庫得到心肌缺血656 個靶點、腦缺血771 個靶點，TTD 數據庫得到心肌缺血4 個靶點、腦缺血4 個靶點，去重得到心肌缺血657 個靶點、腦缺血773 個靶點。腦心通、心肌缺血、腦缺血的3 個靶點集合取交集，得到腦心通“心腦同治”的122 個靶點，導入STRING數據庫構建PPI 網絡，cytoHubba 插件計算度值最高的前30 個靶點，進行KEGG 富集分析，篩選P值最小的前 30 條通路。得到白細胞介素-17（interleukin-17，IL-17）信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路4 條免疫炎癥相關通路，結合前期蛋白質組學研究，不論是腦缺血狀態，還是心肌缺血狀態，Toll 樣受體相關蛋白在大腦和心臟中發揮重要作用，因此，選擇Toll 受體信號通路上的相關蛋白作為大腦海馬中“心腦同治”的蛋白標志物。

圖5 腦心通膠囊“心腦同治”生物信息學分析的韋恩圖 (A)、PPI 網絡 (B)、核心靶點網絡 (C) 和KEGG 富集分析氣泡圖 (D)Fig.5 Venn diagram (A), PPI network (B), core target network (C) and KEGG enrichment bubble diagram (D) of “simultaneous treatment of heart and brain” bioinformatics analysis of Naoxintong Capsules

3.4 蛋白質組學篩選腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標志物

通過蛋白質組學研究腦心通組和模型組之間的差異表達蛋白，并對差異表達蛋白進行KEGG 富集分析，選擇富集分數最高的前20 個通路進行分析，結果見圖6。基于14 d LAD 模型，在心肌組織中共檢測到1 625 種蛋白質，腦心通組與模型組相比，共有116 個差異表達蛋白；在腦組織中檢測到2 966種蛋白質，腦心通組與模型組相比，共有138 個差異表達蛋白。在心肌缺血狀態下，腦心通膠囊干預心肌組織和腦組織共有的信號通路為NOD 樣受體信號通路、視黃酸誘導基因蛋白-I（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）樣受體信號途徑和Toll 樣受體信號通路。基于1 d MCAO 模型，在腦組織中共檢測到2 952 種蛋白質，腦心通組與模型組相比，共有134 個差異表達蛋白；在心肌組織中檢測到1 745 種蛋白質，腦心通組與模型組相比，共有217 個差異表達蛋白。在腦缺血狀態下，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路和Toll 樣受體信號通路是腦心通膠囊干預腦組織和心肌組織的常見信號通路。因此，腦心通膠囊干預心肌缺血和腦缺血大鼠的心肌組織和腦組織共有通路是Toll 樣受體信號通路。Toll 樣受體信號通路的關鍵靶點可以作為腦心通膠囊“心腦同治”的免疫和炎癥標志物。結合前期研究基礎，生物信息學預測以及蛋白質組學篩選，IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 為Toll 樣受體信號通路的關鍵靶點，具有成為“心腦同治”免疫和炎癥標志物的潛力。

圖6 腦心通膠囊治療LAD 和MCAO 大鼠的蛋白質組學結果 (n = 3)Fig.6 Proteomic results of Naoxintong Capsules in treatment of LAD and MCAO rats (n = 3)

3.5 qRT-PCR 檢測海馬中Toll 樣受體相關靶點的mRNA 表達水平

對IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 共8 個關鍵免疫和炎癥靶點進行qRT-PCR 分析。如表2 所示，與假手術組比較，模型組大鼠海馬IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9和TNF-α的mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01）；與模型組比較，腦心通組上述靶點的mRNA 表達量顯著降低（P＜0.05、0.01）。結果表明，腦心通膠囊顯著降低LAD 大鼠和MCAO大鼠的海馬中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9和TNF-α的mRNA 表達水平。

表2 心肌缺血和腦缺血大鼠的海馬中Toll 樣受體相關靶點的mRNA 表達水平 (±s, n = 3)Table 2 mRNA expression levels of Toll-like receptor related targets in hippocampus of rats with myocardial ischemia and cerebral ischemia (±s, n = 3)

表2 心肌缺血和腦缺血大鼠的海馬中Toll 樣受體相關靶點的mRNA 表達水平 (±s, n = 3)Table 2 mRNA expression levels of Toll-like receptor related targets in hippocampus of rats with myocardial ischemia and cerebral ischemia (±s, n = 3)

狀態 組別 劑量/(mg·kg?1)mRNA 相對表達量IFN-α IRF3 IRF7 TLR2 TLR4 TLR7 TLR9 TNF-α心肌缺血 假手術 — 1.00±0.10 1.00±0.06 1.00±0.03 1.00±0.04 1.02±0.24 1.00±0.08 1.00±0.09 1.00±0.04模型 — 36.12±8.85** 19.59±0.96** 9.17±0.48** 5.14±1.16** 6.36±0.52** 7.52±2.15** 13.29±0.63** 18.58±1.23**腦心通 110 20.31±0.98## 6.38±0.29## 2.47±0.26## 3.58±0.43# 2.83±0.22## 3.02±0.26## 2.76±0.26## 1.00±0.13##腦缺血 假手術 — 1.01±0.19 1.00±0.05 1.01±0.13 1.01±0.18 1.04±0.39 1.04±0.37 1.13±0.66 1.02±0.24模型 — 7.60±0.94** 1.79±0.58* 3.83±1.06** 3.16±0.49** 3.43±0.62** 3.03±1.21* 3.81±1.35* 4.40±0.04**腦心通 220 1.40±1.91## 0.60±0.17## 1.76±0.91# 1.73±0.11## 1.63±0.23## 1.42±0.11# 0.88±0.51## 3.05±0.71##

與假手術組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01。*P < 0.05 **P < 0.01 vs sham group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group.

3.6 Western blotting 檢測海馬中Toll 樣受體相關靶點的蛋白表達水平

基于生物信息學和前期研究，對8 個關鍵免疫蛋白進行Western blotting 分析。如圖7 所示，在心肌缺血狀態下，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。說明在心肌缺血狀態下，腦心通膠囊顯著回調大腦海馬中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 共8 個蛋白的表達。

圖7 心肌缺血大鼠海馬的Toll 樣受體相關蛋白表達量 (±s , n = 3)Fig.7 Toll-like receptor-associated protein expression levels in hippocampus of rats with myocardial ischemia (±s , n = 3)

如圖8 所示，在腦缺血狀態下，與假手術組比較，模型組大鼠海馬組織中IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、TNF-α 蛋白表達水平均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，腦心通組IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。說明在腦缺血狀態下，腦心通膠囊顯著回調大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 共4 個蛋白的表達。

圖8 腦缺血大鼠海馬的Toll 樣受體相關蛋白表達量 (±s, n = 3)Fig.8 Toll-like receptor-associated protein expression levels in hippocampus of rats with cerebral ischemia (±s , n = 3)

在心肌缺血和腦缺血2 種狀態下，IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 共4 個靶點的mRNA 和蛋白相對表達量顯著變化，表明大腦海馬中出現炎癥因子風暴和免疫反應瀑布，因此，大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 能夠作為“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標志物。

4 討論

隨著時間推移，全球居民心腦血管疾病的發病率不斷升高，心腦血管疾病成為影響健康和生命的危險因素，加重了全球疾病負擔[20]。臨床上，壓力會影響心臟病患者預后，說明心血管疾病中具備腦心聯系[21]。急性缺血性卒中患者會發生心腦串擾，涉及的腸道菌群失調和炎癥反應等機制已得到初步驗證[22]。依托大鼠的LAD 和MCAO 模型，本研究進行多時間點的“心腦互損”研究。心肌缺血損傷導致心電圖、心肌梗死體積的顯著變化，同時腦組織發生病理變化，含水率增加，證明心損及腦。腦缺血損傷導致腦梗死體積、神經功能評分、含水率顯著提高，同時心肌組織發生病理變化，心肌酶譜數據發生變化，證實腦損及心。目前，大多數藥理學研究均為單模型、單時間點研究，但臨床心腦疾病大多隨時間變化。本課題組前期研究顯示，在體內，心肌缺血14 d 和腦缺血1 d 被認為是心腦相互損傷的臨界時間點。LAD 模型大鼠腦損傷的時間點相對較晚，相比之下，MCAO 大鼠損傷心臟的時間更短。這表明“心腦互損”的嚴重程度受時間影響。

在心腦血管系統疾病中，炎癥和免疫不可或缺。本研究顯示，心肌缺血大鼠的大腦出現水腫，同時MCAO 大鼠的腦水腫率增加，其心肌組織也出現病理改變，表明LAD 和MCAO 大鼠產生免疫和炎癥反應。免疫炎癥反應參與動脈粥樣硬化、冠心病等多種心血管疾病，其中，心肌缺血可能涉及或平行于先天免疫反應的信號傳導[23-24]。急性心肌梗死引發局部炎癥組織反應和神經炎癥，決定患者預后。免疫激活可能使心臟和大腦功能障礙相互關聯，為“心腦同治”提供生物信號基礎[25]。中樞神經系統和免疫系統之間的交流位于神經免疫軸的核心。缺血性腦損傷會帶來神經炎癥，導致細胞死亡、心臟損傷。免疫介質是促炎的信號來源，促進多種炎癥細胞類型在受感染區域內的滲透。心肌梗塞、感染性心內膜炎都是心源性卒中的危險因素[26]。臨床上，較高水平的炎癥標志物與缺血性卒中后較差預后相關[27]。上述證據表明，心肌缺血和缺血性腦卒中伴有炎癥浸潤和免疫激活。此外，心臟和脾臟介導的免疫反應的炎癥細胞浸潤可能導致腦缺血誘導的急性和慢性心臟功能障礙和病理性心臟重塑[28]，進一步說明免疫反應介導腦出血后腦心相互作用。上述研究表明，免疫和炎癥在心腦血管相互損傷的機制中起著關鍵作用。

針對心腦血管疾病的防治，“心腦同治”、心-腦軸等理念被提出。在“心腦同治”理念指導下，腦心通應運而生。腦心通方中重用黃芪，補中益氣、利水消腫，為君藥。丹參歸心經，活血祛瘀，治療瘀血諸癥；當歸活血補血，破惡血而養新血；川芎為血中氣藥，活血行氣止痛，除卒急腫痛；桃仁、紅花活血止痛，除卒暴擊血；赤芍苦寒，清熱涼血、散瘀止痛，破凝滯之血、活血化瘀，共為臣藥。君臣相配，行氣行血，解卒中之氣滯血瘀。醋乳香、醋沒藥行氣活血、破血止痛；雞血藤舒筋活絡；桂枝溫通經脈、助陽化氣；蟲類藥地龍、全蝎、水蛭功活血化瘀、通經活絡，佐助活血化瘀通絡止痛。牛膝、桑枝為佐使藥，引藥入經，前者引藥下行，后者偏走于上。諸藥合用，對癥治療，上利頭目、中溫脾陽、下行血海，活血不留瘀、祛瘀不傷正。現代藥理學研究顯示，腦心通含有阿魏酸、丹酚酸B 等多種抗炎抗氧化藥效成分，對心臟[29]、大腦有多重保護作用，與腦心通減輕神經炎癥、細胞凋亡等作用相關[30-31]。藥效學結果顯示，不論是心肌缺血狀態，還是腦缺血狀態，腦心通膠囊均有效改善心肌缺血和腦缺血狀態下的“心腦互損”情況，驗證了腦心通保護心臟、大腦，改善“心腦互損”的藥效。腦心通膠囊能減少模型大鼠心、腦水腫和炎癥細胞浸潤，說明腦心通膠囊具有抗炎作用，與以往研究一致。另外，還發現在LAD 和MCAO 模型中，腦心通最佳給藥劑量不同。疾病的發生、發展和機制不同，藥物劑量受疾病的影響也不同。藥物在不同疾病的治療中達到最佳效果的劑量是不同的。而且藥物的劑量也會受到時間影響。LAD 和MCAO 模型時間不相同，也是影響給藥劑量的因素之一。所以，腦心通膠囊在心肌缺血和腦缺血的病理條件下使用劑量受到疾病和時間2 個因素的影響。劑量雖不一致，但藥理學指標顯示，在心肌缺血和腦缺血狀態下腦心通膠囊均達到“心腦同治”的效果。在不同的疾病狀態下選擇腦心通膠囊的最佳劑量，保證在心肌缺血或腦缺血下“心腦同治”效果最好。

為探索“心腦互損”“心腦同治”中免疫炎癥相關機制，本研究進行生物信息學研究篩選出IL-17信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路。結合蛋白質組學結果，Toll 樣受體信號通路是腦心通膠囊改善LAD 和MCAO 模型大鼠心臟和海馬損傷的關鍵通路。Toll 樣受體信號通路位于免疫和炎癥反應機制的上游。IFN-α、IRF3、IRF7、TLR2、TLR4、TLR7、TLR9 和TNF-α 是Toll樣受體信號通路的核心節點。因此，Toll 樣受體信號通路和Toll 樣受體相關靶點被選為免疫和炎癥研究的重點。作為參與宿主抵抗外界致病微生物入侵機體的第一道防線，Toll 樣受體在非感染性疾病中與體內相應的內源性配體結合可觸發免疫炎癥反應，以其在檢測和防御微生物病原體的先天免疫中的作用[32]。研究顯示，動脈粥樣硬化會激活Toll 樣受體，引發強烈的炎癥反應[33]。壞死細胞釋放的危險信號會激活先天免疫通路并引發強烈的炎癥反應，對心肌梗死后心臟修復至關重要[34]。調節TLR4介導的炎癥反應在腦缺血再灌注損傷中表現出潛在的神經保護作用[35]。

海馬體位于大腦丘腦和內側顳葉之間，主要負責短時記憶的存儲、轉換和定向等功能，與學習和記憶密切相關[36]。海馬不僅在神經系統中尤為重要，與心臟的關系也很密切。海馬體和基底神經節是心臟驟停復蘇后缺血性病理的前哨[37]。同時，海馬CA1 區神經元在腦缺血和再灌注損傷后容易死亡[38]。抑制microRNA-155 能夠緩解短暫性全身缺血后的神經功能障礙以及海馬中神經炎癥和氧化應激損傷[39]。也有研究證明腹側海馬結構異常與心衰大鼠的抑郁癥狀有關[40]。心臟驟停和心肺復蘇會損害海馬體，海馬體是下丘腦-垂體-腎上腺軸的重要組成部分，而該軸活動的改變會影響免疫功能[41]。心肌梗死引起的海馬損傷也有報道。心肌梗死誘導的焦慮樣行為與大鼠海馬的表觀遺傳學變化有關[42]。系統評價顯示，心力衰竭患者以及認知障礙或抑郁模型動物的海馬和額葉出現異常[43]。這些研究顯示，在心肌缺血和腦缺血中，海馬發生病理改變，改善海馬炎癥有助于疾病治療。

本研究首次運用全息醫學思維，以海馬為關鍵部位，觀測“心腦互損”的藥理變化。Western blotting結果顯示，與假手術組比較，大腦海馬中IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 表達量顯著增加，表明“心腦互損”狀態下大腦海馬中發生炎癥和免疫反應。腦心通膠囊干預后，海馬中這4 個靶點表達量顯著下降。由此說明，IFN-α、TLR4、TLR7、TNF-α 能夠作為海馬中“心腦互損”“心腦同治”的免疫和炎癥標志物。本研究通過體內實驗驗證心損及腦、腦損及心的病理變化，以及腦心通膠囊具有“心腦同治”的藥理作用，表明Toll 樣受體相關蛋白是“心腦互損”“心腦同治”的關鍵免疫蛋白，為“心腦同治”的深入研究提供依據和思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突