基于COI 條形碼的市售蟬蛻及其混淆品DNA 分子鑒定研究

張歡歡，徐金娣，周 靜，賈聰玲，吳啟南，郭夢(mèng)斐，沈紀(jì)晨，伍城穎，李松林*，毛 茜*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 中藥質(zhì)量研究室，江蘇 南京 210028

2.江蘇省中醫(yī)藥研究院/中國(guó)中醫(yī)科院江蘇分院 中藥代謝組研究室，江蘇 南京 210028

3.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

蟬蛻為黑蚱CryptotympanapustulataFabricius，若蟲羽化時(shí)蛻下的皮殼，是我國(guó)重要的蟲類動(dòng)物類藥材，在我國(guó)已有近兩千年的臨床應(yīng)用歷史[1-3]。具有疏散風(fēng)熱、利咽透疹、平喘等功效，臨床常用于風(fēng)熱感冒、咽痛音啞、咳喘等癥[4-6]。

蟬蛻不僅是醫(yī)院藥房常用的中藥材，也是眾多中藥制劑的重要原料，如蘇黃止咳膠囊、黃氏響聲丸、克感利咽口服液、開喉劍噴霧劑等經(jīng)典中成藥均以蟬蛻為原料。蟬蛻療效明確，臨床使用量逐年攀升。但蟬蛻為野生動(dòng)物資源，隨著森林覆蓋面積的減少，其法定基原動(dòng)物黑蚱的自然棲息地也日益縮減，使得蟬蛻藥材資源逐年減少，市場(chǎng)價(jià)格居高不下，各地藥材市場(chǎng)中也出現(xiàn)了較多蟬蛻混淆品和習(xí)用品。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和課題組前期對(duì)蟬蛻全國(guó)藥材市場(chǎng)的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前蟬蛻基原動(dòng)物除《中國(guó)藥典》規(guī)定的黑蚱外，華南蚱蟬、鳴蟬、蟪蛄等多種蟬的皮殼也作為蟬蛻藥用[7]。不同品種蟬蛻外觀性狀多相似，難以根據(jù)主觀經(jīng)驗(yàn)從性狀上進(jìn)行準(zhǔn)確辨別，且蟬蛻質(zhì)輕，易碎，經(jīng)采收、運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)后，皮殼因擠壓常出現(xiàn)破碎，難以鑒別。因此，對(duì)蟬蛻藥材及其混淆品進(jìn)行快速準(zhǔn)確地鑒定，將對(duì)保障蟬蛻質(zhì)量和臨床療效有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

DNA 條形碼技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA 片段來進(jìn)行物種鑒定的分子診斷技術(shù)，不依賴物種的形態(tài)特征和分類經(jīng)驗(yàn)[8-12]。2013 年，陳士林研究團(tuán)隊(duì)在前期大量研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建了以動(dòng)物細(xì)胞色素C 氧化酶I（cytochrome oxidase I，COI）序列為核心的動(dòng)物類藥材DNA 條形碼鑒定體系[13]。國(guó)家藥典委員會(huì)已經(jīng)將中藥材DNA 條形碼分子鑒定指南納入《中國(guó)藥典》增補(bǔ)本[14]，規(guī)定動(dòng)物類藥材的DNA條形碼鑒定以COI 序列為主[13-14]。COI 在能夠保證足夠變異的同時(shí)又很容易被通用引物擴(kuò)增，其DNA 序列本身很少存在插入和缺失[15]。目前，物種鑒定手段在動(dòng)物類藥材鑒定方面已有廣泛應(yīng)用[16-24]。但國(guó)內(nèi)尚未有運(yùn)用COI 序列鑒定蟬蛻及其混淆品的報(bào)道。

本研究利用COI序列對(duì)蟬蛻及其混淆品進(jìn)行鑒別研究，結(jié)合從Genbank 所得的序列分析藥材的正品與混淆品之間的遺傳距離、系統(tǒng)發(fā)育樹中物種的聚類情況，考察利用COI 序列鑒別蟬蛻與其混淆品的可行性，以期利用DNA 條形碼技術(shù)為準(zhǔn)確鑒定蟬蛻基原提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

2020 年6 月～2023 年7 月，從全國(guó)各地收集蟬蛻商品藥材及其混淆品28 批，從江蘇徐州沛縣黑蚱野生撫育基地、河南、山東等地自采藥材17 批，由江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林教授依據(jù)《中國(guó)藥典》[1]、《中國(guó)蟬科志》[2]和《中國(guó)藥用動(dòng)物志》[3]鑒定基原物種分別為黑蚱蟬蛻C.atrataFabricius.、震旦大馬蟬蛻MacrosemiapieliKato、南蚱蟬蛻C.holstiFabr.、陽(yáng)明山螗蟬蛻TannasozanensisKato。另從江蘇徐州沛縣黑蚱養(yǎng)殖基地收集不同樹種蟬卵樣品5 份，用于基原確認(rèn)及實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照。憑證樣本和數(shù)字影像信息保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥質(zhì)量和代謝組研究室，實(shí)驗(yàn)材料信息見表1、2。從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了相關(guān)的COI 序列共22 條，信息見表3。

表1 市售蟬蛻藥材信息Table 1 Information of commercial Cicadae Periostracum

表2 自采蟬蛻藥材信息Table 2 Information of self-harvested Cicadae Periostracum

表3 GenBank 下載的COI 基因序列信息Table 3 Information of COI gene sequences downloaded from GenBank

1.2 儀器

LEGEND MICRO21R 型高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo 公司）；ABI PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；DYY-6C 型瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；Gel Doc XR 型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；IKA-HB10 型水浴鍋（南京科爾儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試劑

瓊脂糖凝膠粉（擎科生物有限公司，TSINGKE TSJ001）；染料（翌圣生物有限公司，Yea Red Nucleic Acid Gel Stain 10000X in water）；聚合酶（Vazyme，2×Rapid Taq Master Mix）；引物（生工生物工程有限公司合成）；5 000 bp DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker（批號(hào)B500351，生工生物工程有限公司）；Zeup 柱式動(dòng)物基因組DNA 抽提試劑盒（批號(hào)B518251，生工生物工程有限公司），血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（批號(hào)DP304，天根生化科技有限公司）。

2 方法

2.1 蟬蛻基因組DNA 提取

取出蟬蛻樣品，依次用水、70%乙醇洗去附著的泥沙等雜質(zhì)，置于通風(fēng)櫥晾干后放入研缽，使用液氮快速進(jìn)行研磨，使組織充分破碎呈粉末狀，后續(xù)提取DNA 步驟按照基因組DNA 提取試劑盒提取各樣品總DNA，提取過程中蟬卵樣品水浴1 h，蟬蛻樣品較難裂解，水浴時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)至3～4 h。

2.2 COI 基因的PCR 擴(kuò)增

依據(jù)《中藥材DNA 條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》，采用 COI 通用引物（ LCOI490: 5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ 與 HCO2198: 5’-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ ） 和COI 序列藥典擴(kuò)增程序（94 ℃、1 min；94 ℃、1 min，45 ℃、5 min，72 ℃、1.5 min，5 個(gè)循環(huán)；94 ℃、1 min，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃、5 min）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。20 μL PCR 體系中包括PCR Master Mix 10 μL，引物L(fēng)COI490 與HCO2198 各0.8 μL（10 μmol/L），DNA 2 μL 以及無菌水6.4 μL。

2.3 瓊脂糖凝膠電泳及測(cè)序

用電子天平稱取0.5 g 瓊脂糖粉，置于裝有50 mL 1×TAE 溶液的錐形瓶中，用微波爐加熱至完全溶解，冷卻片刻后加入5 μL 染料，搖晃至充分混勻，倒入膠槽等待其完全冷卻凝固。取3 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和DNA Marker 在1%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，電泳儀電壓設(shè)置160 V，時(shí)間25 min。在凝膠成像系統(tǒng)中拍照并保存，以確定COI 目的序列被準(zhǔn)確擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序工作委托生工生物工程有限公司完成。本實(shí)驗(yàn)所得序列均已上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)見表4。

表4 黑蚱種內(nèi)變異位點(diǎn)情況Table 4 Intraspecific mutation sites in C.atrata

表4 樣品序列NCBI 登錄號(hào)Table 4 NCBI accession numbers of experimental sample sequences

2.4 序列數(shù)據(jù)的拼接及分析

利用DNAMAN 和SnapGene 軟件對(duì)測(cè)序所得序列及測(cè)序峰圖進(jìn)行檢查，校正及拼接，然后在NCBI 中運(yùn)用Blast 程序進(jìn)行相似性檢索，以確定基因片段的準(zhǔn)確性并進(jìn)行物種鑒定，保留相同長(zhǎng)度的同源序列用于后續(xù)遺傳分析。利用MEGA 11.0 和DnaSP6 軟件統(tǒng)計(jì)分析黑蚱種內(nèi)變異位點(diǎn)、堿基組成情況及蟬蛻相對(duì)于混淆品的標(biāo)志性位點(diǎn)。將確定的序列以及GenBank 下載的22 個(gè)蟬科（Cicadidae）物種的序列用MEGA 11.0 軟件基于ClustalW 算法進(jìn)行多序列比對(duì)，整理所得數(shù)據(jù)，分析序列類型，計(jì)算和分析種內(nèi)和種間的K2P 遺傳距離。選擇帶櫟角蟬Platycotisvittata作為發(fā)育樹的外類群，利用鄰接法（neighbor-joining method，NJ），選擇K2P 遺傳距離模型，同時(shí)采用Bootstrap 重復(fù)抽樣1 000 次用以檢驗(yàn)分子系統(tǒng)樹各分支的置信度，對(duì)所有序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

3 結(jié)果與分析

3.1 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

首先對(duì)從徐州黑蚱養(yǎng)殖基地不同樹種上隨機(jī)采集的5種蟬卵樣品進(jìn)行了DNA鑒定分析，蟬卵DNA提取質(zhì)量濃度較高，可達(dá)500～1 000 ng/μL，PCR 擴(kuò)增均可成功擴(kuò)增出目的條帶，不同樹種蟬卵均鑒定為黑蚱，確定了徐州養(yǎng)殖基地的蟬蛻原動(dòng)物品種為藥典規(guī)定基原品種黑蚱，見圖1。

圖1 蟬卵樣品形態(tài)及PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Morphological diagram of cicada eggs and the results of PCR amplification

后續(xù)使用蟬蛻樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以蟬卵樣品L3 作為陽(yáng)性對(duì)照。蟬蛻DNA 提取結(jié)果顯示（圖2），提取的蟬蛻樣品DNA 質(zhì)量濃度大多在20～40 ng/μL，擴(kuò)增后少部分樣品出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的現(xiàn)象，但總體上大多數(shù)樣品可成功擴(kuò)出目的條帶，將擴(kuò)增成功樣品送至生工公司測(cè)序，本實(shí)驗(yàn)共獲得蟬蛻樣品DNA 序列45 條。

圖2 各樣品PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Results of PCR amplification of each sample

3.2 黑蚱單倍型分析及標(biāo)志性位點(diǎn)分析

黑蚱的34 條種內(nèi)序列，其序列長(zhǎng)度為658 bp，所有位點(diǎn)中，A、G、C 和T 堿基平均含量分別為26%、16.7%、13.9%和43.4%，GC 含量為30.1%～30.8%，平均GC 含量為30.6%，A＋T 含量明顯高于G＋C 含量，表現(xiàn)為明顯的A＋T 堿基偏嗜，符合昆蟲線粒體基因堿基組成的基本特征[25]。序列分為11 個(gè)單倍型（A1～A11），A3 為主要單倍型，有16 個(gè)樣品。序列共638 個(gè)保守位點(diǎn)，20 個(gè)突變位點(diǎn)（15 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)，5 個(gè)單突變位點(diǎn)），其轉(zhuǎn)換/顛換值為5.67，變異位點(diǎn)詳細(xì)情況見表4。黑蚱單倍型多樣性（Hd）為0.761 1，核苷酸多樣性（Pi）為0.008 51，意味著本實(shí)驗(yàn)黑蚱種群是由多個(gè)地方種群混合而成的大而穩(wěn)定的群體（單倍型多樣性以0.5 為臨界值，核苷酸多樣性以0.005 為臨界值，二者的值越大，群體的多樣性程度越高）[20]。

對(duì)黑蚱的11 個(gè)單倍型序列以及混淆品序列進(jìn)行比對(duì)分析并篩選黑蚱序列的標(biāo)志性位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)出黑蚱的標(biāo)志性位點(diǎn)共有9 處，分別位于黑蚱序列的第136、157、169、312、322、352、424、514、532 bp 處，其中，在136 bp 與157 bp 處，黑蚱所有序列的堿基均為C，而混淆品序列的堿基均為T；在312 bp 處，黑蚱堿基為A，而混淆品序列堿基均為G。在這9 處位點(diǎn)中，黑蚱的所有單倍型序列一致并與所有混淆品序列不同，可考慮作為黑蚱的標(biāo)志性位點(diǎn)與其他混偽品區(qū)分，詳細(xì)位點(diǎn)信息見表5。

表5 黑蚱標(biāo)志性位點(diǎn)情況Table 5 Iconic sites in C.atrata

3.3 K2P 遺傳距離分析

基于K2P 雙參數(shù)模型的黑蚱種內(nèi)種間遺傳距離見表6，對(duì)不同種類蟬蛻樣本進(jìn)行分析，顯示種內(nèi)遺傳距離0～0.018 4，平均0.006 1，種間遺傳距離0.077 7～2 383，平均0.190 5，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的31.18 倍，種內(nèi)最大遺傳距離遠(yuǎn)小于種間最小遺傳距離，能形成一定的DNA 條形碼間隙。其中中華螓蟬和綠草蟬種間遺傳距離最大，為0.238 3，南蚱蟬和帶蚱蟬種間遺傳距離最小，為0.077 7，均大于Hebert 等[26]所推薦的物種鑒定最小種間距離0.020，顯示各自在分子水平已達(dá)到種級(jí)水平的分化。

表6 黑蚱及其混淆品種群內(nèi) (對(duì)角線值) 及種群間遺傳距離Table 6 Genetic distance within (diagonal value) and among populations of C.atrata and its adulterants

3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用NJ 法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3，從NJ 樹圖可以看出，10 種蟬類主要形成3 個(gè)類群，類群Ⅰ包括黑蚱（GP-1）、南蚱蟬（GP-3）、帶蚱蟬（GP-5）和中華螓蟬（GP-8），黑蚱與南蚱蟬和帶蚱蟬親緣關(guān)系較近，聚為一支，且進(jìn)化地位較高，位于進(jìn)化樹上部，置信度為99%，其中南蚱蟬和帶蚱蟬以78%的置信度聚為一亞支。類群II 包括蒙古寒蟬（GP-9）、松寒蟬（GP-6）、震旦大馬蟬（GP-2）和陽(yáng)明山螗蟬（GP-4），其中蒙古寒蟬與松寒蟬以高支持率（93%）聚為姐妹分支，顯示親緣關(guān)系較近。類群III 包括蟪蛄（GP-7）與綠草蟬（GP-10），其與黑蚱及其他幾種蟬類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。物種之間可明顯分開，可以清晰地區(qū)分黑蚱及其混淆品和近緣種，說明該段序列能夠作為黑蚱分子鑒定的依據(jù)。

圖3 基于COI 序列構(gòu)建的蟬蛻及其混淆品的NJ 樹Fig.3 NJ tree of C.atrata and its adulterants based on COI gene sequence

4 討論

近年來蟬蛻的臨床應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，但當(dāng)前蟬蛻品種混亂，《中國(guó)藥典》中僅有性狀描述，難以準(zhǔn)確鑒定。現(xiàn)有蟬蛻的鑒定研究局限于性狀、顯微鑒定，如牛躍華等[27]對(duì)浙江產(chǎn)蟬蛻和三種近緣種蟬蛻進(jìn)行了性狀比較研究，并系統(tǒng)地總結(jié)了性狀特征。苑冬敏等[28]以動(dòng)物藥殘留毛的顯微特征，如剛毛的直徑、長(zhǎng)度、毛窩直徑等參數(shù)為依據(jù)，對(duì)中藥蟬蛻及其易混淆品進(jìn)行了鑒別。郭利霄等[29]運(yùn)用3D景深合成技術(shù)，從蟬蛻樣品喙的長(zhǎng)短，上、下唇突出的程度及其上橫溝的顏色、足部主刺和側(cè)刺的數(shù)量等方面對(duì)50 批蟬蛻及其混淆品樣品進(jìn)行鑒別。傳統(tǒng)性狀鑒定方法依賴主觀經(jīng)驗(yàn)，對(duì)鑒定人的專業(yè)素質(zhì)要求較高，且培養(yǎng)周期長(zhǎng)；顯微鑒定在近緣種動(dòng)物藥材鑒定上存在一定局限性。因此，基于COI條形碼的DNA 分子鑒定技術(shù)以其準(zhǔn)確、快速鑒定物種的特點(diǎn)，在眾多動(dòng)物類藥材與其混偽品的鑒別研究中，如蛇蛻、梅花鹿皮、穿山甲、龜甲，展現(xiàn)出了優(yōu)良的鑒定能力。但國(guó)內(nèi)尚未有運(yùn)用COI 序列鑒定蟬蛻與其混淆品的相關(guān)報(bào)道。

蟬蛻采收后需干燥保存，且藥材多附著泥沙等雜質(zhì)，存儲(chǔ)過程中表面易發(fā)生蟲蛀或霉變，導(dǎo)致提取的DNA 濃度較低，提取困難。獲取高質(zhì)量DNA是DNA 分子鑒定的基礎(chǔ)[30]。劉旭朝等[31]通過對(duì)動(dòng)物藥材DNA 提取方法進(jìn)行優(yōu)化，使用優(yōu)化的裂解液配方，實(shí)現(xiàn)了對(duì)蟬蛻等提取困難樣本DNA 的提取。但本研究發(fā)現(xiàn)，使用SDS 法自配試劑提取DNA有一定的局限性，比如在用乙醇洗滌DNA 沉淀時(shí)，由于蟬蛻DNA 含量較低，常常看不到沉淀產(chǎn)生或者沉淀較少，在吸去液體時(shí)容易造成DNA 損耗，使得提取DNA 效率很低。為得到優(yōu)良的DNA 模板，本研究反復(fù)實(shí)驗(yàn)及優(yōu)化調(diào)整，發(fā)現(xiàn)提取DNA 時(shí)應(yīng)選擇無蟲蛀、無霉變的藥材；并對(duì)蟬蛻進(jìn)行樣品前處理，依次用水、75%的乙醇清洗表面，盡量去除泥沙等雜質(zhì)；研磨應(yīng)迅速、充分，研磨的越細(xì)越有利于消化；取樣量適當(dāng)（20～30 mg，不宜過多或過少）；水浴時(shí)間延長(zhǎng)至3 h 及以上，使細(xì)胞充分裂解釋放DNA；將原有試劑盒中洗滌的操作重復(fù)1次，可更好去除蛋白質(zhì)。

本研究運(yùn)用COI 通用引物，優(yōu)化DNA 提取過程，成功擴(kuò)增出45 批蟬蛻正品及混淆品COI 條形碼序列。K2P 遺傳距離分析表明黑蚱種間平均遺傳距離是種內(nèi)的31.18 倍，種內(nèi)最大遺傳距離遠(yuǎn)小于種間最小遺傳距離，能形成一定的DNA 條形碼間隙。NJ 樹結(jié)果表明黑蚱及其他幾種蟬類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，物種之間可明顯分開，表明COI 序列針對(duì)黑蚱和混淆品的區(qū)分有效。由此可見，基于COI 序列的DNA 條形碼技術(shù)能高效、準(zhǔn)確地鑒別中藥材蟬蛻及其混淆品，可有效保障蟬蛻藥材質(zhì)量及其臨床有效性。在NJ 樹結(jié)果分析中還發(fā)現(xiàn)，黑蚱聚為一類，其中大部分江蘇產(chǎn)地的黑蚱樣品序列在同一亞支，河南、山東等產(chǎn)地的黑蚱樣品序列分別聚在另一亞支，呈現(xiàn)了依產(chǎn)地聚類的趨勢(shì)，表明黑蚱的不同地理種群可能存在差異性。后續(xù)將繼續(xù)收集各產(chǎn)地的樣本，進(jìn)一步對(duì)黑蚱的遺傳多樣性進(jìn)行分析研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突