火麻葉中大麻二酚提取工藝的響應(yīng)面法優(yōu)化及不同部位含量分布

張一寧,于志琪,屈施旭,劉同歌,張玉紅

東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040

火麻(CannabissativaL.)又名漢麻、線麻等,是桑科(Moraceae)大麻屬(Cannabis)一年生草本植物。火麻中的主要活性成分是大麻素,目前從大麻屬植物中分離得到的天然大麻素有110余種,其中四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)、大麻二酚(cannabidiol,CBD)(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)是大麻中2種主要的大麻素活性成分[1]。研究表明CBD具有抗氧化活性[2]、鎮(zhèn)靜[3]、抗抑郁[4]、抗癌[5]、治療肥胖[6]、抗炎特性[7]以及舒張血管等潛在作用[8],并且無(wú)致幻及成癮的作用,已是臨床治療乳腺癌、癲癇的新型藥物[9]。目前,在全球很多國(guó)家和地區(qū),大麻二酚已經(jīng)陸續(xù)被批準(zhǔn)作為藥用以及食品中使用[10,11]。

圖1 四氫大麻酚和大麻二酚分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structure of THC and CBD

天然的CBD是左旋結(jié)構(gòu),而化學(xué)合成的CBD則通常是左旋和右旋結(jié)構(gòu)兩種異構(gòu)體的1∶1混合物,由于二者的性質(zhì)非常接近,分離十分困難。化學(xué)合成步驟繁瑣,不能有效生產(chǎn)特定結(jié)構(gòu)的生物活性化合物,且成本較高[12],所以從天然植物中提取仍是獲得大麻二酚的最經(jīng)濟(jì)來(lái)源。

目前,從火麻中提取大麻二酚主要還是以浸提和熱回流為主[13],對(duì)于CBD的檢測(cè)方法仍存在耗時(shí)長(zhǎng),效率低等問(wèn)題;而且提取效率低,穩(wěn)定性差,含量低等難題也亟待攻克。本文選用超聲輔助提取方法的重復(fù)性較好,此方法較索氏提取的方法更加簡(jiǎn)單,便于操作。隨著火麻種植合法化規(guī)模的不斷擴(kuò)大,對(duì)CBD的研究也不斷深入,人們對(duì)CBD有效性和安全性的理解大大增加,CBD也將會(huì)更好地造福人類(lèi)。

本文以火麻葉為研究對(duì)象,建立了簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的HPLC檢測(cè)方法,此方法大麻二酚出峰時(shí)間快,效果好,流動(dòng)相配比簡(jiǎn)單;利用超聲輔助提取方法獲得天然大麻二酚,探討不同因素對(duì)提取含量的影響,運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取CBD的條件,從而提高了大麻二酚的得率,具有很高的應(yīng)用價(jià)值。并研究了大慶火麻各部位中CBD的含量,為火麻提取CBD和大麻的綜合利用提供理論依據(jù),促進(jìn)火麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用火麻干燥葉子,2020年10月,采自東北林業(yè)大學(xué)種植基地,經(jīng)植物分類(lèi)學(xué)鄭寶江教授鑒定為火麻。該火麻T(mén)HC含量<0.3%,符合國(guó)家使用規(guī)定。將采集的火麻葉在60 ℃下烘干、粉碎,過(guò)40目篩后存放于東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 HPLC檢測(cè)方法建立

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液母液的配制

精密稱取的CBD標(biāo)品8.0 μg,甲醇為溶劑,配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液母液濃度80 μg/mL。

1.2.1.2 高效液相色譜條件

色譜柱:Agilent HC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:28 ℃;流動(dòng)相:甲醇-水(90∶10);進(jìn)樣量:10 μL;洗脫方式:等度洗脫。

1.2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取母液配制成濃度為0.8、1.6、4.0、8.0、40.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,按“1.3.1.2”條件,進(jìn)行HPLC檢測(cè),以峰面積Y為縱坐標(biāo),CBD濃度C為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,呈線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=51.969C+19.396,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6,R2接近于1,表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線在CBD濃度在10～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液母液0.2、0.5、1.0 mL,依次用甲醇定容成10 mL,配制成濃度分別為1.6 、4.0和8.0 μg/mL三個(gè)濃度的大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別重復(fù)測(cè)定其峰面積值5次,記錄大麻二酚的峰面積。

1.2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照上述“1.3.2.1”中方法制備溶液,分別在0、2、4、8、10、12、24 h,進(jìn)樣10 μL測(cè)定,記錄大麻二酚的峰面積,計(jì)算得到大麻二酚峰面積的RSD。

1.2.2.3 重復(fù)試驗(yàn)

取10份火麻葉各1.0 g,按照兩種不同的提取條件,分別平行操作制備5組樣品,第一組在超聲提取功率320 W,提取溫度30 ℃,料液比1∶15(g/mL)的條件下提取25 min得到第一份提取液;第二組在超聲提取功率320 W,提取溫度30 ℃,料液比1∶20的條件下提取30 min得到第二份提取液。分別進(jìn)樣10 μL,依次測(cè)定峰面積值。

1.2.2.4 加樣回收率試驗(yàn)

精確量取6份已知濃度(7.086 μg/mL)的大麻二酚提取液10 mL分成3組,分別加入濃度為4.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0和3.0 mL,測(cè)定其峰面積值,分別計(jì)算出加樣回收率。

1.2.3 樣品制備

取火麻干燥葉子粉末1.0 g,按照料液比加入不同量的提取溶劑,設(shè)置不同的超聲條件提取。將提取液冷卻至室溫后進(jìn)行過(guò)濾,將過(guò)濾后的提取液進(jìn)行真空旋蒸回收旋蒸提取溶劑,再用甲醇溶劑定容至1.0 mL,12 000 r/min離心20 min,吸取上清液,過(guò)0.45 μm微孔濾膜,所得濾液按上述液相條件進(jìn)行大麻二酚HPLC含量測(cè)定。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取火麻葉1.0 g,采取控制單一變量法,設(shè)置梯度提取時(shí)間為10、15、20、25和30 min;提取溫度為50、60、70、80和90 ℃;料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20和1∶25(g/mL);提取功率280、300、320、340和360 W。以提取時(shí)間25 min,提取溫度80 ℃,料液比為1∶20 g/mL,提取功率320 W為基本條件,CBD含量作為指標(biāo),研究單因素條件對(duì)CBD提取的影響。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為進(jìn)一步研究因素之間的相互作用,選取提取功率(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、和提取料液比(D)作為實(shí)驗(yàn)因素,以火麻葉中CBD的含量作為響應(yīng)值(Y)。根據(jù)Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),生成4因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),共有29組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。使用Microsoft Excel軟件整理數(shù)據(jù)整理,利用SPSS 18.0軟件分析數(shù)據(jù),采用One-way ANOVA方法進(jìn)行方差分析,用Microsoft Excel及Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻二酚HPLC檢測(cè)方法

2.1.1 大麻二酚色譜圖

按“1.3.1”中方法,將CBD標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行HPLC檢測(cè),得到色譜圖見(jiàn)圖2。如圖,大麻二酚出峰時(shí)間較快,7～8 min時(shí)間內(nèi)出峰,簡(jiǎn)單高效,分離效果優(yōu),目標(biāo)峰兩邊沒(méi)有其他峰干擾,而且峰型較好,可以方便快捷地檢測(cè)火麻中大麻二酚含量。

圖2 大麻二酚標(biāo)準(zhǔn)品(a)和樣品(b)色譜圖Fig.2 Chromatograms ofCBD standard (a) and sample (b)

2.1.2 方法學(xué)考察

2.1.2.1 精密度考察

計(jì)算得到大麻二酚峰面積的RSD分別為1.3%、1.2%和0.47%,表明該方法精密度良好。

2.1.2.2 穩(wěn)定性考察

計(jì)算得到大麻二酚峰面積的RSD分別為1.64%、0.62%和0.52%,表明標(biāo)準(zhǔn)品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.2.3 重復(fù)性考察

計(jì)算得到其RSD分別為2.47%和3.58%(n=5),表明該方法的重復(fù)性較好。

2.1.2.4 加樣回收實(shí)驗(yàn)

分別計(jì)算出加樣回收率,其平均值為97.49%,RSD為0.45%,表明方法準(zhǔn)確度可靠。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1. 提取時(shí)間

提取時(shí)間直接影響到植物中有效成分的提取效率,提取時(shí)間過(guò)短,植物中的有效成分不能提取完全且造成原料浪費(fèi);提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致提取物有效成分發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)上的破壞,還會(huì)造成時(shí)間和能量的浪費(fèi)。如圖3所示,本研究通過(guò)對(duì)火麻葉中大麻二酚含量隨提取時(shí)間變化研究,結(jié)果表明:提取時(shí)間從15～25 min,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),大麻二酚的提取含量快速升高;當(dāng)提取25 min以后,隨提取時(shí)間的增加,大麻二酚的含量雖有稍量增加,但增加的量很少,經(jīng)方差分析,差異不顯著(P>0.05)。隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)細(xì)胞壁的破壞就越大,大麻二酚的溶出就越多,一定時(shí)間后,溶液體系會(huì)達(dá)到平衡。超聲時(shí)間越長(zhǎng),超聲的熱效應(yīng)開(kāi)始發(fā)揮作用,但這種熱效應(yīng)有限。因此,選擇25 min作為最佳超聲提取時(shí)間。

圖3 不同時(shí)間下大麻二酚的含量Fig.3 Content of CBD at different times

2.2.2 提取溫度

如圖4所示,隨著提取溫度的升高大麻二酚的含量先上升后下降;當(dāng)溫度為80 ℃時(shí),大麻二酚含量達(dá)到最大值,并且與其它溫度下的大麻二酚的含量呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。這是由于酚類(lèi)物質(zhì)具有熱敏感性,溫度升高能夠提升酚類(lèi)物質(zhì)的溶解性和擴(kuò)散速度,但也會(huì)導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)加速分解與氧化,80 ℃可能是大麻二酚上述關(guān)系的一個(gè)平衡溫度,提取溫度在80 ℃之前,前者占主導(dǎo)作用,而超過(guò)80 ℃,后者占優(yōu)勢(shì)。故選擇80 ℃作為最佳單因素提取溫度。

圖4 不同提取溫度下大麻二酚的含量Fig.4 Content of CBD at different extraction temperatures

2.2.3 料液比

為提高提取率和節(jié)省提取溶劑,研究了料液比對(duì)大麻二酚提取含量的影響,結(jié)果如圖5所示,大麻二酚的提取含量隨料液比的增加而增大。當(dāng)料液比在1∶20(g/mL)以后時(shí),大麻二酚的提取量雖有少量增加,但方差分析顯示差異不顯著(P>0.05)。考慮到溶劑損耗、濃縮時(shí)間等后續(xù)工藝成本等問(wèn)題,確定料液比為1∶20(g/mL)為最佳提取料液比。

圖5 不同料液比下大麻二酚的含量Fig.5 Content of CBD under different solid-liquid ratios

2.2.4 提取功率

結(jié)果如圖6所示,隨著提取功率的增大,提取得到的大麻二酚的含量也增大,當(dāng)功率為320 W時(shí),大麻二酚的含量最大。此后,隨著提取功率的增加,大麻二酚的含量降低。可能是低超聲功率產(chǎn)生的空化效應(yīng)不足以破壞大麻葉的植物細(xì)胞的細(xì)胞壁,隨著提取功率的增大,大麻葉細(xì)胞的細(xì)胞壁被破壞得也越大。但功率過(guò)大可能會(huì)導(dǎo)致大麻二酚的降解,導(dǎo)致含量降低。因此選擇320 W作為最佳超聲功率。

圖6 不同提取功率下大麻二酚含量Fig.6 CBD content under different extraction power

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 模型建立

火麻葉中大麻二酚的提取時(shí)間、提取溫度、料液比和提取功率4個(gè)主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化,以大麻二酚含量為指標(biāo),結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-expert V11軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,以火麻葉子中大麻二酚含量(Y)為響應(yīng)值,對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合,得到以響應(yīng)值為目標(biāo)函數(shù)的二次多元回歸方程:Y=72.35+2.15A+4.94B+5.62C+7.39D-9.41AB-0.86AC-7.16AD+4.57BC-0.58BD+3.11CD-3.96A2-28.49B2-14.83C2-12.73D2。

表3 回歸方程的方差分析

2.3.2 各因素與交互因素作用分析

各因素的F值可以反映出對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的顯著程度,F值越大,P值越小,意味著對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響越大,系數(shù)更顯著。從表3的方差分析結(jié)果可以看出,幾個(gè)因素對(duì)火麻葉中的大麻二酚提取含量的影響程度順序:料液比(D)>提取時(shí)間(C)>提取溫度(B)>提取功率(A);以提取功率與提取溫度AB的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著(P<0.05),其它幾組交互作用對(duì)結(jié)果影響不顯著(P>0.05)。

根據(jù)上述回歸方程,利用響應(yīng)面法獲得了提取因素與CBD含量之間關(guān)系的三維曲面圖。從圖7中可以看出提取功率、提取溫度、提取時(shí)間和料液比及其相互作用對(duì)CBD提取含量的影響。等高線輪廓的形態(tài)也可以反映出各因素之間交互作用對(duì)響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱情況,等高線的形狀為橢圓表示這2個(gè)因素之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響強(qiáng)烈,圓形則代表各因素之間的交互作用不顯著。如圖7所示,在交互作用對(duì)CBD提取含量的影響中,BD對(duì)CBD含量影響最小,AC與其相似,其次是CD和BC,提取功率×提取溫度AB、AD對(duì)CBD的提取含量影響較大,這也與表3中回歸方程的方差分析所得到的結(jié)果是一致的。二項(xiàng)式B2、C2和D2的P值均<0.01,說(shuō)明它們對(duì)火麻葉中CBD的提取的含量有著顯著的影響。A2的P值>0.05,表明影響不顯著。

圖7 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface diagram of interaction of each factor

2.3.3 最佳工藝驗(yàn)證

利用Design-expert V 11軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,通過(guò)數(shù)據(jù)分析得到超聲提取火麻葉中大麻二酚的最優(yōu)的提取條件為:提取功率307.72 W,提取溫度81.54 ℃,提取時(shí)間26.33 min,料液比1∶22.03(g/mL),在此條件下,大麻二酚的提取量為74.63±0.72 mg/g。考慮到實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)際性,將提取條件校正為:提取功率320 W,溫度81 ℃,時(shí)間26 min,料液比1∶22(g/mL)。平行實(shí)驗(yàn)三次,得到大麻二酚含量的平均值為79.53±0.26 mg/g(CV為2.58%),結(jié)果與理論值方差分析,差異不顯著(P<0.05),表明回歸方程可以較好地預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及模型的可靠性。

2.4 火麻不同部位大麻二酚含量檢測(cè)

利用所獲得的最優(yōu)提取條件,對(duì)來(lái)自黑龍江大慶火麻栽培品種的根、莖、嫩葉(植株最頂端往下2～4片葉片)、老葉(植株中部以下葉片)、種子等不同部位中的大麻二酚含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表4所示,幼嫩葉片中的大麻二酚含量最高為87.32±0.24 mg/g,其余部位大麻二酚含量以老葉、種子、莖和根依次降低。

表4 不同部位大麻二酚含量

3 討論與結(jié)論

本研究以火麻葉為實(shí)驗(yàn)材料,采用Agilent HC-C18柱,建立了一種簡(jiǎn)單、快速?gòu)幕鹇槿~中大麻二酚的HPLC檢測(cè)方法,該方法靈敏度高、簡(jiǎn)便易行,結(jié)果準(zhǔn)確可靠。與Chen等[14]建立的液相方法大麻二酚在9 min后出峰相比,此液相方法的出峰時(shí)間更快在7～8 min,分離效果優(yōu)、峰型理想;與Xie等[15]建立液相方法的加樣回收率為91.2%～97.6%(RSD為3.0%)相比,本研究建立的液相方法平均加樣回收率為97.49%(RSD為0.45%),此方法穩(wěn)定性好、重復(fù)性更好,可以高效地檢測(cè)火麻中大麻二酚含量,適用于大麻二酚的定量分析,同時(shí)也為評(píng)價(jià)火麻的質(zhì)量提供了可靠保證。

在單因素的基礎(chǔ)上,基于Box-Behnken Design響應(yīng)面法得到了從火麻葉中超聲輔助提取大麻二酚的最佳工藝條件:以甲醇為提取溶劑,料液比為1∶22(g/mL),提取功率為320 W,提取溫度為81 ℃,提取時(shí)間為26 min,在此條件下,大麻二酚含量為79.53±0.26 mg/g。與Yan等[16]的研究相比,對(duì)于超聲提取的條件,包括提取功率、提取料液比和提取溫度進(jìn)行進(jìn)一步的具體研究,對(duì)超聲輔助提取火麻中的大麻二酚條件進(jìn)行明確和補(bǔ)充。與Hao等[17]研究用熱回流技術(shù)提取大麻二酚的提取3次2 h/次相比較,在提取得到相同量的大麻二酚條件下,本研究中的方法,所需的時(shí)間更短,對(duì)溶劑的耗費(fèi)量也更少;與Gao等[18]的研究相比,提取的時(shí)間更短,在最佳工藝的條件下,大麻二酚的提取量也更多。本試驗(yàn)所得最佳提取工藝條件在一定程度上縮短提取時(shí)間,避免長(zhǎng)時(shí)間提取對(duì)活性成分的影響,提高了大麻二酚的提取量和提取效率。

采用本研究所建立的高效液相方法測(cè)定了黑龍江大慶火麻栽培品種各部位的大麻二酚含量為嫩葉中最高,其次依次為整株葉片、老葉、種子和莖,根中的大麻二酚含量最低。研究結(jié)果可為火麻中大麻二酚提取和火麻高附加值產(chǎn)品進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供數(shù)據(jù)。