擬境栽培下兩種附生方式金釵石斛化學(xué)組成和根內(nèi)生菌比較及相關(guān)性研究

周昌慶,王 鵬,丁海燕,陳 林,陳鴻平,王 福,胡 媛,劉友平

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,成都 611137

石斛藥用首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為上品[1],歷史悠久。“金釵石斛”一名始出于宋代《本草衍義》[2],金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科石斛屬附生草本植物,是歷版《中國藥典》收載的石斛入藥品種之一,《本草綱目》載其“叢生石上。其莖葉生皆青色,干則黃色,開紅花。處處有之,以蜀中者為勝”[3]。《本草經(jīng)集注》載:“(石斛)生石上,細(xì)實(shí)…生櫟樹上者,名木斛…至虛長,不入丸散,惟可為酒漬煮湯用爾”。[4]《本草圖經(jīng)》載:“(石斛)唯生石上者勝。亦有生櫟木上者,名木斛,不堪用”。[5]《本草蒙筌》亦載:“石斛有效難尋,木斛無功易得。”可見歷代本草記載“石斛”優(yōu)于“木斛”。

現(xiàn)代研究表明金釵石斛的活性成分包括生物堿、黃酮、多糖、聯(lián)芐類及其衍生物[6,7],具有保護(hù)胃黏膜和神經(jīng)元、抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[6,8]。金釵石斛因自然狀態(tài)下繁殖率低、生長緩慢且對(duì)生境要求嚴(yán)苛,加上人類的過度采挖和對(duì)生境的破壞野生資源匱乏[9],人工栽培如大棚栽培、林下擬境栽培技術(shù)應(yīng)用于金釵石斛極大程度上改善了其資源匱乏的問題,其中模擬藥用植物野生生境的擬境栽培技術(shù)應(yīng)用于金釵石斛,體現(xiàn)了藥材生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的協(xié)調(diào)發(fā)展,附石、附樹為主要栽培模式[10]。已有研究從活性成分含量、產(chǎn)量等方面綜合評(píng)價(jià)了附石金釵石斛品質(zhì)優(yōu)于附木栽培[11,12]。且本課題組前期也報(bào)道了附石金釵石斛生物堿和黃酮類次生代謝產(chǎn)物相對(duì)含量高于附木,附石抗氧化活性高于附木[7]。

根內(nèi)生菌與藥材品質(zhì)、植物生長方式密切相關(guān),其中菌根真菌是蘭科植物典型的菌根結(jié)構(gòu),菌根共生關(guān)系伴隨植物的整個(gè)生活史[13]。栽培方式是影響根系微生物和藥材品質(zhì)的重要因素,如鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌組成和分布受不同栽培方式和組織部位的影響[14],內(nèi)生菌還可顯著提高石斛屬植物的抗逆性并促進(jìn)植物的生長、次生代謝產(chǎn)物的積累[15]。課題組前期對(duì)石質(zhì)和木質(zhì)兩類附生基質(zhì)金釵石斛根際微生物研究發(fā)現(xiàn),附石金釵石斛根際真菌群落物種相對(duì)豐度較高,優(yōu)勢(shì)菌屬更為明顯,提示附生基質(zhì)是影響金釵石斛根際微生物的關(guān)鍵因素[16]。然而,目前未見研究從根內(nèi)生菌層面報(bào)道不同附生基質(zhì)金釵石斛的差異性。

因此,本研究運(yùn)用16S和ITS技術(shù)對(duì)擬境栽培下附石(stone epiphytic cultivation,SE)和附木(tree epiphytic cultivation,TE)金釵石斛根內(nèi)生菌進(jìn)行測(cè)序,并初步分析根內(nèi)生菌與石斛堿、總生物堿、總黃酮和總多糖成分的相關(guān)性,研究兩種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌的多樣性和差異性,探索不同附生方式金釵石斛中富集的根內(nèi)生菌與次生代謝產(chǎn)物的積累規(guī)律,為金釵石斛根內(nèi)生菌-次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ),為石斛“生石上者勝”提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用金釵石斛樣本均于2022年11月采自貴州省遵義赤水市天臺(tái)鎮(zhèn)赤水信天斛滿堂有限公司擬境栽培種植基地,選取正常生長且無病蟲害的新鮮植株。Z字形取樣,分別選取SE和TE兩種附生方式長勢(shì)一致的5株金釵石斛全株。在無菌環(huán)境下剪取根樣本混合均勻,裝入無菌管中液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰箱中保存,用于高通量測(cè)序。選取二年生莖,60 ℃下烘干粉碎保存用于含量測(cè)定。樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系嚴(yán)鑄云教授鑒定為金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.),樣品信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

NovaSeq 6000 測(cè)序儀(美國Illumina公司);Agilent 7890A氣相色譜儀(上海隱智科學(xué)儀器有限公司);U-T1800型雙光束紫外可見分光光度計(jì)(上海屹譜儀器制造有限公司);Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(批號(hào):M0531S,美國NEB公司);Universal DNA 產(chǎn)物純化回收試劑盒(批號(hào):DP214,北京天根生化科技有限公司);Next?Ultra DNA Library Prep Kit(批號(hào):E7370L,美國NEB公司);石斛堿(批號(hào)wkq23022211,純度:98%)、萘(批號(hào)wkq22070607,純度:98%)、蘆丁(批號(hào)wkq20090201,純度:98%)、D-無水葡萄糖(批號(hào)wkq21011805,純度:98%)(維克奇生物科技有限公司);甲醇、乙醇、無水乙醇、苯酚、硫酸、氨水、二氯甲烷、鄰苯二甲酸氫鉀、溴甲酚綠、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁(分析純,成都市科龍化工試劑廠);超純水(自制)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 根內(nèi)生菌16S和ITS高通量測(cè)序及分析

使用無菌水將金釵石斛根系表面沖洗干凈并擦干,剪取干凈樣品采用CTAB法提取樣品總DNA,使用帶Barcode的特異引物對(duì)細(xì)菌和真菌的多樣性進(jìn)行鑒定,細(xì)菌16S V4 區(qū)引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),真菌ITS1區(qū)引物為ITS5-1737F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT6GC-3′),再對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行混樣和純化,使用建庫試劑盒構(gòu)建文庫,文庫合格以后使用Illumina公司的NovaSeq 6000測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2 總生物堿含量測(cè)定

采用紫外-可見分光光度法以石斛堿為對(duì)照品,按Li等[17]方法制備供試品,根據(jù)Ao等[18]方法進(jìn)行顯色,于621 nm下測(cè)定兩種附生方式金釵石斛中總生物堿含量。

1.3.3 總黃酮含量測(cè)定

采用紫外-分光光度法以蘆丁為對(duì)照品,按照Li等[19]方法制備供試品并顯色,于510 nm下測(cè)定兩種附生方式金釵石斛中總黃酮含量。

1.3.4 總多糖含量測(cè)定

采用紫外-可見分光光度法以D-葡萄糖為對(duì)照品,按Ao等[18]方法制備供試品并顯色,于490 nm下測(cè)定兩種附生方式金釵石斛中總多糖含量。

1.3.5 石斛堿含量測(cè)定

照《中華人民共和國藥典》(2020年版一部)[20]石斛項(xiàng)下金釵石斛中石斛堿含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)Illumina NovaSeq測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行拼接、過濾以及嵌合體過濾,對(duì)得到的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags)根據(jù)97%序列相似性原則進(jìn)行OTU(Operational Taxonomic Units)聚類分析,然后對(duì)OTU序列進(jìn)行物種注釋,基于注釋結(jié)果做物種豐富度、Alpha Diversity 、Beta Diversity 以及主成分分析[16]。

采用Microsoft Excel 16軟件 TB-tools v1.120軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和圖標(biāo)繪制,含量用平均值±均值表示,采用IBM SPSS Statistics 26統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行顯著性分析和相關(guān)性分析,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 根內(nèi)生菌群落的Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指數(shù)可用于評(píng)估樣本內(nèi)微生物群落的多樣性,是反映物種豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)[21],對(duì)不同樣本在97%一致性閾值下的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。Chao1指數(shù)表征物種的豐富度,數(shù)值越大,表示物種越豐富;Shannon指數(shù)表征群落的多樣性和物種分布的均勻度,數(shù)值越大,群落多樣性越高,物種分布越均勻。金釵石斛根內(nèi)生菌群落Alpha多樣性結(jié)果見表2。所有樣本覆蓋度達(dá)到99%以上,表明絕大部分微生物的序列均可以被測(cè)出,測(cè)序結(jié)果可有效反映樣本中微生物群落的真實(shí)情況。表2結(jié)果顯示,SE根內(nèi)真菌物種豐富度和多樣性優(yōu)于TE,根內(nèi)細(xì)菌Chao1指數(shù)顯著高于TE(P<0.05),表明SE根內(nèi)生菌物種豐富度較高,物種分布相對(duì)集中,SE栽培有利于提高金釵石斛根內(nèi)生菌群落豐富度及其結(jié)構(gòu)的多樣性。

表2 金釵石斛根內(nèi)生菌群落Alpha多樣性指數(shù)

2.2 根內(nèi)生菌群落的主成分分析

使用PCA分析2種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌群落組成的差異性。SE和TE分別聚為一類,說明基質(zhì)不同金釵石斛根內(nèi)細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)整體有差異,細(xì)菌主成分分析結(jié)果顯示PC1和PC2分別解釋39.03%和22.36%的信息(見圖1A),真菌主成分分析結(jié)果顯示PC1和PC2分別解釋35.87%和21.94%的信息(見圖1B),兩大主成分之和均大于55%;2種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌群落相對(duì)分散程度不同,SE金釵石斛根內(nèi)細(xì)菌和真菌群落相對(duì)較為集中(見圖1B)。

圖1 金釵石斛根內(nèi)細(xì)菌(A)和真菌(B)主成分分析Fig.1 PCA analysis of bacteria (A)and fungi (B) in the roots of D.nobile

2.3 根內(nèi)生菌群落組成分析

2.3.1 根內(nèi)真菌群落組成分析

通過ITS高通量測(cè)序得到的序列數(shù)據(jù),進(jìn)行Alpha多樣性分析與主成分分析,基于OUTs分析結(jié)果,共得到11個(gè)門,40個(gè)綱,109個(gè)目,246個(gè)科,451個(gè)屬。在門水平,SE和TE優(yōu)勢(shì)真菌高度相似,主要為子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota),二者相對(duì)豐度總占比均超過95%,SE相對(duì)豐度從高到低分別為58.51%、37.30%;TE相對(duì)豐度從高到低分別為68.39%、29.36%(見圖2A)。

圖2 金釵石斛根內(nèi)真菌門水平(A)和屬水平(B)分布圖Fig.2 Distribution of fungi in the roots of D.nobile at the level of phylum (A) and genus (B)

在屬水平,按相對(duì)豐度高于1%篩選優(yōu)勢(shì)菌屬,SE中優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)較為集中。SE相對(duì)豐度高于1%的屬有6個(gè),包括4個(gè)已知屬和2個(gè)未知屬。未知屬分別為unidentified_Basidiomycota_sp(24.79%)、unidentified_Capnodiales_sp(16.78%);已知屬分別為枝孢屬(Cladosporium)(9.15%)、鐮刀菌屬(Fusarium)(8.24%)、殼三毛孢屬(Robillarda)(6.59%)、柱孢屬(Cylindrocarpon)(2.52%)。TE有9個(gè),其中7個(gè)已知屬2個(gè)未知屬,未知屬分別為unidentified_Capnodiales_sp(4.44%)、unidentified_Basidiomycota_sp(1.05%);已知屬分別為Cladophialophora(10.41%)、枝孢屬(Cladosporium)(10.11%)、布勒擲孢酵母屬(Bullera)(9.74%)、杯梗孢屬(Cyphellophora)(8.27%)、木霉屬(Trichoderma)(7.93%)、柱孢屬(Cylindrocarpon)(5.67%)、鐮刀菌屬(Fusarium)(1.27%)(見圖2B)。

2.3.2 根內(nèi)細(xì)菌群落組成

通過16S rRNA高通量測(cè)序得到序列數(shù)據(jù),運(yùn)用OUT分析、Alpha多樣性分析與主成分分析可知細(xì)菌在不同附生方式中的分布規(guī)律。基于OUTs分析結(jié)果,共得到26個(gè)門,48個(gè)綱,98個(gè)目,194個(gè)科,349個(gè)屬。

在門水平,SE中優(yōu)勢(shì)菌門有7個(gè),分別為放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、粘菌門(Myxococcota)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi),相對(duì)豐度從高到低依次為42.77%、27.19%、16.11%、3.48%、2.06%、1.46%、1.18%;TE優(yōu)勢(shì)菌門有5個(gè),分別為放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota),其相對(duì)豐度從高到低依次為32.21%、29.15%、22.41%、9.41%、3.77%(見圖3A)。

圖3 金釵石斛根內(nèi)細(xì)菌門水平(A)和屬水平(B)分布圖Fig.3 Distribution of bacteria in the roots of D.nobile at the level of phylum (A) and genus (B)

在屬水平,SE中優(yōu)勢(shì)菌屬更為豐富。SE相對(duì)豐度高于1%的菌屬有8個(gè),均為已知屬,分別為分枝桿菌屬(Mycobacterium)(6.73%)、諾卡菌屬(Nocardioides)(4.77%)、放線孢菌屬(Actinomycetospora)(3.82%)、Jatrophihabitans(3.50%)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(3.09%)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)(2.90%)、圓錐桿菌屬(Conexibacter)(2.45%)、羊膜桿菌屬(Amnibacterium)(1.35%);TE有7個(gè),均為已知屬,分別為圓錐桿菌屬(Conexibacter)(7.54%)、放線孢菌屬(Actinomycetospora)(4.95%)、熱酸菌屬(Acidothermus)(4.54%)、Jatrophihabitans(4.08%)、苔蘚桿菌屬(Bryobacter)(3.71%)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)(3.64%)、羊膜桿菌屬(Amnibacterium)(1.10%)(見圖3B)。

優(yōu)勢(shì)真菌包括子囊菌門、擔(dān)子菌門、枝孢屬、鐮刀菌屬等與文獻(xiàn)報(bào)道一致[22];厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌屬、芽孢桿菌屬、放線孢菌屬等同樣在相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌[23],說明上述內(nèi)生菌與石斛屬植物的生長發(fā)育關(guān)系密切。

2.4 根內(nèi)生菌差異菌群分析

通過LEfSe(LDA Effect Size)分析比較SE和TE兩種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌差異菌群,LDA Score 預(yù)設(shè)值為4.0用于篩選具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的優(yōu)勢(shì)菌群。LDA值分布柱狀圖長度代表差異物種的影響大小,進(jìn)化分支圖中紅色節(jié)點(diǎn)表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群,綠色節(jié)點(diǎn)表示在綠色組別中起到重要作用的微生物類群。

圖4結(jié)果顯示,SE中起影響作用較大的差異真菌有2個(gè)目(假球殼目:Pleosporales、炭角菌目:Xylariales),2個(gè)屬(鐮刀菌屬:Fusarium;殼三毛孢屬:Robillarda)。差異細(xì)菌有1個(gè)目(丙酸桿菌目:Propionibacteriales),2個(gè)科(黃色桿菌科:Xanthobacteraceae;叢毛單胞菌科:Comamonadaceae),5個(gè)屬(芽孢桿菌屬:Bacillus;諾卡菌屬:Nocardioides;慢性根瘤菌屬:Bradyrhizobium;假諾卡氏菌屬:Pseudonocardia;根瘤桿菌屬:Rhizobacter)。

圖4 金釵石斛根內(nèi)細(xì)菌(A、B)和真菌(C、D)LDA值分布柱狀圖和進(jìn)化分支圖Fig.4 Histogram of LDA value distribution and evolutionary branching diagram of bacteria(A,B) and fungi(C,D) in the roots of D.nobile

TE中起主要作用的差異真菌有1個(gè)綱(散囊菌綱:Eurotiomycetes),2個(gè)目(刺盾炱目:Chaetothyriales;銀耳目:Tremellales),2個(gè)屬(Cladophialophora;木霉屬:Trichoderma)。差異細(xì)菌有2個(gè)目(酸桿菌目:Acidobacteriales;擬桿菌目:Bacteroidales),1個(gè)科(醋酸菌科:Acetobacteraceae),7個(gè)屬(圓錐桿菌屬:Conexibacter;異枝藻屬:Allobranchiibius;Ralstonia;熱酸菌屬:Acidothermus;Jatrophihabitans;鏈?zhǔn)人峋鷮?Streptacidiphilus;苔蘚桿菌屬:Bryobacter)。

2.5 含量測(cè)定

兩種附生方式金釵石斛化學(xué)成分含量測(cè)定結(jié)果見表3,結(jié)果顯示,兩種附生方式金釵石斛中石斛堿、總生物堿、總黃酮和總多糖含量存在顯著差異。兩種附生方式金釵石斛中石斛堿含量均符合《中國藥典》規(guī)定,且SE含量高于TE;SE金釵石斛總生物堿、總黃酮含量高于TE,總多糖含量低于TE,均具有顯著性差異(P<0.05)。

表3 兩種附生方式金釵石斛化學(xué)成分含量

2.6 相關(guān)性分析

對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)真菌、優(yōu)勢(shì)細(xì)菌和差異菌群的相對(duì)豐度與化學(xué)成分含量進(jìn)行斯皮爾曼相關(guān)性分析,結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示,SE基質(zhì)中富集的殼三毛孢屬真菌相對(duì)豐度與總黃酮含量、炭角菌目真菌相對(duì)豐度與石斛堿含量顯著正相關(guān),而TE基質(zhì)中富集的Cladophialophora真菌與石斛堿含量、銀耳目真菌與總生物堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

對(duì)于細(xì)菌類群,SE基質(zhì)中富集的假諾卡氏菌屬、根瘤桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度與石斛堿含量顯著正相關(guān),諾卡菌屬、假諾卡氏菌屬、黃色桿菌科相對(duì)豐度與總生物堿含量顯著正相關(guān),諾卡菌屬、芽孢桿菌屬、叢毛單胞菌科、根瘤桿菌屬相對(duì)豐度與總黃酮含量顯著正相關(guān),芽孢桿菌屬、假諾卡氏菌屬、叢毛單胞菌科、根瘤桿菌屬相對(duì)豐度與總多糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)。而TE基質(zhì)中富集的熱酸菌屬、擬桿菌目、異枝藻屬、鏈?zhǔn)人峋鷮倥c石斛堿含量呈顯著負(fù)相關(guān);擬桿菌目、異枝藻屬相對(duì)豐度與總生物堿顯著負(fù)相關(guān);圓錐桿菌屬、熱酸菌屬、苔蘚桿菌屬、酸桿菌目、擬桿菌目、醋酸菌科、異枝藻屬相對(duì)豐度與總黃酮含量顯著負(fù)相關(guān);酸桿菌目、擬桿菌目、異枝藻屬、鏈?zhǔn)人峋鷮傧鄬?duì)豐度與總多糖含量顯著正相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

本文首次分析了擬境栽培下SE和TE兩種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌的多樣性和差異性,并首次與主要化學(xué)成分含量相關(guān)聯(lián),研究結(jié)果顯示兩種附生方式金釵石斛根內(nèi)生菌富集情況存在差異,根內(nèi)生菌的相對(duì)豐度與化學(xué)成分含量具有相關(guān)性。

藥用植物根系微生物在植物獲取營養(yǎng)成分、抗環(huán)境脅迫和抗病蟲害等方面有重要作用。本研究結(jié)果中的優(yōu)勢(shì)真菌均以子囊菌門和擔(dān)子菌門為主,優(yōu)勢(shì)細(xì)菌以放線菌門、變形菌門、藍(lán)藻門、酸桿菌門為主,另外,SE還包括厚壁菌門、粘菌門和綠彎菌門,TE還包括擬桿菌門。已有研究表明,隸屬于厚壁菌門下的芽孢桿菌屬、變形菌門下的根瘤桿菌屬和慢性根瘤菌屬、放線菌門下的放線孢菌屬為常見固氮細(xì)菌,可通過固定環(huán)境中的氮元素以達(dá)到促生作用,是影響石斛屬植物吸收轉(zhuǎn)化營養(yǎng)元素的關(guān)鍵因素[24-26]。SE優(yōu)勢(shì)殼三毛孢屬真菌和芽孢桿菌屬細(xì)菌可促進(jìn)有利于蘭科植物生長的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[27,28]。鐮刀菌屬真菌作為致病菌,在SE中相對(duì)豐度高于TE,是造成SE金釵石斛植物患病的原因之一,另外柱孢屬真菌、Ralstonia細(xì)菌在TE中富集,易導(dǎo)致金釵石斛植物患根腐病[29,30],這與木質(zhì)基質(zhì)易于吸收水分、不透氣、易發(fā)霉等特性有關(guān)。

藥用植物內(nèi)生菌與藥材質(zhì)量的形成密切相關(guān),目前已有文獻(xiàn)報(bào)道活性成分與內(nèi)生菌具有顯著相關(guān)性[31],對(duì)于揭示植物內(nèi)環(huán)境因子對(duì)藥材品質(zhì)的影響、道地藥材形成的機(jī)制具有重大意義,目前尚未有研究對(duì)金釵石斛根內(nèi)生菌與活性成分的相關(guān)性做報(bào)道。石斛堿為金釵石斛的特征性成分,《中國藥典》2020年版一部對(duì)金釵石斛的石斛堿含量做了相關(guān)規(guī)定,不得低于0.4%,研究結(jié)果顯示兩種附生方式金釵石斛中石斛堿含量均符合規(guī)定,且SE高于TE,總生物堿、總黃酮含量高于TE,而總多糖含量低于TE。將篩選出的優(yōu)勢(shì)菌群及關(guān)鍵物種與活性成分含量進(jìn)行相關(guān)性分析,首次發(fā)現(xiàn)了SE中富集的假諾卡氏菌屬、根瘤桿菌屬細(xì)菌相對(duì)豐度與石斛堿含量顯著正相關(guān);TE中富集的熱酸菌屬、異枝藻屬、鏈?zhǔn)人峋鷮倥c石斛堿含量呈顯著負(fù)相關(guān),其中的根瘤桿菌屬細(xì)菌為SE優(yōu)勢(shì)有益菌,推測(cè)SE基質(zhì)易于富集促進(jìn)石斛堿產(chǎn)生和積累的優(yōu)勢(shì)群落。研究還發(fā)現(xiàn)SE中富集的群落與總生物堿、總黃酮含量顯著正相關(guān),與多糖顯著負(fù)相關(guān);TE與總生物堿、總黃酮含量顯著負(fù)相關(guān),與多糖顯著正相關(guān),內(nèi)生菌一方面可直接參與藥用植物代謝產(chǎn)物的合成,一方面可誘導(dǎo)其產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物[32],因此,SE中富集的內(nèi)生菌群有利于石斛堿、生物堿類、黃酮類成分的積累,TE則有利于多糖的積累,從而達(dá)到促進(jìn)金釵石斛植物生長、提升藥材品質(zhì)的作用。

擬境栽培技術(shù)可提高藥用植物自身免疫力和抵抗環(huán)境脅迫的能力[33]。藥材內(nèi)生菌群落與石斛屬植物生長發(fā)育密切相關(guān),金釵石斛為特殊的附生菌根植物,附生基質(zhì)是植物吸收營養(yǎng)和水分的重要介質(zhì),植物根系微生物與生長發(fā)育受基質(zhì)類型的影響[34];石質(zhì)較木質(zhì)基質(zhì)營養(yǎng)、水分等條件更為貧瘠,因此SE金釵石斛中根內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群更為豐富,石質(zhì)基質(zhì)更易于富集固氮、促生以及促進(jìn)代謝產(chǎn)物積累的內(nèi)生菌群落,提升了藥材品質(zhì),為金釵石斛“基質(zhì)-根內(nèi)生菌-植物生長”相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ),為石斛“生石上者勝”提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí),已有研究發(fā)現(xiàn)石斛屬植物根內(nèi)生菌能促進(jìn)植株對(duì)基質(zhì)中元素的吸收[13],且基質(zhì)礦質(zhì)元素含量與藥效成分含量存在一定的相關(guān)性[35],對(duì)于SE和TE基質(zhì)礦質(zhì)元素含量與石斛屬植物生長發(fā)育、次生代謝產(chǎn)物的積累及根內(nèi)生菌將有待做進(jìn)一步的研究。