基于炮制前后質量一致性的清半夏炮制新工藝評價

顏雨豪,殷莉麗,黎 智,蔣孟蓮,楊轉珍,萬子玉,賴月月,李 敏

成都中醫藥大學 藥學院/現代中藥產業學院 省部共建西南特色中藥資源國家重點實驗室,成都611137

半夏(Pinellia Rhizoma,PR)為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖,具有燥濕化痰,降逆止嘔,消痞散結的功效[1],為臨床常用中藥之一。清半夏(Pinelliae Rhizoma Praeparatum cum Alumine,PRPA)是半夏經白礬浸泡或煮制所得的炮制飲片,相較生半夏增強了祛寒痰的功效[2]。二者的質量傳遞關系可概括為:生半夏炮制后,游離有機酸含量增加,總糖、總生物堿及部分核苷、蛋白含量降低[3,4]。而有機酸、核苷中單一成分的變化卻少有報道,對半夏、清半夏主要成分的變化規律也缺乏系統性分析。

清半夏的制法較為固定,2015年版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)中的清半夏采用8%白礬溶液浸泡制得,2020年版《中國藥典》則在此基礎上增加了煮制清半夏。但目前除了白礬浸泡、白礬煮制方法可制作清半夏飲片外,還有公司嘗試使用白礬蒸法以改進清半夏飲片的制作流程。

高溫蒸制法以工藝可控、省時省工且對毒性藥材有較好的減毒效果等優點,作為新興的炮制工藝而受到青睞[5,6]。據考證,半夏歷代炮制方法中尚未見到蒸法的記載[7],目前已有部分學者對半夏蒸法炮制進行了研究。Mo[8]、Li[9]等建立了一種穩定的高壓蒸制半夏的炮制工藝;Xiao[10]使用蒸法炮制得到清半夏,相較于浸制清半夏,其總有機酸含量有所增加,草酸鈣針晶的含量顯著降低,且白礬限量均符合藥典標準。但蒸法仍有較多問題還需解答,如蒸法所得清半夏的質量穩定性,蒸法所得清半夏的藥效,蒸法所得清半夏與浸、煮清半夏的質量一致性等。

本研究將不同產地的半夏藥材分別按浸法、煮法及蒸法炮制為清半夏飲片,使用團隊前期建立的含量測定方法,從浸出物、有機酸、多糖、核苷和蛋白等方面分析生半夏與清半夏的質量傳遞關系,并探究蒸法與浸法、煮法所得清半夏在質量上的一致性,為清半夏的藥效機制及解毒機制的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

A580型紫外可見分光光度計(翱藝儀器有限公司),1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司),SpectraMax iD3型酶標儀(美谷分子儀器有限公司),植物總蛋白提取試劑盒(北京酷來搏科技有限公司,批號1401005),總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所,批號X12011)。

十二水合硫酸鋁鉀(白礬,成都金山化學試劑有限公司);草酸、L-蘋果酸、枸櫞酸、富馬酸、次黃嘌呤、腺嘌呤、尿苷、腺苷、肌苷、鳥苷、尿嘧啶(中國食品藥品檢定研究院,批號分別為101097-201101、190014-201302、111679-200401、111541-201102、140661-201704、110886-201102、110887-201803、110879-201703、140669-201606、111977-201501、100469-201302,純度均≥98%);胞苷、D-無水葡萄糖、琥珀酸、順式烏頭酸、反式烏頭酸(四川維克奇生物科技有限公司,批號分別為wkq19011101、wkq16082202、wkq16081104、wkq-05072、wkq-03269,純度均≥98%);胸苷(西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司,批號BCBSZ979V,純度≥99%)。水為超純水,甲醇、乙腈、磷酸為色譜純,其余試劑均為分析純。

半夏藥材12批,產自山西、甘肅、貴州等7個省份,經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥塊莖。藥材來源信息見表1。

表1 半夏藥材來源信息

1.2 藥材加工

半夏、清半夏實驗編號見表2。清半夏F01～F12均按2020年版《中國藥典》中白礬浸法進行炮制[11]:取凈半夏,大小分開,用8%白礬溶液浸泡至內無干心,口嘗微有麻舌感,取出,洗凈,切厚片,干燥。每100 kg凈半夏,用白礬20 kg。清半夏C01～C06按北京市中藥飲片炮制規范中的白礬煮法進行炮制:取生半夏,大小分開,浸漂,每日換水2～3次,至起白沫時(約7 d),換水后加白礬(每100 kg凈半夏,加白礬8 kg)溶化,再泡7 d,用水洗凈,取出置不銹鋼鍋內,加入剩余的白礬,先用武火,后用文火煮約3 h,至內無白心為度,加入少量水,取出,晾至7成干,再悶約3 d,切薄片,陰干。每100 kg凈半夏,用白礬12.5 kg。清半夏E07～E12按飲片公司提供的清半夏炮制試驗方法進行炮制:取凈半夏,大小分開,以8%白礬溶液浸泡半夏,每天翻動半夏1～2次,浸泡至內無干心后取出,蒸制2～3 h,以內無白心為度,取出,略收水后切片,低溫干燥。每100 kg凈半夏,用白礬20 kg。計算各法所得清半夏飲片得率,采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

表2 半夏及對應清半夏樣品信息

1.3 浸出物測定

按照2020年版《中國藥典》四部通則2201項下水溶性浸出物測定法冷浸法進行測定。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

1.4 有機酸含量測定

參考課題組前期建立的方法,采用高效液相色譜法(HPLC)同時測定半夏中草酸、L-蘋果酸、枸櫞酸、琥珀酸、富馬酸、順式烏頭酸、反式烏頭酸等7種有機酸的含量[12]。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

1.5 多糖含量測定

以D-無水葡萄糖作為標準對照品,參考蒽酮-硫酸法測定生半夏和炮制品總多糖的含量[13]。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

1.6 核苷類成分含量測定

參考課題組前期建立的HPLC方法,同時測定半夏中胞苷、腺嘌呤、尿嘧啶、次黃嘌呤、尿苷、腺苷、鳥苷、肌苷、胸苷9種核苷的含量[14]。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

1.7 蛋白質的測定

參考植物總蛋白提取試劑盒說明書提取半夏總蛋白,使用BCA微板法蛋白質定量測定試劑盒測定半夏蛋白含量。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

1.8 半夏炮制前后質量指標綜合比較

綜合上述質量相關檢測指標,取各制法的均值,使用Origin 2022軟件對結果進行統計。使用SPSS 22.0軟件對測得數據進行Z-score標準化,再使用SIMCA 14.1軟件進行正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA),建立各指標與樣品類別之間的關系模型。此外,使用了Origin 2022軟件對生半夏的質量指標進行Pearson相關性分析。

1.9 三種炮制品的主成分分析

使用SPSS 22.0軟件進行主成分分析,因指標原數值的量級差異大,故對數據進行Z-score標準化處理后,以浸出物(ZX1)、6種有機酸(ZX2～ZX7)、多糖(ZX8)、9種核苷(ZX9～ZX17)以及蛋白(ZX18)的含量標準值為變量,對炮制后的半夏進行主成分分析,其中琥珀酸因無法檢出,故舍去該指標。巴特利特球形度檢驗得到顯著性為P<0.001,證明數據適用于主成分分析。

1.10 三種炮制品安全性指標檢測

按照2020年版《中國藥典》一部清半夏項下白礬限量檢測方法進行測定。采用SPSS 22.0軟件對結果進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 不同方法清半夏飲片得率

統計結果見表3,三種炮制方法均較穩定,其內部差異較小。浸法、蒸法、煮法的飲片得率依次為74.01%、70.76%、63.28%,浸法得率顯著高于其他方法,但與蒸法得率差距較小,煮法得率最低。

表3 清半夏飲片得率

究其原因,根據清半夏外觀(見圖1)可將其分為浸制清半夏和蒸、煮制清半夏兩類,這兩類炮制品的質地分別為粉性、角質。粉性清半夏在切片時更易保持完整,而角質清半夏更易破碎,這與各方法的得率相對應。半夏中含有大量淀粉,據藥典描述,浸、煮制清半夏的主要差異為煮制中含有糊化淀粉粒,故推測蒸制中同樣含有糊化淀粉粒[15],而角質化可能與淀粉粒的糊化相關。本研究所用煮法的高溫制備時間較蒸法長,可能導致其炮制品的角質化現象更為明顯,致使其得率最低。

圖1 半夏及三種炮制品飲片圖Fig.1 Decoction pieces of PR and three processed products graphs

2.2 炮制前后浸出物的變化

半夏經浸、煮法炮制為清半夏后,浸出物呈下降趨勢,其中煮法浸出物損失略高于浸法,但蒸法卻不減反增。統計結果顯示,半夏藥材和浸制、煮制、蒸制清半夏的浸出物平均值分別為12.28%、10.35%、9.89%、40.02%。浸出物變化率見表4,同一組生半夏,經浸法或煮法炮制為清半夏后,其浸出物較生品分別降低了24.10%和28.28%,但生品、浸法、煮法浸出物無顯著差異。另一組半夏分別采用浸法和蒸法炮制,浸法浸出物較生品降低了10.68%,而蒸法卻增加了264.76%,與其他制法均呈顯著差異(P<0.01)。同時,由變異系數可知,蒸法較浸法、煮法相對更為穩定。

表4 浸出物變化率

因半夏、清半夏均為檢測水溶性浸出物,故其含量變化可能與炮制過程有直接聯系。本研究所用煮法與浸法比較,浸泡時間更長,浸出物損失量也更多。而蒸法與浸法的差異在于浸泡結束后的蒸制步驟,水蒸氣的高溫可破壞藥材細胞結構,有助于內含物的提取,從而使浸出物含量增加。

2.3 炮制前后有機酸含量的變化

有機酸測定結果見表5、表6,HPLC圖譜見圖2。半夏炮制后草酸含量均顯著提高(P<0.05),其余有機酸含量大幅降低,且檢出率也隨之降低,其中琥珀酸均未檢出。浸制、煮制、蒸制炮制品的草酸含量均值增加了0.501 7%、0.537 8%、0.807 3%,其總酸含量均值分別增加了0.267 0%、0.237 0%、0.573 6%,草酸占總酸的比例也從8.53%提高至88.36%左右。由此可知,經三種方法炮制過后,草酸以外的有機酸含量減少,而草酸含量大幅上升,使總酸含量隨之增加。

圖2 混合對照品與樣品的有機酸HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of organic acids in mixed control and sample

表5 七種有機酸平均含量

表6 不同炮制品的有機酸含量變化率

比較不同炮制方法可知,蒸法炮制后草酸和總有機酸含量均顯著高于浸法及煮法(P<0.01),其含量變化率也更為穩定。盡管浸、煮法的總酸含量差異無統計學意義,但煮法對草酸以外的有機酸損失更大,其含量變化率也更不穩定。

2.4 炮制前后多糖含量的變化

統計結果顯示,半夏藥材和浸制、煮制、蒸制炮制品的多糖平均含量分別為16.93%、33.54%、33.48%、56.79%。多糖含量變化率見表7,同一組生半夏,經浸制、煮制法炮制為清半夏后,其多糖含量均顯著提高(P<0.05);另一組半夏經浸制、蒸制法炮制后,多糖含量較生品分別提高了128.83%和327.52%。可見不論何種炮制方法,均會導致多糖含量增加。

表7 多糖含量變化率

有學者認為多糖因在炮制過程中引入物料而增加[3],但并未深入探究,明礬如何使多糖含量增加尚無定論。據文獻報道,多糖類成分在高溫或酸性條件下可由高聚物降解為低分子量多糖[18],如海參硫酸多糖[19]、地錦草多糖[20]等均有相關研究,這提示了炮制過后多糖含量上升的原因:白礬溶液常溫下呈酸性,pH值在3.0～3.5左右,且炮制過程中有高溫處理步驟,以上因素均可促使半夏中高分子量多糖水解為更多的低分子多糖。如半夏中存在著大量的淀粉粒,在酸性條件下可發生水解,生成較小的糖類分子[21],淀粉分子結構遭到破壞,使部分直鏈淀粉溶出[15]。基于硫酸-蒽酮法的原理,與蒽酮反應的分子越多,該法測定得出的多糖含量也就越多。Zhang[22]等研究結果發現,半夏炮制為清半夏后,其還原糖含量大幅增加,這也提示增加的總多糖可能與半夏淀粉等多糖類成分降解相關,并且溶出多糖的增多亦可能是浸出物增加的一個原因。

比較不同炮制方法可知,浸法與煮法的多糖含量差異無統計學意義,而蒸法明顯高于二者(P<0.05)。統計各批次炮制后的含量變化率,由其變異系數可知,蒸法較浸法、煮法相對更為穩定。

2.5 炮制前后核苷類成分含量的變化

核苷測定結果見表8、表9,HPLC圖譜見圖3。半夏經炮制后,除蒸制炮制品的次黃嘌呤、鳥苷外,其余核苷含量均明顯降低(P<0.05)。核苷類成分為具有廣泛生理活性的一類水溶性成分,在炮制過程中易流失,還可能因炮制過程中加入白礬等輔料使糖苷鍵斷裂而分解[3],該結論與本研究結果也較為一致。然而次黃嘌呤、鳥苷的含量較低,對蒸法所得炮制品的核苷總量影響小,故三種炮制品的核苷總量差異仍無統計學意義,但蒸法的含量變化率相較之下更為穩定。

圖3 混合對照品與樣品的核苷HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of nucleosides in mixed control and sample

表8 九種核苷平均含量

表9 不同炮制品的核苷含量變化率

2.6 炮制前后蛋白含量的變化

統計結果顯示,半夏藥材和浸制、煮制、蒸制炮制品的蛋白質平均含量分別為69.68%、23.87%、8.72%、18.89%。蛋白含量變化率見表10,由表可知半夏炮制后蛋白質發生降解,總蛋白含量顯著降低(P<0.01)。炮制過程中的高溫及白礬溶液因素,為蛋白發生變性與水解的主要原因[23]。

表10 蛋白質含量變化率

比較同組不同制法的蛋白含量,可知煮法相較于浸法,蛋白的損失更大,而蒸法介于二者之間,與浸制、煮制法的含量差異無統計學意義。由變化率可知,浸、蒸法的含量變化率更為穩定,煮法的變化率波動更大。

2.7 炮制前后質量指標綜合比較

由圖4可知,半夏炮制過后內在質量成分的含量呈增加趨勢,其中蒸制清半夏在浸出物和多糖含量上增長最為顯著,而核苷含量盡管下降,因其自身含量過低,相較之下變化幅度可忽略。

圖4 半夏炮制前后各成分含量均值比較Fig.4 Comparison of the mean component contents before and after PR processing

OPLS-DA分析結果見圖5,該模型將樣品分成生半夏、蒸制清半夏、浸制和煮制清半夏三類。生半夏來自多個產地,其內部差異較大,且與炮制品有著明顯的差異。浸制清半夏與煮制清半夏的質量一致性較好,但其組內差異相對較大。而半夏在蒸制過后與其余炮制品存在較大差異,其內部差異較浸制法更小,但在浸出物、多糖等含量較高的成分方面,其變化量的絕對數值仍遠高于其他炮制方法。

圖5 半夏炮制前后OPLS-DA分析結果Fig.5 OPLS-DA analysis results before and after processing of PR

相關性結果如圖6所示,顏色越深,相關性越大。可知浸出物與有機酸中占比最高的枸櫞酸、L-蘋果酸以及蛋白呈顯著正相關,但與2015版《中國藥典》中半夏的含量指標琥珀酸呈顯著負相關;有機酸類成分中,草酸、反式烏頭酸與其他有機酸多呈正相關;含量最高的多糖與大部分成分均呈負相關,但并不顯著;核苷類成分與有機酸相關性較高,其中尿苷、肌苷與枸櫞酸、草酸均有較高的相關性,核苷類成分之間的相關性也較強,其中腺嘌呤與多數核苷呈負相關。

圖6 生半夏成分相關性Fig.6 Correlation of raw PR components

2.8 三種炮制品的主成分分析

主成分分析結果顯示,可從18個變量中提取5個主成分,成分矩陣及方差百分比見表11。得到的5個主成分的累計方差百分比為83.003%,涵蓋了原數據絕大部分的內容。第一主成分中胞苷、枸櫞酸、尿苷的正向影響最大,第二主成分中次黃嘌呤、浸出物的正面影響最大,第三主成分中尿嘧啶、順式烏頭酸的正面影響最大,第四、第五主成分中正向影響最大的分別為尿嘧啶以及富馬酸,隨后根據表11中各載荷值計算主成分得分。首先計算主成分系數,主成分系數=主成分載荷值/各主成分對應特征值開平方根,代入表中數值,再將主成分系數與指標標準值相乘,得到如下公式:

表11 清半夏質量指標主成分分析

Y1=0.175*ZX1+0.171*ZX2+0.175*ZX3+0.358*ZX4+0.08*ZX5+0.229*ZX6+0.288*ZX7+0.067*ZX8+0.361*ZX9+0.328*ZX10-0.11*ZX11-0.01*ZX12+0.357*ZX13+0.007*ZX14+0.177*ZX15+0.085*ZX16+0.347*ZX17+0.314*ZX18

Y2=0.395*ZX1+0.312*ZX2-0.099*ZX3-0.043*ZX4-0.152*ZX5-0.238*ZX6-0.18*ZX7-0.345*ZX8+0.119*ZX9-0.094*ZX10-0.1*ZX11+0.422*ZX12-0.027*ZX13+0.047*ZX14+0.367*ZX15-0.349*ZX16+0.093*ZX17-0.157*ZX18

Y3=-0.027*ZX1-0.046*ZX2-0.286*ZX3+0.02*ZX4+0.213*ZX5+0.323*ZX6+0.343*ZX7-0.104*ZX8+0.002*ZX9-0.243*ZX10+0.406*ZX11+0.243*ZX12+0.097*ZX13-0.519*ZX14-0.085*ZX15-0.260*ZX16-0.031*ZX17-0.02*ZX18

Y4=0.01*ZX1-0.373*ZX2-0.344*ZX3-0.094*ZX4-0.212*ZX5-0.098*ZX6-0.164*ZX7+0.086*ZX8+0.229*ZX9-0.096*ZX10+0.397*ZX11+0.181*ZX12+0.307*ZX13+0.278*ZX14-0.086*ZX15+0.338*ZX16+0.022*ZX17+0.314*ZX18

Y5=0.055*ZX1-0.1*ZX2-0.421*ZX3+0.21*ZX4+0.687*ZX5-0.059*ZX6-0.067*ZX7+0.396*ZX8-0.066*ZX9+0.014*ZX10-0.142*ZX11-0.09*ZX12-0.041*ZX13+0.243*ZX14+0.044*ZX15+0.063*ZX16-0.159*ZX17-0.078*ZX18

以5個主成分的方差百分比為權重,計算主成分綜合得分:Y=0.330 94*Y1+0.225 95*Y2+0.119 63*Y3+0.085 21*Y4+0.068 45*Y5。依據主成分綜合得分對炮制品進行排名,見表12。由表可知,3種炮制品基于炮制過后各成分含量高低的總體排名為蒸制>浸制>煮制。

表12 清半夏綜合得分與排名

2.9 三種炮制品安全性指標檢測

統計結果見表13,浸制、煮制、蒸制清半夏的白礬限量均值分別7.04、9.54、7.82%,浸法白礬限量顯著低于煮、蒸法,而煮法的白礬限量則顯著高于蒸法,偶有超過藥典規定的10%限量。

表13 清半夏白礬限量

浸法與蒸法的差異在于蒸法增加了蒸制步驟,即蒸制步驟會導致白礬殘留少量提升,推測蒸制可促進半夏吸收其表面殘留的白礬,但通過蒸制前清洗應可減少其影響。煮法的白礬殘留相對較高,推測與長時間接觸白礬溶液有關。故蒸制炮制品在安全性方面并無較大隱患。

3 討論與結論

本研究從質量成分的傳遞出發,比較了3種清半夏炮制方法的差異,并評價了蒸法這一炮制新工藝。基于上述質量傳遞的影響因素探究,使蒸法有別于浸法、煮法的關鍵步驟應為蒸制,蒸制步驟的高溫以及不直接接觸水體,直接導致了浸出物、草酸、多糖的保留、增加。綜合所有檢測指標及多種分析方法,可見蒸制法對內在質量的影響使炮制品與傳統清半夏產生顯著差異,其炮制品能否被稱為“清半夏”有待商榷。

但是,半夏、清半夏的質量指標成分至今沒有確定,2020版《中國藥典》僅以浸出物作為質量檢測指標。與浸出物含量呈正相關的枸櫞酸、L-蘋果酸、腺嘌呤等成分,在主成分分析中也基本為第一、第二主成分的重要正向成分。這一結果提示了枸櫞酸、L-蘋果酸、腺嘌呤等成分應用于評價生半夏質量的可能,同時,按當前建立的質量評價方法,蒸法較浸、煮法炮制品所展現的質量更優。而且,通過飲片得率、白礬限量,分別從生產效率、安全性進行比較,蒸法較煮法均有較大優勢。

浸法與煮法炮制的飲片質量傳遞一致性較好,與蒸法炮制的飲片質量存在較大差異,但當前尚未見三種炮制方法所得炮制品在臨床效果上的比較。煮法在地方中藥飲片炮制規范(如北京市、內蒙古、吉林、河南等地)及1963年版中國藥典中均有收載[7],但蒸法報道較少,且并未被收入藥典或地方標準中。根據本研究結果,蒸法在其成分含量和穩定性上具有可取之處,其能否作為一種正規炮制方式進行收載還有待進一步深入研究。

蒸法因高溫可用于縮短炮制的時間,且在本研究中表現出含量變化率更為穩定的趨勢,在節省用時用工方面有巨大潛力。下一步可進一步優化蒸法工藝:能否縮短浸泡時間,利用高溫蒸汽同步達成透心的效果。此外,蒸法炮制品的內在含量與傳統工藝有差異,可基于其差異成分,與傳統清半夏炮制品比較藥理作用、臨床療效,由此探究清半夏的藥效機制,為闡明炮制的科學性提供依據。