基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究黃芪提取物治療缺血缺氧性腦病的機(jī)制

宋麗婭,李麗華,畢思童

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院兒科,北京 101149

新生兒缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是一類影響新生兒、嬰幼兒神經(jīng)生長發(fā)育的疾病,幸存者往往會遺留多種神經(jīng)后遺癥,給患兒及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。臨床上尚無特效治療HIE的藥物,研究HIE的病理生理機(jī)制對于找到更有效的治療方案具有重要意義。研究表明,氧化應(yīng)激、鈣的內(nèi)流、自由基生成、酸中毒、離子失衡、炎癥、凋亡、自噬、壞死等在HIE發(fā)病機(jī)制中都起著重要作用[1]。在中藥學(xué)領(lǐng)域,有報(bào)道指出,黃芪及其制劑在治療HIE方面顯示出較好的效果[2,3]。現(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí),黃芪提取物具有清除氧自由基、抗感染、保護(hù)血管內(nèi)皮的功效,在臨床上多被用于治療心、腦血管疾病[4]。本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)分析黃芪提取物治療HIE的作用機(jī)制,為促進(jìn)臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫篩選黃芪的主要成分和基因靶點(diǎn)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫平臺(TCMSP)篩選黃芪提取物中的活性成分,根據(jù)毒藥物動力學(xué)參數(shù)(absorption,distribution,metabolism,excretion,ADME)設(shè)置篩選條件:口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥ 30%,藥物相似性(drug-likeness,DL)≥ 0.18。建立活性成分庫。利用TCMSP和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫查詢黃芪提取物活性成分對應(yīng)的所有基因靶點(diǎn),去除重復(fù)靶點(diǎn)后運(yùn)用Perl語言和UniProt數(shù)據(jù)庫對基因靶點(diǎn)進(jìn)行符號轉(zhuǎn)換。

1.2 HIE相關(guān)基因靶點(diǎn)獲取

在Gene Cards和OMIN數(shù)據(jù)庫中以“hypoxic-ischemic encephalopathy”為關(guān)鍵詞檢索HIE相關(guān)基因靶點(diǎn),匯總后去除重復(fù)值并根據(jù)“相關(guān)性分?jǐn)?shù)”提取排名靠前的242個基因靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“黃芪活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖獲得交集靶點(diǎn),并對活性成分與潛在靶點(diǎn)的關(guān)系進(jìn)行分析。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行黃芪活性成分的潛在靶點(diǎn)與HIE靶點(diǎn)的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析,構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:物種限制為人類,信度>0.40,余默認(rèn)設(shè)置。刪除離散目標(biāo)并下載TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。利用拓?fù)浞治霾寮ytoHubba進(jìn)行拓?fù)浞治觥８鶕?jù)節(jié)點(diǎn)大小及顏色深淺度、Degree值篩選黃芪提取物治療HIE的核心活性成分及靶點(diǎn)。

1.4 分子對接技術(shù)

在PDB和TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載活性蛋白的3D共晶結(jié)構(gòu)和小分子配體結(jié)構(gòu),將其保存為pdb格式;利用PyRx軟件刪除小分子配體和水分子,運(yùn)用SYBYL-X2.1軟件將活性成分和靶蛋白在加氫、加荷后由pdb格式轉(zhuǎn)換為mol2格式,通過自對接方式運(yùn)用SYBYL-X2.1進(jìn)行對接,計(jì)算結(jié)合能,并進(jìn)行可視化圖像分析。

1.5 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.5.1 藥品、儀器和試劑

黃芪(批號:粵20160335,廠家:康美藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),鑒定信息:黃芪甲苷0.084%、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.025%)。

蛋白提取試劑盒、ECL顯色試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(批號:22080302、21121006、22110912,北京中杉金橋生物科技公司);誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2,NOS2)、前列腺素氧化環(huán)化酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,PTGS2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、絲裂原活化蛋白激酶4(mitogen-activated protein kinase 4,MPAK4)、胱天蛋白酶8(Caspase 8,CASP8)多克隆兔抗(批號:21111305、22020104、22061205、22021512、21100913,Abnova公司);β-actin鼠抗、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)(批號:21091007、21110802,美國Sigma公司);ChemiDoc-MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)(山東三瑞科技有限公司);HS3345石蠟切片機(jī)(湖北慧達(dá)儀器有限公司)。

1.5.2 黃芪提取物注射液的制備

取黃芪50 g切片,加水煎煮2次,合并提取液,減壓濃縮,濃縮液加乙醇使含醇量達(dá)60%,濾取析出物,加水溶解,離心除去不溶物,濾液減壓濃縮至適量,加乙醇使含醇量達(dá)80%,室溫靜置過夜,過濾,濾液回收乙醇,并濃縮至5 mL,濃縮液中加入適量注射用水配至50 mL并冷藏過夜,過濾后濾液使用20%NaOH調(diào)節(jié)PH至7.5以上,煮沸后關(guān)火,稍冷后加活性炭0.25 g,靜置4 h后使用4號垂溶漏斗精濾,完成后按照《中國藥典2020版》中中藥注射劑型相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn),合格按照50 g黃芪/支制備注射液并裝入安瓿瓶中密封備用。

1.5.3 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠采購于首都醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心(動物許可證號:SCXK(京)2018-0057)本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理審核(倫理批號:AEEI-2023-015),將雌雄比2∶1大鼠混合飼養(yǎng)于SPF級動物房內(nèi),保證充足的溫度、濕度、食物。飲用水等條件,使雌鼠成功受孕,待自然分娩后將母鼠和新生大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)。按照3R原則給予動物人道主義關(guān)懷。

1.5.4 建模及分組

建模:將7日齡新生大鼠乙醚麻醉后,取仰臥位固定于操作臺上,75%酒精消毒頸部,于頸正中切開皮膚,暴露頸總動脈并結(jié)扎2 h,而后恢復(fù)2 h,建立大腦缺血模型,消毒縫合切口。而后將新生大鼠置于37 ℃恒溫水浴缺氧艙中,向艙內(nèi)持續(xù)2 h通入8% O2和92% N2的混合氣體,完成缺氧過程。至此完成缺血缺氧模型建立,建模小鼠分為治療組和模型組,各10只。

假手術(shù)組模型建立:假手術(shù)組10只大鼠僅暴露左側(cè)頸總動脈,不接扎,不做缺氧處理。而后將黃芪提取物注射液以3 mL/kg劑量尾靜脈注射于治療組,模型組和假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。每天1次,連續(xù)5 d。而后末次給藥結(jié)束后24 h,用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后,所有大鼠均實(shí)施安樂死,所有入組大鼠均分離出左側(cè)海馬組織,迅速置于-80 ℃冰箱中保存待用,操作完成后對大鼠尸體進(jìn)行無害化處理。

1.5.5 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測

將分離出的海馬組織使用蛋白提取試劑盒提取各海馬組織總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。而后各取50 μg進(jìn)行SDS電泳,轉(zhuǎn)PVDF膜、脫脂、封閉、1∶2 000稀釋后NOS2、PTGS2、SOD1、MAPK4、CASP8多克隆兔抗4 ℃過夜孵育,用ECL顯色試劑盒顯色,以β-actin為內(nèi)參,全能型凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間兩兩比較行t檢驗(yàn),多組間比較采用F檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取物的活性成分和基因靶點(diǎn)

根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫,共得到黃芪提取物的70個活性成分。共獲得350個相關(guān)靶點(diǎn),去除重復(fù)靶點(diǎn)和基因注釋后,最終獲得“黃芪提取物”有效成分的120個靶點(diǎn)。

2.2 黃芪提取物潛在靶點(diǎn)的獲得

通過將黃芪提取物的120個靶點(diǎn)與HIE的前242個靶點(diǎn)(相關(guān)性分?jǐn)?shù)>5)相映射,篩選出黃芪提取物治療HIE的18個潛在靶點(diǎn),結(jié)果如圖1所示;利用Cytoscape軟件構(gòu)建“黃芪提取物活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖獲得交集靶點(diǎn),利用插件cytoHubba的MCC算法并對活性成分與潛在靶點(diǎn)的關(guān)系進(jìn)行分析(見圖2),發(fā)現(xiàn)4-羥基肉桂酸、順式阿維酸、黃芪紫檀烷苷、常春藤皂苷元、華良姜素具有較高的Degree值,為關(guān)鍵活性成分(見表1)。

表1 黃芪提取物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵化合物的相關(guān)參數(shù)

圖1 黃芪提取物與HIE靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.1 Venn plot of Astragali Radix extract and HIE target

圖2 黃芪提取物化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Compound-target network of Astragali Radix extract

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將18個潛在靶點(diǎn)輸入STRING中進(jìn)行蛋白相互作用分析,根據(jù)信度>0.40提取結(jié)果,將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3);根據(jù)PPI分析結(jié)果,共存在48個節(jié)點(diǎn),512條邊,利用插件cytoHubba的MCC算法發(fā)現(xiàn)3個核心靶點(diǎn)(Degree值>30),分別為NOS2、PTGS2、SOD1。前10個潛在靶點(diǎn)信息見表2。

表2 前10個潛在靶點(diǎn)的信息

圖3 黃芪提取物和HIE核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)篩選圖Fig.3 PPI network screening diagram of Astragali Radix extract and HIE core target

2.4 分子對接

利用SYBYL-X2.1軟件對黃芪提取物治療HIE的3個關(guān)鍵靶點(diǎn)(NOS2、PTGS2、SOD1)與5個活性化合物進(jìn)行對接,探究其相互作用。從PDB數(shù)據(jù)庫中檢索并下載得到3個關(guān)鍵靶點(diǎn)的受體蛋白共晶結(jié)構(gòu)。圖4為分子對接的可視化結(jié)果,相關(guān)的詳細(xì)信息列于表3中。通常認(rèn)為分子對接得到的結(jié)合能若小于-5 kcal/mol,說明靶點(diǎn)與化合物具有一定的結(jié)合活性,且結(jié)合能越低,兩者結(jié)合越穩(wěn)定。

表3 黃芪提取物關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能

圖4 4-羥基肉桂酸分子的對接可視化圖Fig.4 Docking Visualization of 4-hydroxycinnamic acid molecule

2.5 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

動物實(shí)驗(yàn)顯示,治療組大鼠海馬組織中NOS2、PTGS2、MAPK4、CASP8蛋白表達(dá)水平低于模型組,SOD1蛋白表達(dá)水平高于模型組,假手術(shù)組大鼠海馬組織中NOS2,PTGS2,MAPK4,CASP8蛋白表達(dá)水平低于治療組和模型組,SOD1水平高于治療組和模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖5、表4)。

表4 大鼠海馬組織中NOS2、PTGS2、SOD1、MAPK4、CASP8蛋白表達(dá)情況

3 討論與結(jié)論

HIE最主要的病理生理機(jī)制是腦組織的缺血缺氧。腦組織缺血缺氧后會引起一系列病理生理變化,主要有細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng),缺血缺氧神經(jīng)損傷的不同階段均由上述三種生理變化間的相互作用所致[5]。新生兒HIE的治療一直以來是臨床的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。傳統(tǒng)的“三支持”和“三對癥”療法受到胎齡、時間、醫(yī)療設(shè)施等多種因素的限制,HIE的治療效果有限。臨床上一直在迫切尋求HIE治療的補(bǔ)充或替代療法。黃芪作為我國的傳統(tǒng)中藥,近年來通過現(xiàn)代藥理學(xué)研究對黃芪活性成分的作用取得了重大進(jìn)展。研究表明,黃芪具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗缺氧和氧化應(yīng)激及改善血管內(nèi)皮功能的作用[6]。動物實(shí)驗(yàn)研究顯示,黃芪能夠上調(diào)大鼠腦組織中B淋巴細(xì)胞瘤-2蛋白表達(dá)水平,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、減輕缺血缺氧所致的腦損傷[7]。但目前臨床上關(guān)于黃芪的主要活性成分及作用機(jī)制研究尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接是近年來興起的一種基于大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥理學(xué)研究的技術(shù),通過大數(shù)據(jù)獲得相關(guān)藥物的主要活性成分和作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接進(jìn)而分析藥物的具體作用機(jī)制[8]。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫,共得到黃芪提取物的70個活性成分。共獲得350個相關(guān)靶點(diǎn),去除重復(fù)靶點(diǎn)和基因注釋后,最終獲得“黃芪提取物”有效成分的120個靶點(diǎn)。

通過拓?fù)浞治龅贸龅幕衔?網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)圖可以看出黃芪發(fā)揮治療HIE的主要活性成分為4-羥基肉桂酸、順式阿維酸、黃芪紫檀烷苷、常春藤皂苷元、華良姜素五個活性成分。4-羥基肉桂酸被證實(shí)具有清除氧自由基的作用。動物實(shí)驗(yàn)顯示[9],4-羥基肉桂酸能夠緩解大鼠神經(jīng)病理性疼痛。一項(xiàng)西藏地區(qū)的研究結(jié)果表明,順式阿維酸能夠有效提高機(jī)體的血氧飽和度,緩解缺氧造成的不良癥狀;且該活性成分能夠促進(jìn)黃芪甲苷在體內(nèi)的吸收[10]。黃芪甲苷已經(jīng)被大量研究證實(shí)具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)的生物活性,是一種重要的神經(jīng)保護(hù)劑[11]。黃芪紫檀烷苷是從黃芪中分離的出來的一種化合物,可以抑制人血小板衍生生長因子bb(eukaryotic platelet derived growth factor BB,PDGF-BB)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2)的激活,抑制絲裂原活化蛋白(mitogen activating protein,MAP)激酶的磷酸化[12];還可通過抑制ERK1/2 MAP激酶級聯(lián)反應(yīng)途徑,抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明,華良姜素作為黃芪的活性成分能夠通過PDK-Akt信號通路、腫瘤壞死因子、MAPK信號通路發(fā)揮治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用[14]。

將120個靶點(diǎn)與HIE的242個靶點(diǎn)相映射后得到18個潛在靶點(diǎn)。再通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出NOS2、PTGS2、SOD1、MAPK4、CASP8為黃芪治療HIE的核心靶點(diǎn)。炎癥被認(rèn)為是HIE的重要致病因素,大量炎癥因子能夠加速神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和壞死。NOS2能夠促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)組織內(nèi)產(chǎn)生一氧化氮,參與炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。動物實(shí)驗(yàn)顯示,敲除大鼠NOS2基因能夠抑制Rac1的合成,進(jìn)而抑制腫瘤壞死因子-α的促炎作用。SOD1的主要作用是在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用[15]。SOD1在機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,其能夠促進(jìn)過細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫分解,減少氧自由基的產(chǎn)生,從而使得機(jī)體氧化-抗氧化系統(tǒng)維持平衡[16]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示,PTGS2過表達(dá)能夠加劇糖氧剝奪模型下的PC12的細(xì)胞損傷[17]。當(dāng)局部缺血缺氧并釋放細(xì)胞因子后可以導(dǎo)致MAPK4通路激活,從而進(jìn)一步刺激免疫細(xì)胞釋放促炎因子導(dǎo)致局部炎性反應(yīng)加重[18]。CASP8是細(xì)胞凋亡和壞死性凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,也是通過其二聚化和酶活性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子,其含量升高預(yù)示著局部炎性反應(yīng)的增強(qiáng)[19,20]。從上述分析中我們可以看出黃芪的主要活性成分通過作用于上述靶點(diǎn)來發(fā)揮治療HIE的作用,其生物過程可能涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激細(xì)胞、損傷修復(fù)等。

分子對接結(jié)果顯示,黃芪中的4-羥基肉桂酸、順式阿維酸、黃芪紫檀烷苷3種活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)具有良好的結(jié)合活性,主要是依靠疏水鍵或氫鍵結(jié)合,發(fā)揮治療HIE作用。就結(jié)合能看,SOD1和黃芪紫檀烷苷的結(jié)合能最低,為-8.9 kcal/mol。動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果顯示治療組大鼠海馬組織中NOS2、PTGS2蛋白表達(dá)水平低于模型組,SOD1蛋白表達(dá)水平高于模型組,假手術(shù)組大鼠海馬組織中NOS2、PTGS2蛋白表達(dá)水平低于治療組和模型組,SOD1水平高于治療組和模型組,進(jìn)一步證實(shí)了黃芪提取物在治療HIE中具有可靠作用。相關(guān)研究表明[21],黃芪皂苷能夠通過激活Nrf2/HO信號通路,上調(diào)下游抗氧化基因HO-1的表達(dá),抑制一氧化氮生成,增加SOD活性,提高腦組織抗氧化能力。現(xiàn)代藥理學(xué)還證實(shí),黃芪除了具有強(qiáng)大的清除自由基的作用外,其所含的黃酮類物質(zhì)還能夠降低腦組織缺血再灌注時的血小板活性,抑制環(huán)氧合酶-2的表達(dá),減輕腦組織缺血再灌注損傷[22,23]。

綜上所述,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)分析了黃芪提取物中的主要活性成分治療HIE的機(jī)制,得出了黃芪提取物治療HIE主要是4-羥基肉桂酸、順式阿維酸、黃芪紫檀烷苷三種成分通過作用于NOS2、PTGS2、SOD1、MAPK4、CASP8等關(guān)鍵靶點(diǎn),來發(fā)揮治療HIE的作用。網(wǎng)絡(luò)藥理分析也證實(shí)了此過程是一個多成分-多靶點(diǎn)-多通路協(xié)同作用的結(jié)果。