基于HPLC指紋圖譜結合化學模式識別以及多指標成分定量評價前胡藥材質量

謝 景,秦 優,唐雪陽,沈冰冰,王勇慶,陳 林,張水寒*

1湖南省中醫藥研究院中藥資源研究所,長沙 410013;2湖南中醫藥大學藥學院,長沙 410208

前胡藥材來源于傘形科植物白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根,始載于《名醫別錄》,具有疏散風熱、降氣化痰的功效,常用于痰熱咳喘、咯痰黃稠、風熱咳嗽痰多等癥[1]。在現代化學成分和臨床應用上,前胡活性成分主要為角型吡喃香豆素,包括白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡丁素等,具有祛痰平喘、抗心衰、降血壓、抗炎等藥理作用[2,3]。自古以來,前胡藥材以野生資源為主,分布于安徽、湖南、江西、浙江、江蘇等地。近年來,因資源需求激增,人工種植逐漸代替野生,其栽培主產區主要為安徽寧國、湖南華容、貴州遵義、重慶奉節等地[4]。白花前胡實現人工種植后,各產地紛紛引種種植,種植區域東至浙江,西至云南、四川,但因產地環境千差萬別,前胡藥材質量存在較大差異,品質良莠不齊[3]。此外,加上人工種植白花前胡容易發生早薹等[5,6]問題,迫使前胡藥材提前采收,生長年限不足致使藥材不合格率大幅上升。2020版《中國藥典》規定“白花前胡甲素不得少于0.90%,白花前胡乙素不得少于0.24%”,但市場上前胡藥材質量達標率僅26%,不合格前胡藥材充斥市場[7]。前胡藥材質量保障除了培育高品質新品種、形成適宜種植技術、規范產地初加工外,客觀、科學、合理的質量評價方法及標準也是其重要內容。目前,前胡藥材質量評價關鍵在于白花前胡甲素、乙素含量高低,但這往往不能從整體評價前胡藥材的內在品質,直接影響了中醫臨床應用。

HPLC指紋圖譜能較全面反映藥材內在質量,是共識度較高的質控手段,結合多指標含量測定,現已成為中藥材質量控制的主流[8,9]。聚類分析(hierarchical clustering analysis,HCA)、主成分分析(principal component analysis,PCA)等非監督方法和偏最小二乘法(partial least squares method,PLS)、人工神經網絡等有監督的化學模式方法能夠較好反映藥材內在質量,是近年來運用較多的新方法[10]。本研究基于前期基礎[11,12],新建HPLC指紋圖譜,并結合聚類分析、主成分分析、偏最小二乘回歸分析法等化學模式方法對不同產地前胡藥材進行綜合評價;同時,定量測定佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E四個香豆素類成分含量,明確不同產地前胡藥材的成分差異特征,為前胡藥材質量標準制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型HPLC高效液相色譜儀(美國Agilent公司);AL204型萬分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);XPE105 型百萬分之一電子分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);Agilent SB-C18色譜柱(4.6 mm × 250 mm,5 μm)。

1.2 試劑

佛手苷內酯(bergapten)(批號:CHB201127)、白花前胡香豆精Ⅱ(peucedanocoumarin Ⅱ)(批號:CHB210205)、白花前胡甲素(praeruptorin A)(批號:CHB210115)、白花前胡乙素(praeruptorin B)(批號:CHB201101)、白花前胡素E(praeruptorin E)(批號:CHB201211)對照品(質量分數均大于98.0%,成都克洛瑪生物科技有限公司);甲醇(色譜純,安徽天地高純溶劑有限公司,批號:MS1922-801);純凈水(華潤怡寶市售純凈水,批號:20221208);其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

前胡藥材總共有16批次,主要來自于湖南、貴州、重慶、安徽、湖北、云南等地,除市售樣品外,其余均為產地采集。所有樣品經湖南省中醫藥研究院劉浩副研究員鑒定為傘形科前胡屬白花前胡PeucedanumpraeruptorumDunn的干燥根,具體信息見表1。

表1 前胡藥材信息表

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液

取樣品粉末(過四號篩)約1.0 g,精密稱定,置于50 mL錐形瓶中,加入純甲醇25 mL,稱定質量,超聲提取1 h,取出,放冷,稱定質量,加甲醇補足減失的質量,搖勻,濾過,取續濾液,過微孔濾膜(0.22 μm),即得。

2.1.2 混合對照品溶液

精密稱定佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E對照品適量,加入純甲醇,溶解,配制成含白花前胡甲素1.838 mg/mL、白花前胡乙素0.432 mg/mL、佛手柑內酯0.012 mg/mL、白花前胡素E 0.616 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 空白對照溶液

取提取溶劑甲醇溶液,制備成空白對照溶液。

2.2 色譜條件

采用Agilent SB-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)色譜柱,以甲醇(A)-0.5%甲酸水(B)為流動相,梯度洗脫(0～35 min,30%→75%A;35～55 min,75%→78%A;55～70 min,78%→83%A;70 ～85 min,83%→100%A),流速0.5 mL/min,檢測波長321 nm,柱溫30 ℃,進樣體積10 μL。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取樣品粉末(過四號篩)1 g,精密稱定,按照供試品溶液的制備方法,在“2.2”項色譜條件下連續進樣6次,記錄色譜圖。以15號峰(白花前胡甲素)為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.011%～0.033%、0.050%～1.8%,均小于3.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取樣品粉末(過四號篩)1 g,精密稱定,按照供試品溶液的制備方法平行制備六份,在2.2項色譜條件下分別進樣,記錄色譜圖。以15號峰(白花前胡甲素)為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.036%～0.16%、0.56%～2.6%,均小于3.0%,表明本方法的重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取樣品粉末(過四號篩)1 g,精密稱定,在2.2項色譜條件下分別在0、4、8、12、16、24 h進樣6次,記錄色譜圖。以15號峰(白花前胡甲素)為參照峰,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示,各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.040%～0.28%、0.070%～1.4%,均小于3.0%,表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜建立及相似度評價

將16批前胡藥材按“2.1.1”項方法制備供試品溶液,在“2.2”項色譜條件下依次進行測定,得到HPLC色譜圖。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012版)》進行分析,以S5的色譜圖為參照圖譜,采用中位數法,經多點校正、自動匹配后進行色譜峰匹配,生成樣品疊加指紋圖譜(S1～S16)(見圖1)和對照圖譜(見圖2)。以對照指紋圖譜為參照,進行各樣品圖譜的相似度評價,并采用對照品、二級質譜碎片信息以及數據庫比對等進行色譜峰指認,結果見表2。結果表明,16批前胡樣品共標定21個共有峰,共指認9個成分,分別為7號峰(佛手苷內酯)、13號峰(hyuganin D)、14號峰(白花前胡香豆精Ⅱ)、15號峰(白花前胡甲素)、16號峰(白花前胡香豆精 I)、17號峰(前胡香豆素J)、19號峰(白花前胡乙素)、20號峰(白花前胡素E)、21號峰(cis-3′,4′-diisovalerylkhellactone)。16批樣品相似度在0.966～0.999,各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.989～0.999,相似度評價結果見圖3,這表明不同產地間前胡藥材具有較高的相似性。然而,21個共有峰的峰面積RSD為23.9%～120.1%,說明各產地間成分含量相差較大。

圖1 16批前胡HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of 16 batches of Peucedani Radix

圖2 前胡對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Peucedani Radix

圖3 16批前胡指紋圖譜相似度熱圖Fig.3 Heat map of fingerprint similarity from 16 batches of Peucedani Radix

表2 白花前胡指紋圖譜共有峰指認

2.5 化學模式識別

2.5.1 HCA分析

采用多元統計分析軟件SIMCA 14.1對將16批次前胡樣品的21個共有峰的相對峰面積進行HCA分析,聚類樹狀圖見圖4。16批樣品聚為三類:S1～S3、S5～S6、S8、S10、S12聚為一類,產地為湖南華容、永州,湖北恩施,重慶奉節,貴州遵義、大方(產地一類);S4、S7、S9、S11、S13～S14聚為一類,產地為安徽亳州、寧國、宣城(產地二類);S15、S16聚為一類,產地為云南(產地三類)。

圖4 16批前胡HCA聚類分析圖Fig.4 HCA analysis of 16 batches of Peucedani Radix

2.5.2 PCA分析

采用SPSS 25.0軟件對16批樣品21個共有峰進行PCA分析,將共有峰標準化處理后,計算方差貢獻率。以特征值>1.0為標準,提取出6個主成分,方差貢獻率依次為26.674%、18.599%、14.772%、11.785%、9.161%、5.222%,累計貢獻率為86.213%,可代表21個共有峰的主要信息(見表3)。主成分因子載荷矩陣見表4可知,第一主成分主要代表了峰19、18、20、11、21,第二主成分主要代表了峰15、13,第三主成分主要代表了峰17、6,第四主成分主要代表了4、5,第五主成分主要代表了峰3、10,第六主成分主要代表了峰16。

表3 主成分特征值及方差貢獻率

表4 主成分因子載荷矩陣

2.5.3 PLS-DA分析

圖5 16批前胡樣品PLS-DA得分圖Fig.5 PLS-DA score plot of 16 batches of Peucedani Radix

圖6 16批前胡樣品21個共有峰的VIP值Fig.6 VIP value of 21 common peaks of 16 batches of Peucedani Radix

2.6 多指標含量測定

2.6.1 專屬性試驗

取供試品溶液、混合對照品溶液和空白對照溶液,在“2.2”項的條件下進行分析,色譜圖見圖7。結果表明,佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E的分離度均大于1.5,理論塔板數均大于6 000,空白對照溶液無干擾。此方法專屬性較好。

圖7 前胡樣品(A)、混合對照品(B)以及空白對照(C)的HPLC圖Fig.7 HPLC chromatograms of Peucedani Radix samples (A),mixed substance solution (B) and blank control (C)

2.6.2 線性關系考察

精密量取混合對照品溶液2.5 mL,定容至5 mL,反復精密量取并稀釋,得到梯度濃度混合對照品。佛手柑內酯梯度濃度分別為0.19、0.38、0.76、1.52、3.04、6.08、12.16 μg/mL;白花前胡甲素梯度濃度分別為28.72、57.44、114.88、229.75、459.50、919.00、1838.00 μg/mL;白花前胡乙素梯度濃度分別為6.75、13.50、27.00、54.00、108.00、216.00、432.00 μg/mL;白花前胡素E梯度濃度分別為9.63、19.25、38.50、77.00、154.00、308.00、616.00 μg/mL。精密吸取系列梯度濃度混合對照品溶液10 μL,按“2.2”項的條件注入液相色譜儀,以質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,進行線性回歸,結果見表5。可見,在一定范圍內,各成分質量濃度與峰面積呈良好的線性關系。

表5 前胡4種香豆素類成分線性回歸方程

2.6.3 加樣回收率試驗

稱取已知待測成分含量的前胡樣品(S11)六份各0.50 g,精密稱定,加入與樣品含量相近的佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E對照品適量,按照“2.1.1”方法制備供試品溶液,在“2.2”色譜條件下,記錄峰面積,計算佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E加樣回收率,分別為99.28%、100.3%、101.2%、100.7%,RSD均小于3.0%。

2.6.4 樣品含量測定

按照“2.1.1”方法制備供試品溶液,按照“2.2”色譜條件進行含量測定,計算佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素、白花前胡素E,結果見表6。佛手柑內酯含量0.016 7～0.131 9 mg/g,均值為0.041 2 mg/g,最高為云南昆明產地。白花前胡甲素6.069 6～16.225 5 mg/g,均值為10.028 8 mg/g,最高為重慶奉節。白花前胡乙素0.426 5～2.010 0 mg/g,均值為1.275 8 mg/g,最高為貴州遵義。白花前胡素E 1.340 7～3.115 5 mg/g,均值為2.271 0 mg/g,最高為湖南華容。按產地分類進行統計分析,結果見圖8,產地三類(云南昆明、重慶奉節)的佛手柑內酯、白花前胡甲素含量分別為0.095 4 mg/g和15.936 2 mg/g,遠高于產地一類和產地二類,可作為區分產地三類的差異性成分。產地一類和二類的四個香豆素類成分含量總體差異不大。

圖8 產地類別中前胡藥材香豆素類成分含量Fig.8 Content of coumarins of Peucedani Radix in different producing areas

表6 前胡中四個香豆素類成分含量

3 討論與結論

為了優化前胡HPLC指紋圖譜的色譜條件,本研究基于前期研究,對檢測波長、流動相、流速進行優化。采用全波長掃描方法進行分析,結果表明在波長190～245 nm和290～340 nm有吸收,選擇321 nm檢測波長,其信息量大,響應值較好,雜質干擾少,確定以321 nm作為檢測波長。對流動相“乙腈-水”“甲醇-水”進行考察,結果表明“甲醇-水”分離效果更好,0.5%甲酸水能得到更好峰形,因此確定“甲醇-0.5%甲酸水”為流動相。此外,對流速1、0.8、0.5 mL/min進行考察,發現0.5 mL/min有更好的分離度,確定以0.5 mL/min作為此方法的流速。

本研究采用HPLC指紋圖譜對湖南、安徽、重慶、湖北、貴州、云南等產地樣品進行分析,16批前胡藥材指紋圖譜具有較高相似度,共確定21個共有峰,共指認了7個成分。在化學模式分析中,將16批樣品共分為三類,結合參考文獻[14]報道,可分為:以安徽寧國、亳州等為主的道地產區前胡,以湖南、貴州、重慶等為主的前胡,以及高海拔云南產區的前胡。通過主成分和PLS-DA分析,6個主成分累計方差貢獻率86.213%,進一步分析篩選出區分產地的8個共有峰,可作為產地的主要標志性成分。高海拔云南產區前胡樣品的白花前胡甲素和佛手柑內酯含量顯著高于其他產區,白花前胡乙素略高于其他產地,我們推測,高海拔利于前胡藥材佛手柑內酯、白花前胡甲素、白花前胡乙素的積累。Yang等[15]認為高海拔有利于白花前胡甲素和白花前乙素的生成與積累,Luo等[16]認為海拔對白花前胡乙素含量的影響大于白花前胡甲素。雖然本研究與前人研究不盡相同,但可明確一點,在高海拔環境下,更加有利于前胡藥材品質的形成。

在多指標成分含量測定分析中,共有9批前胡樣品白花前胡甲素符合《中國藥典》要求,占比56.25%,但沒有批次符合白花前胡乙素限量要求,最高者僅2.01 mg/g。Xu等[11]、Liu等[17]也均發現,前胡藥材中白花前胡甲素更易達標,而白花前胡乙素不達標現象較為常見。白花前胡為多年生一次開花植株,規模化種植致使改變為一年生品種,年限不足是前胡藥材品質下降的重要原因。此外,白花前胡極易發生早薹現象[5],“火藥籽”(一年生種子)充斥市場,長期迭代選擇,前胡藥材品質人為選擇性逐年下降。前胡藥材品質的普遍性下降是否影響臨床療效,有待進一步研究。

文獻報道[7],白花前胡甲素含量與白花前胡乙素存在某種程度的負相關關系,本研究也發現存在這種趨勢,但具體原因有待進一步證實。市場上前胡藥材品質低劣的原因除了生態環境、遺傳基因及人工干預外,還可能與現行質量評價存在較大關系。現行標準中,市售前胡藥材合格率極低,特別是白花前胡乙素含量的達標率,這種現狀已經不符合前胡藥材臨床用藥及其產業發展。在此背景下,Qiu等[18]探索采用白花前胡甲素與白花前胡乙素比值或和來綜合評價前胡藥材質量,Liu等[19]、Xiao等[12]、Shi等[20]均對前胡藥材指紋圖譜進行評價研究,從不同角度對前胡藥材進行了質量評價,并取得了較好預期。

本研究采用指紋圖譜、多指標成分和化學模式分析三者相結合的方法對藥材品質進行分析和評價,對前胡藥材質量評價標準的制訂具有重要的借鑒意義。然而,不足的是,本研究樣品的采集主要從市場、種植基地等途徑獲得,沒有詳細記錄種質、生態環境、種植技術等信息,樣品一致性的局限可能對本研究存在一定影響。在后續研究中,應加強生態環境對前胡藥材品質形成影響的研究,解決白花前胡早薹的核心問題,加大藥材質量標準研究的樣本量,制定符合市場預期、促進產業可持續發展的質量評價標準。