HS-SPME-GC-MS分析‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官揮發性成分的變化規律

鄭超榮,胡瑩冰,2,譚雨晴,雍玉冰,巢 瑾,張 哲,陳 燕,金曉玲*

1中南林業科技大學風景園林學院,長沙 410004;2浙江廣廈建設職業技術大學建筑工程學院,東陽 322100;3湖南省茶業集團股份有限公司,長沙 410126

花香是指由植物花朵中釋放出的一系列分子量低、揮發性強的芳香物質而組成的復雜混合物。適宜濃度的花香對人體身心健康有積極影響。因而,花香也被譽為“花卉的靈魂”,是植物重要的觀賞性狀之一[1]。花朵揮發性成分的提取方法主要有蒸餾法、有機溶劑提取法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法、頂空固相微萃取法(HS-SPME)和同時蒸餾萃取法等。頂空固相微萃取法由于操作簡單、樣品用量少、成本低、應用范圍廣、實驗結果準確可靠等優點而被廣泛采用[2]。花揮發性成分的測定方法有氣相色譜-質譜聯用、氣相色譜-離子遷移譜、氣相色譜-嗅聞和電子鼻技術等。氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)所需樣品量少、靈敏度高、檢測速度快,其在植物揮發性成分中廣受歡迎[3]。目前,國內外大多是采用HS-SPME-GC-MS來測定植物花揮發性成分的組成。

含笑屬(Michelia)植物是著名的芳香植物,其花、葉和枝條等部位均具有豐富的芳香化合物。目前,對含笑屬植物提取物的大量研究已證實,其具有保鮮、抑菌、抗癌和抗氧化等功能,因而被廣泛應用在食品保鮮、香料和醫藥等領域[4]。值得注意的是,花作為植物的繁殖器官,其揮發性成分十分豐富[5]。已有研究對含笑屬的白蘭[6]、含笑[7]、深山含笑[8]和黃蘭[9]等樹種進行了花朵揮發性成分分析。

闊瓣含笑(M.platypetala)是木蘭科含笑屬常綠喬木,花色純白,花香濃郁,是湖南地區的鄉土樹種,也是一種優良的園林觀賞植物[10,11]。對于闊瓣含笑的研究,現多集中在生理特性[12]、栽培繁育[13]和雜交育種[14]等方面,對其花香成分的解析目前未見相關文獻報道。‘粉蘊’含笑(M.platypetalaFenyun)是由中南林業科技大學從闊瓣含笑中通過實生選育的方法培育的新品種(品種權號20190034),其主要特點是:花期早(1月底或2月初)、花型優美、花香濃郁,具有很高的觀賞價值和開發利用潛力[15]。本研究以‘粉蘊’含笑不同開花時期(花蕾期、初開期、盛開期)下的不同花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)為研究對象,采用HS-SPME-GC-MS技術檢測其花朵揮發性成分,并通過主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),探討‘粉蘊’含笑不同開花時期下不同花器官的揮發性成分釋放規律。本研究可為后續‘粉蘊’含笑的景觀應用和揮發性成分的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料‘粉蘊’含笑(Micheliaplatypetala‘Fenyun’)栽植于湖南省林業科技示范園,位于長沙市南郊。其長勢良好,無病蟲害。于2023年2月20日在‘粉蘊’含笑開花期間,晴朗的上午分別從樹冠東南西北四個方向隨機采集3個不同開花時期的花朵,即花蕾期S1(花苞片開裂,露出上表面白色,下部淡紅色的花被片)、初開期S2(花被片微展開,雄蕊無散粉)、盛開期S3(花被片展開,雄蕊大量散粉)。采摘后迅速分離花被片(T)、雄蕊(S)和雌蕊(P)(見圖1)于5 mL凍存管中,隨后立即放入-196 ℃液氮中冷凍,用液氮罐運送到湖南省茶業集團股份有限公司進行揮發性成分的測定。

圖1 ‘粉蘊’含笑不同開花時期的3個花器官(花被片、雄蕊、雌蕊)Fig.1 Three flower organs (tepal,stamen and pistil) of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

1.2 實驗儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀(美國Agilent公司);手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(美國Supelco公司)。

1.3 樣品前處理和進樣處理

取3個開花時期的花被片、雄蕊和雌蕊,用液氮將其快速研磨成粉末,混勻后稱取5 g放進20 mL頂空瓶中,同時加入10 μL 0.0802 mg/mL的內標4-甲基-2-戊醇,密封進樣,每個樣品進行三次獨立的重復。

將頂空瓶置于60 ℃下平衡10 min,SPME固相微萃取頭萃取前在氣相色譜儀的進樣口250 ℃老化30 min,再插入加熱平衡后的頂空瓶進行頂空萃取40 min,提取結束后,將固相微萃取頭立即插入氣相色譜儀進樣口,在250 ℃解析5 min。

1.4 氣相色譜質譜(GC-MS)條件

色譜條件:以氦(99.999%)為載氣,流速為1 mL/min,不分流進樣,進樣口溫度250 ℃。初始溫度70 ℃,持續5 min,以15 ℃/min的速度升至100 ℃,接著以5 ℃/min的速度升至125 ℃,然后以2 ℃/min的速度升至150 ℃,最后以20 ℃/min的速度升至280 ℃,并在280 ℃下保持4 min。

質譜條件:電子電離源,離子源溫度為230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質譜掃描范圍m/z30～500;傳輸線溫度280 ℃。

1.5 數據分析

通過AnalysisBaseFileConverter 軟件將采集的原始質譜數據轉換成abf格式導入MS-DIAL4軟件,選擇合適的質譜圖作為參比譜圖,進行目標峰的提取、匹配和對齊,以NIST 20數據庫的質譜信息和保留指數(retention index,RI)信息,匹配度>80為標準,對質譜峰進行定性。用內標4-甲基-2-戊醇的峰面積校正各代謝物峰面積。化合物的定量采用峰面積歸一法計算,揮發性成分的含量計算公式為:揮發性成分含量(mg/kg)=(待測化合物的峰面積×內標濃度×內標體積)/(內標的峰面積×樣品質量)。使用Microsoft Excel 2021對揮發性成分的種類、相對含量進行數據分析,使用GraphPad Prism 8繪圖,使用SIMCA 14.1進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。

2 實驗結果

2.1 ‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官揮發性成分的鑒定和相對含量分析

對‘粉蘊’含笑花揮發性成分進行GC-MS分析,將其總離子流圖(見圖2)與質譜數據進行比對,并查閱相關文獻,最終鑒定出93種揮發性成分,包括萜烯類化合物43種(單萜類25種,倍半萜烯類18種)、烷烴類化合物11種、酯類化合物9種、醛類和醇類化合物各8種、烯烴類和酮類化合物各4種、醚類和芳香族化合物各2種、酚類和雜環類各1種(見表1)。其中,萜烯類數量最多,烷烴類和酯類次之。可見,‘粉蘊’含笑花朵揮發性成分組成豐富,萜烯類和烷烴類是其最主要的種類構成。

表1 ‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官揮發性成分種類及相對含量

圖2 ‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官揮發性成分的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of volatile constituents in flowering organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.1.1 花被片的揮發性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期的花被片中共鑒定出72種揮發性物質,其中花蕾期66種、初開期67種、盛開期71種,主要成分是烷烴類,有7種,在3個開花時期的相對含量分別為66.91%、68.91%、62.59%(見表1)。由圖3可知,花被片中相對含量大于2%的揮發性成分有8種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、β-異可烯、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈創木二烯、δ-欖香烯和2-甲氧基苯酚。其中,烷烴類化合物2,6,10-三甲基十四烷和異十六(碳)烷均在初開期達到最大值,相對含量分別為33.34%和33.13%。萜烯類化合物γ-杜松烯、β-異可烯、3,9-愈創木二烯和δ-欖香烯在盛開期相對含量最高。乙酸桃金娘烯酯是花被片中的特異性成分。

圖3 ‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官中揮發性成分的相對含量(>2%)Fig.3 Relative content of volatile components (>2%) in the floral organs of M.platypetala‘Fenyun’at different flowering stages

2.1.2 雄蕊的揮發性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期的雄蕊中共鑒定出86種揮發性物質,其中花蕾期82種、初開期83種、盛開期80種,主要成分為萜烯類化合物,有42種,在3個開花時期的相對含量分別為68.81%、56.44%、59.60%(見表1)。由圖3可知,雄蕊中相對含量大于2%的揮發性成分有10種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯、β-異可烯、3,9-愈創木二烯、δ-欖香烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、β-蒎烯和α-雪松烯。萜烯類化合物在花蕾期相對含量達到最大值,烷烴類化合物相對含量在初開期均高于花蕾期和盛開期。與花被片進行對比,雄蕊中烷烴類化合物相對含量有所下降,萜烯類化合物相對含量上升。此外,傘形花酮、木薄荷衍生物和反-2-辛醛是雄蕊中的特異性成分。

2.1.3 雌蕊的揮發性成分種類和相對含量

在3個不同開花時期雌蕊中共鑒定出86種揮發性物質,其中花蕾期78種、初開期77種、盛開期81種。花蕾期和盛開期雌蕊中萜烯類化合物相對含量最高,相對含量分別為57.59%、62.82%。初開期雌蕊中烷烴類化合物相對含量最高,相對含量為54.52%(見表1)。由圖3可知,雌蕊中相對含量大于2%的揮發性成分有11種,按相對含量大小排序依次為2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、3,9-愈創木二烯、δ-欖香烯、(+)-香橙烯、α-雪松烯、β-異可烯、β-蒎烯和龍腦乙酸酯。2,6,10-三甲基十四烷和異十六(碳)烷在初開期相對含量達到最大值,占比為26.20%和25.90%。雌蕊中相對含量大于2%的化合物均比花被片和雄蕊中多。γ-杜松烯在萜烯類化合物中相對含量最高,在3個不同開花時期占比分別為18.38%、10.04%和18.68%。別羅勒烯、十二烷、甲酸法呢酯、己醇和3,4-二氫-2H-吡喃是雌蕊中的特異性成分。

2.2 揮發性成分的釋放量分析

由圖4可知,花被片中的揮發性成分含量最高,雄蕊次之,雌蕊最低。隨著花朵的開放,3個開花時期的花被片揮發性成分含量呈顯著下降趨勢,雄蕊在3個開花時期沒有顯著差異,而雌蕊的揮發性成分含量在花蕾期顯著高于初開期和盛開期,但初開期和盛開期沒有顯著差異。由此,‘粉蘊’含笑在花蕾期揮發性成分釋放量最高,3種花器官中花被片的揮發性成分含量最高。

圖4 ‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官中揮發性成分的釋放量Fig.4 Volatile component release from organs of M.platypetala ‘Fenyun’ at different flowering stages

2.3 揮發性成分的PCA和PLS-DA分析

為進一步分析‘粉蘊’含笑不同開花時期花器官揮發性成分的差異,本研究采用PCA對‘粉蘊’含笑各樣品揮發性成分的相對含量進行分析。結果表明,主成分1和主成分2的方差貢獻率分別為57.40%和21.40%,說明這兩個主成分包含了所有樣品中的大部分信息。花蕾期、初開期、盛開期花被片與主成分1呈正相關,花蕾期、初開期、盛開期雄蕊與主成分1呈負相關,花蕾期、初開期、盛開期雌蕊與主成分2呈正相關,表明3種花器官(T、S、P)之間區分良好,不同花器官的揮發性成分有較大差異;同種花器官3個開花時期(S1、S2、S3)的樣品較為靠近,表明同種花器官不同時期的揮發性成分差異較小(見圖5A)。

圖5 ‘粉蘊’含笑3種花器官的PCA與PLS-DA分析Fig.5 PCA and PLS-DA analysis of three flower organs of M.platypetala ‘Fenyun’

從PCA的載荷圖(見圖5B)可知,2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、十三烷、十七烷、水楊酸甲酯、十七烯、十六碳烯和2-甲氧基苯酚等與主成分1有較大的正相關。δ-欖香烯、α-雪松烯、3,9-愈創木二烯、古巴烯、月桂烯、γ-杜松烯和2-羥基醋酸樟香醇等與主成分1有較大的負相關。檸檬醛、香茅醇、龍腦乙酸酯、莰烯、桉油精、(+)-表雙環倍半水芹烯和(+)-香橙烯等與主成分2有較大的正相關。由此可知,2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、十三烷、香茅醇、龍腦乙酸酯和莰烯是導致花被片和雌蕊差異較大的物質,δ-欖香烯、α-雪松烯、3,9-愈創木二烯和γ-杜松烯是導致雄蕊有別于花被片和雌蕊的化合物。

為進一步得出不同開花時期花器官中的差異揮發性化合物,采用PLS-DA對揮發性成分進行判別分析,計算變量投影重要度(variable importance in projection,VIP)可以衡量揮發性成分對各樣品的影響強度。從PLS-DA模型VIP得分圖(見圖5C)可知,共有12種揮發性成分可以作為區分3種花器官的差異性物質(VIP>1),包括β-異可烯、γ-杜松烯、2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯、3,9-愈創木二烯、龍腦乙酸酯、芳樟醇、β-蒎烯、δ-欖香烯和2-甲氧基苯酚。其中2,6,10-三甲基十四烷、6-甲基十五烷和2-甲氧基苯酚在3個開花時期的花被片中的相對含量較高,β-異可烯、3,9-愈創木二烯、芳樟醇、β-蒎烯和δ-欖香烯在3個開花時期的雄蕊中相對含量較高,γ-杜松烯、1,2-二甲氧基苯、(+)-香橙烯和龍腦乙酸酯在3個開花時期的雌蕊中相對含量較高。

3 討論與結論

花香是一種重要的次生代謝物,它由各種低分子量的化合物組成,含有特定的化學信息[16]。花器官特化的腺狀表皮細胞或基本薄壁組織細胞通常是產生植物香味的地方[17]。在含笑屬植物中,亮葉含笑花被片的主要成分為異長葉烯-5-酮[18],紫花含笑花被片中的主要成分為α-愈創木烯[19],含笑花被片中2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚的相對含量高達83.26%[7]。‘粉蘊’含笑花被片中的主要成分為2.6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷。可見在同屬植物相同花器官之間,花被片揮發性物質的主要成分也有很大差異。揮發性成分的合成與釋放可能受植物基因型和環境條件的共同影響。在未來的研究中,可基于這兩種揮發性成分開發利用‘粉蘊’含笑花被片。

γ-杜松烯、3,9-愈創木二烯、δ-欖香烯和(+)-香橙烯是‘粉蘊’含笑雄蕊和雌蕊中萜烯類化合物的主要揮發性成分。其中γ-杜松烯可用于調制柑橘、芒果等食用香精[20]。研究表明萜類物質是植物釋放最多的一類化合物,有良好的殺菌消毒、降低人體血壓、使人鎮靜放松的作用[21]。此外,‘粉蘊’含笑鑒定出的93種揮發性成分中,萜烯類物質的種類最為豐富有43種,與前人研究結果一致,盛花期西藏虎頭蘭花朵中共鑒定出89種揮發性成分,萜烯類化合物種類最多有26種[22]。紫玉蘭鮮花檢測出的43種成分中,有22種是萜烯類化合物[8]。作為優良的芳香植物,‘粉蘊’含笑可廣泛應用在康復花園等健康景觀中,從而為人體的身心健康提供幫助。

目前關于不同花期的花器官揮發性成分含量變化特點的研究報道較少,不同花器官的揮發性成分含量與花期顯著相關。紫花含笑的花揮發性成分釋放量在盛開期最高,在不同開花時期中雌蕊的揮發性成分含量最高[3,23]‘白蘭地’海棠在4個開花時期中,雌蕊的揮發性成分總釋放量最高,花瓣最低,揮發性成分的總釋放量在盛開期達到最高[24]。岳麓連蕊茶與單體紅山茶花揮發性成分含量在盛開期達到頂峰,且雄蕊是不同花期釋放香氣的主要花器官[25]。本研究表明,‘粉蘊’含笑的花揮發性成分釋放量在花蕾期最高,不同開花時期中花被片的揮發性成分含量最高,其次是雄蕊,雌蕊最低。因此不同的植物花香釋放有不同的規律,可能與吸引不同的傳粉昆蟲有關[26]。‘粉蘊’含笑在3個不同開花時期中,3種花器官的揮發性成分的相對含量并未呈現出規律性的變化。如花被片和雌蕊中醇類化合物在盛開期達到最大值,雄蕊中其在花蕾期達到最大值。花器官不同開花時期的花揮發性成分的變化,可能受光照、溫度和激素的共同影響[27]。

本研究采用頂空固相微萃取與氣質聯用技術(HS-SPME-GC-MS)從‘粉蘊’含笑不同開花時期的不同花器官中共鑒定出93種揮發性物質。2,6,10-三甲基十四烷、異十六(碳)烷、γ-杜松烯和β-異可烯是‘粉蘊’含笑開花過程中的主要揮發性成分,不同花器官的揮發性成分存在差異,花被片是其揮發性成分釋放的主要花器官。本研究為進一步開發利用‘粉蘊’含笑中的揮發性成分提供了數據支持。