基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討槐定堿治療前列腺癌的作用機(jī)制

王 樂,蘆春斌

暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣州 510632

前列腺癌(prostate cancer,PCa)是全球中老年男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。2020年全球男性新發(fā)癌癥病例1 006萬,死亡病例553萬例,其中新發(fā)PCa病例141萬例,死亡病例38萬例,死亡發(fā)病比為27%,而中國(guó)新發(fā)PCa病例12萬,死亡病例5萬,PCa死亡發(fā)病比為41.7%[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2023年研究數(shù)據(jù)表明,PCa患病率居男性惡性腫瘤第一,約占比29%[2]。目前,臨床上治療PCa的方案主要有雄激素剝奪療法、根治性前列腺切除術(shù)、放化療以及分子靶向治療等[3],然而這些治療手段存在諸多副作用,且藥物易產(chǎn)生耐藥,造成部分患者預(yù)后較差,出現(xiàn)復(fù)發(fā)或進(jìn)展[4]。因此,尋找安全有效的PCa治療新藥物具有重要意義。

槐定堿(sophoridine,SRI)主要是從苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)中分離得到的一種四環(huán)喹啉西啶生物堿。研究表明SRI具有諸多的藥理作用,包括抗炎、抗病毒和抗腫瘤等[5]。2005年,鹽酸槐定堿注射液被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床上治療惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤[6]。目前,SRI已被試用于胃腸道腫瘤肝轉(zhuǎn)移的治療[7],同時(shí)大量報(bào)道證實(shí)SRI對(duì)結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌等腫瘤也有較好的抑制作用[8]。然而,SRI對(duì)PCa的影響及其可能的作用機(jī)制還不清楚。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門以經(jīng)典藥理學(xué)、生物信息學(xué),以及計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科理論為基礎(chǔ)的新興學(xué)科,廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)以及藥物作用機(jī)理研究。本文通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究SRI對(duì)DU-145細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究其可能的作用機(jī)制,以期為SRI臨床治療PCa提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及來源

DU-145細(xì)胞來自暨南大學(xué)免疫學(xué)系何賢輝課題組惠贈(zèng)。

1.2 藥品與試劑

SRI(批號(hào)221116,純度>98%,成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司);DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)8122653,美國(guó)Gibco公司);胰酶(批號(hào)2458323,美國(guó)Gibco公司);FBS(批號(hào)12A299,上海吉泰依科賽生物科技有限公司);DMSO(批號(hào)Y190601,美國(guó)MP公司);MTT(批號(hào)829Z056,北京索萊寶科技有限公司);結(jié)晶紫(批號(hào)RS6527B219,上海瑞永生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)AK12112,武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);AG RNAex Pro RNA提取試劑(批號(hào)A4A0616,廣州瑞真生物技術(shù)有限公司);Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液(批號(hào)A5A1512,廣州瑞真生物技術(shù)有限公司);SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒(批號(hào)A5A2693,廣州瑞真生物技術(shù)有限公司);Ki67抗體(批號(hào)AC220907054,武漢賽維爾生物科技有限公司);FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG(批號(hào)CR2203121,武漢賽維爾生物科技有限公司);β-actin抗體(批號(hào)AC230205002,武漢賽維爾生物科技有限公司);GAPDH抗體(批號(hào)AC221016006,武漢賽維爾生物科技有限公司);PCNA抗體(批號(hào)AC230612023,武漢賽維爾生物科技有限公司);Bax抗體(批號(hào)AC230612029,武漢賽維爾生物科技有限公司);p38MAPK抗體(批號(hào)1000220-9,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司);Anti-active+pro Caspase-3 Antibody(批號(hào)H660063003,杭州華安生物技術(shù)有限公司);Bcl-2抗體(批號(hào)10092580,艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司);p-p38MAPK抗體(批號(hào)10049598,艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司);Goat Anti-Rabbit Mouse IgG-HRP(批號(hào)10042368,艾比瑪特醫(yī)藥科技(上海)有限公司);ECL發(fā)光液(批號(hào)2207149,美國(guó)Millipore公司);預(yù)染蛋白marker(10-180 KDa)(批號(hào)00785996,基因生物技術(shù)國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)B1A9001249,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 主要儀器

CCL-170B-8型二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(新加坡ESCO公司);Synergy4型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司);CYTOFLEX型細(xì)胞分析與檢測(cè)系統(tǒng)(中國(guó)貝克曼庫(kù)爾特國(guó)際貿(mào)易有限公司);CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司);GeneGoomeHR型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司);LEICA CW4000型核型分析系統(tǒng)(德國(guó)LEICA公司)等。

1.4 工具與數(shù)據(jù)庫(kù)

1.4.1 工具

微生信在線平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/);Venny2.1.0在線工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);Cytoscape3.9.0軟件;AutoDock1.5.6軟件;PyMol軟件;ImageJ軟件;GraphPad Prism9.0軟件等。

1.4.2 數(shù)據(jù)庫(kù)

TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcmsp-e.com/);HERB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://herb.ac.cn/Detail/?v=HBIN044 394&label=Ingredient);Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/);PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/);Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=Sophoridine);Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/);OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/);GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/);STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/);DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

DU-145細(xì)胞,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,用含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 MTT法檢測(cè)SRI對(duì)DU-145細(xì)胞增殖的影響

SRI用DMEM培養(yǎng)基配成60 mmol/L母液,-20 ℃保存。收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于96孔板,每孔3 000個(gè)細(xì)胞。將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,分別加入0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L的SRI,繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。移除培養(yǎng)基后向每孔加入無血清培養(yǎng)基100 μL和MTT溶液20 μL,繼續(xù)孵育4 h后移除培養(yǎng)基,每孔加入DMSO溶液150 μL進(jìn)行避光搖床震蕩10 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處的吸光度,并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SRI對(duì)DU-145細(xì)胞增殖能力的影響

收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于6孔板,每孔1 000個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI處理細(xì)胞48 h。之后更換正常的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)7 d左右,細(xì)胞集落明顯形成。4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min,1×PBS清洗3次,再用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min,1×PBS清洗3次。風(fēng)干后拍照,使用ImageJ軟件對(duì)細(xì)胞克隆形成數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與量化。

1.5.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SRI對(duì)DU-145細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)的影響

收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于預(yù)先放置細(xì)胞爬片的24孔板中,每孔1×104個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI處理細(xì)胞48 h。1×PBS清洗3次,4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min,1×PBS清洗3次,0.5% Triton100室溫通透20 min,1×PBS清洗3次,5% BSA室溫封閉1 h,Ki67(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,1×PBS清洗3次。二抗(1∶1 000)避光常溫孵育1 h,1×PBS清洗3次,DAPI避光孵育5 min,1×PBS清洗3次,載玻片上滴加適量抗熒光淬滅劑,蓋上細(xì)胞爬片,熒光顯微鏡觀察拍照。使用ImageJ軟件對(duì)DU-145細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與量化。

1.5.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SRI對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響

收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于6孔板中,每孔2×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI處理細(xì)胞48 h。收集培養(yǎng)基和細(xì)胞,低速離心棄上清,加入500 μL 1×Annexin V Binding Buffer重懸細(xì)胞,再加入5 μL Annexin V-FITC Reagent和5 μL PI Reagent,輕輕混勻,避光孵育15 min,上機(jī)檢測(cè)。

1.5.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)SRI治療PCa的作用機(jī)制

通過TCMSP、HERB、PharmMapper和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集SRI的藥理靶點(diǎn)。首先,在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和HERB數(shù)據(jù)庫(kù)輸入SRI的英文名稱,收集藥理靶點(diǎn)。然后,通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SRI的二維結(jié)構(gòu)和Canonical SMILES。將SRI的二維結(jié)構(gòu)上傳到PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置選擇目標(biāo)集:僅限人類蛋白質(zhì)目標(biāo),篩選SRI作用靶點(diǎn)(Z值>0)。同時(shí),將SRI的Canonical SMILES導(dǎo)入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù),并選擇“智人”作為物種,篩選SRI作用靶點(diǎn)(Probably值>0)。接下來,通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)收集的SRI靶點(diǎn)進(jìn)行注釋。最后,將來自TCMSP、HERB、PharmMapper和Swiss Target Prediction四個(gè)不同數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并,刪除重復(fù)靶點(diǎn)。

以“Prostate cancer”為關(guān)鍵詞,在GeneCards(“相關(guān)性評(píng)分”>10)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索PCa靶點(diǎn)。將來自GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)集進(jìn)行合并,剔除重復(fù)靶點(diǎn)。在Venny2.1.0在線工具中分別導(dǎo)入SRI與PCa的作用靶點(diǎn),繪制韋恩圖,可得到SRI與PCa的共同作用靶點(diǎn)。

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將SRI與PCa的共同作用靶點(diǎn)上傳到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中,物種選擇Homo sapiens,設(shè)置最低交互分?jǐn)?shù)大于0.4,其他參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置。然后,我們選擇“隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點(diǎn)”來更新PPI網(wǎng)絡(luò),結(jié)果保存TSV格式文件。運(yùn)行Cytoscape3.9.0軟件,導(dǎo)入TSV格式文件,使用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析,獲得各靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)度(degree值),并根據(jù)蛋白關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序。最后,degree值排名前10的靶點(diǎn)確定為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。將SRI與PCa的共同作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中,默認(rèn)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)參數(shù)設(shè)置。GO富集分析包括生物學(xué)過程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)三部分。GO和KEGG分析都應(yīng)用P<0.01作為截止值,以在每個(gè)類別中選擇高度顯著的富集項(xiàng)。根據(jù)富集靶點(diǎn)的數(shù)量進(jìn)行排序,并使用微生信在線平臺(tái)進(jìn)行繪制KEGG氣泡圖和GO生物學(xué)過程圖。

1.5.7 分子對(duì)接

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得SRI二級(jí)結(jié)構(gòu)文件,導(dǎo)入Chem3D軟件,轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu),并進(jìn)行能量最小化,導(dǎo)出mol2格式文件,命名SRI.mol2。SRI結(jié)構(gòu)文件導(dǎo)入AutoDock1.5.6軟件,進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷處理后,設(shè)置為配體。在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載p38MAPK晶體結(jié)構(gòu)(ID:2FSL),將p38MAPK晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入PyMol軟件,進(jìn)行去水、去配體處理,然后在AutoDock1.5.6軟件中進(jìn)行加氫處理,設(shè)置為受體。將處理后的p38MAPK、SRI文件導(dǎo)入AutoDock1.5.6軟件,采用盲對(duì)接方式,保存對(duì)接盒子參數(shù)。接著運(yùn)行autogrid4,保存dock.dpf文件,最后運(yùn)行autodock,設(shè)置半柔性對(duì)接,對(duì)接次數(shù)50次,結(jié)合能判斷分子與蛋白的結(jié)合程度,再使用PyMol軟件進(jìn)行結(jié)果可視化。

1.5.8 qPCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于6孔板中,每孔2×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI處理細(xì)胞48 h。使用AG RNAex Pro RNA提取試劑提取總RNA,所提取的總RNA用Nano定量,A260/A280>1.8,以隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA于-80 ℃下保存。qPCR引物由生工生物合成,引物序列見表1。qPCR條件為95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。

表1 qPCR引物序列

1.5.9 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集生長(zhǎng)良好的DU-145細(xì)胞,接種于6孔板中,每孔2×105個(gè)細(xì)胞。培養(yǎng)24 h后,分別加入0.35、0.7、1.4 mmol/L的SRI處理細(xì)胞48 h。細(xì)胞裂解液冰上提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜,5% BSA室溫封閉1 h,一抗:GAPDH(1∶2 000)、β-actin(1∶2 000)、p38MAPK(1∶2 000)、p-p38MAPK(1∶2 000)、Anti-active+pro Caspase-3 Antibody(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)、PCNA(1∶2 000),4 ℃冰箱孵育過夜。次日,1×TBST洗膜30 min,每次10 min,用二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,1×TBST洗膜30 min,每次10 min。ECL發(fā)光液顯色后,凝膠成像系統(tǒng)拍照,ImageJ軟件分析量化各條帶灰度值。

1.5.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 SRI抑制DU-145細(xì)胞增殖

為了探究不同濃度SRI對(duì)DU-145細(xì)胞增殖能力的影響,首先采用MTT實(shí)驗(yàn)來確定半數(shù)有效抑制濃度IC50。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,SRI能明顯抑制DU-145細(xì)胞的增殖能力,SRI作用24、48 h的IC50分別為2.47±0.45、1.41±0.17 mmol/L(見圖1)。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)實(shí)驗(yàn)分別用濃度為0.35、0.7和1.4 mmol/L的SRI處理DU-145細(xì)胞48 h。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SRI處理48 h后,與對(duì)照組相比,SRI組能明顯抑制DU-145細(xì)胞集落形成(見圖2)。Ki67免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SRI組DU-145細(xì)胞中Ki67蛋白的表達(dá)較對(duì)照組降低(見圖3)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,增殖相關(guān)基因PCNA、Ki67的mRNA表達(dá)水平下調(diào)(見圖4)。同時(shí)Western blot結(jié)果也證實(shí)PCNA蛋白表達(dá)水平下降(見圖5)。以上結(jié)果均表明SRI能抑制DU-145細(xì)胞的增殖。

圖1 不同濃度槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of different concentrations of SRI on DU-145 cell proliferation

圖2 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.2 Effect of SRI on the clone-forming ability of DU-145 cells

圖3 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞Ki67蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SRI on Ki67 protein expression in DU-145 cells

圖4 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞Ki67、PCNA mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of SRI on Ki67 and PCNA mRNA expression in DU-145 cells

圖5 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞PCNA蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of SRI on PCNA protein expression in DU-145 cells

2.2 SRI促進(jìn)DU-145細(xì)胞的凋亡

為了研究SRI對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響,首先采用流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。SRI處理48 h后,相比于對(duì)照組,隨著SRI濃度增加,DU-145細(xì)胞凋亡率逐漸增加,提示SRI能誘導(dǎo)DU-145細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡(見圖6)。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-7 mRNA表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下調(diào),Bax mRNA表達(dá)水平也有所降低,但Bcl-2/Bax mRNA表達(dá)水平比值是明顯降低的(見圖7)。同時(shí)Western blot結(jié)果也表明cleaved Caspase-3+pro Caspase-3的蛋白表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào),Bax蛋白表達(dá)水平有上調(diào)趨勢(shì),無顯著性差異,Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平比值是明顯降低的(見圖8),表明SRI能促進(jìn)DU-145細(xì)胞的凋亡。

圖6 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of SRI on apoptosis of DU-145 cells

圖7 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effect of SRI on the mRNA expression of apoptosis-related genes in DU-145 cells

圖8 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effect of SRI on the expression of apoptosis-related proteins in DU-145 cells

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 獲取SRI與PCa的共同靶點(diǎn)

為了研究SRI是如何影響DU-145細(xì)胞的增殖與凋亡,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來初步研究其作用機(jī)制。首先獲取SRI的作用靶點(diǎn),通過檢索和收集,在HERB數(shù)據(jù)庫(kù)收集到4個(gè),TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集到2個(gè),PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)收集到68個(gè),Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)收集到56個(gè),去重后得到127個(gè)SRI藥理靶點(diǎn)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集到2 092個(gè)靶點(diǎn),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集447個(gè)靶點(diǎn),去重后得到2 407個(gè)PCa治療靶點(diǎn)。將以上收集的SRI靶點(diǎn)通過Venny2.1.0韋恩圖工具映射至PCa的靶點(diǎn)中,獲得60個(gè)藥物-疾病共同靶點(diǎn)(見圖9)。

圖9 槐定堿與前列腺癌共同靶點(diǎn)韋恩圖Fig.9 Venn diagram of SRI and PCa common targets

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

本研究利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,繪制PPI分析網(wǎng)絡(luò)圖(見圖10)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析得出,該網(wǎng)絡(luò)共有60個(gè)節(jié)點(diǎn),410條邊,平均節(jié)點(diǎn)degree值:13.7,PPI富集P值<1.0e-16。根據(jù)degree值排序,degree值前10的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn),分別是ALB、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、PPARG、MDM2、PGR、MAPK8、NR3C1、ABL1、MAPK14、PARP1、HDAC2、CDK2、GSK3B(見圖10)。

圖10 關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白PPI分析Fig.10 PPI analysis of key target protein

2.3.3 GO與KEGG富集分析

本研究利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO分析富集得到158個(gè)條目(P< 0.01),其中BP涉及基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化等,CC涉及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)等,MF涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性和鋅離子結(jié)合等。圖11展示了GO富集分析每一類別富集靶點(diǎn)數(shù)目前10的條目。KEGG分析富集得到84個(gè)條目(P< 0.01),包括癌癥通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號(hào)通路等。根據(jù)富集靶點(diǎn)數(shù)目進(jìn)行排序,選擇前10個(gè)條目繪制KEGG氣泡圖(見圖12)。SRI可以通過MAPK信號(hào)通路影響PCa細(xì)胞的增殖、凋亡。

圖11 GO富集分析條目條形圖(前10)Fig.11 Bar chart of GO enrichment analysis items (top 10)

圖12 KEGG通路富集分析氣泡圖(前10)Fig.12 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis (top 10)

2.4 SRI通過上調(diào)p38MAPK的表達(dá)影響PCa DU-145的增殖與凋亡

使用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行分析SRI與p38MAPK蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)SRI可以與p38MAPK蛋白(ID:2FSL)的ASP-88殘基形成氫鍵,且結(jié)合能是-6.83 kcal/mol(<-5 kcal/mol),說明SRI與p38MAPK蛋白能穩(wěn)定結(jié)合(見圖13)。本研究進(jìn)一步檢測(cè)DU-145細(xì)胞中p38MAPK的mRNA表達(dá)水平,p38MAPK、p-p38MAPK的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示隨著SRI作用濃度的增加,p38MAPK的mRNA表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)(見圖14),p-p38MAPK蛋白表達(dá)水平發(fā)生上調(diào),p38MAPK蛋白表達(dá)水平無明顯變化趨勢(shì),p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)水平比值增高(見圖15)。提示SRI通過激活p38MAPK來抑制DU-145細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡。

圖13 槐定堿與核心靶點(diǎn)p38MAPK(ID:2FSL)分子對(duì)接Fig.13 Molecular docking of SRI with the core target p38MAPK (ID:2FSL)

圖14 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)的影響Fig.14 Effect of SRI on p38MAPK mRNA expression in DU-145 cells

圖15 槐定堿對(duì)DU-145細(xì)胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.15 Effect of SRI on the expression of p38MAPK and p-p38MAPK proteins in DU-145 cells

3 討論與結(jié)論

PCa是中老年男性中最常見的惡性腫瘤,容易產(chǎn)生耐藥和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致預(yù)后較差、復(fù)發(fā)率高[9],因此,尋求治療PCa新療法變得非常迫切。中藥的天然化學(xué)活性成分在惡性腫瘤的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用[10]。SRI主要是從中藥苦豆子中分離的一種活性生物堿,具有多種藥理活性,其中抗腫瘤活性尤為突出。2005年,鹽酸槐定堿注射液被中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為抗癌藥物[6]。SRI在體內(nèi)和體外對(duì)胃癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸直癌、胰腺癌等多種腫瘤都表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用[8]。SRI可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲、促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡和自噬。其作用與PI3K/AKT、Wnt/B-catenin、MAPK/ERK和細(xì)胞周期等通路有關(guān)[11]。就目前研究而言,SRI對(duì)PCa的作用及其確切機(jī)制仍不完全清楚。本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù),探討SRI治療PCa的分子機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

高增殖率是惡性腫瘤細(xì)胞無限生長(zhǎng)的一個(gè)重要特征,因此抑制細(xì)胞增殖是治療癌癥的有效策略[12]。在本研究中,通過檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞克隆形成發(fā)現(xiàn)隨著SRI作用濃度的增加,DU-145細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制,說明SRI具有抑制DU-145細(xì)胞增殖的能力。增殖細(xì)胞核蛋白Ki67、PCNA是一種細(xì)胞增殖的標(biāo)記蛋白,通常用作癌癥診斷和治療的預(yù)測(cè)和預(yù)后標(biāo)記物[13]。本研究通過免疫熒光以及qPCR檢測(cè)Ki67在DU-145細(xì)胞中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)SRI能明顯抑制Ki67的表達(dá),qPCR以及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SRI能明顯降低DU-145細(xì)胞中PCNA的表達(dá),更進(jìn)一步證明SRI對(duì)DU-145細(xì)胞具有抑制增殖的能力。

細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞死亡的主要原因,因此,逃避細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致腫瘤治療產(chǎn)生抗性[14]。Bcl-2作為凋亡抑制因子在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起決定性作用[15]。Bax是Bcl-2的同源綴合配偶體,是一種促凋亡蛋白,Bcl-2與Bax的比值是衡量細(xì)胞凋亡效應(yīng)的重要指標(biāo)[16]。Caspase-3和Caspase-7是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí),Caspase-3和Caspase-7依次被上游Caspase蛋白裂解并激活。然后,激活的Caspase-3和Caspase-7會(huì)切割多種下游底物,最終引發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。本研究通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SRI處理48 h后DU-145細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果表明SRI能明顯促進(jìn)DU-145細(xì)胞的凋亡。因此,我們進(jìn)一步檢測(cè)了凋亡相關(guān)因子的表達(dá)情況。qPCR結(jié)果表明,SRI能上調(diào)Caspase-3、Caspase-7的mRNA表達(dá),下調(diào)Bcl-2的mRNA表達(dá),Bax的mRNA表達(dá)水平也有所下調(diào),但Bcl-2/Bax的比值是顯著降低的(P<0.05)。此外,Western blot結(jié)果表明SRI能上調(diào)cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá),下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá),雖然Bax蛋白表達(dá)的上調(diào)沒有顯著性差異,但Bcl-2/Bax的蛋白表達(dá)比值明顯降低(P<0.05)。這些結(jié)果提示SRI可以調(diào)控凋亡相關(guān)因子的表達(dá),激活凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)DU-145細(xì)胞發(fā)生凋亡。

此外,為了研究SRI影響DU-145細(xì)胞增殖凋亡的作用機(jī)制,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究手段進(jìn)行分析。我們通過HERB、TCMSP、PharmMapper、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共收集到127個(gè)SRI作用靶點(diǎn),通過Venny2.1.0在線工具獲得60個(gè)SRI作用于PCa的共同靶點(diǎn),通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析得到ALB、TNF、IL6、CASP3、MAPK1、PPARG、MDM2、PGR、MAPK8、NR3C1、ABL1、MAPK14、PARP1、HDAC2、CDK2、GSK3B等16個(gè)核心靶點(diǎn)(degree值前10)。其中MAPK8、CASP3、MAPK1、MAPK14、TNF核心靶點(diǎn)富集到MAPK信號(hào)通路中。GO富集分析得到158個(gè)條目(P< 0.01),結(jié)果顯示SRI可能主要通過調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡過程、蛋白質(zhì)磷酸化以及蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等方面發(fā)揮治療PCa的作用。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示癌癥信號(hào)通路、癌癥中的蛋白聚糖、MAPK信號(hào)通路、化學(xué)癌變-活性氧、PI3K-AKT信號(hào)通路、凋亡等84個(gè)信號(hào)通路(P< 0.01)。其中最令人關(guān)注的是MAPK信號(hào)通路在SRI抗PCa過程中發(fā)揮的作用。分裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)可將細(xì)胞外信息傳遞至細(xì)胞核中,在生理及病理過程中發(fā)揮重要的作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在3類MAPK家族成員:細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-JunN-末端蛋白激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK,也稱MAPK14)[18]。

p38MAPK是一種應(yīng)激活化蛋白激酶,參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生物學(xué)進(jìn)程,其激活后能發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡的作用[19]。研究發(fā)現(xiàn),p38通路激活后可降低BGC-823胃癌細(xì)胞的增殖活力,使細(xì)胞阻滯于G2/M期[20]。激活p38MAPK,可抑制SMMC-7721細(xì)胞增殖,并啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)Caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)最終誘發(fā)凋亡[21]。此外,有研究表明中藥提取物可以激活p38MAPK,觸發(fā)Caspase介導(dǎo)的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)Lewis肺癌細(xì)胞以及HSC-3、SCC-9口腔癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[22,23]。p38MAPK激酶在PCa的發(fā)生和發(fā)展過程中也起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在前列腺上皮的惡性轉(zhuǎn)化或骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌中,激活p38MAPK能抵抗細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡以及腫瘤休眠[24,25]。同時(shí)其他研究表明,多西他賽、熊果酸等成分能增加p38MAPK的磷酸化水平,誘導(dǎo)PCa細(xì)胞發(fā)生衰老,抑制PC-3、22Rv1等多種PCa細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡[26,27]。因此本研究重點(diǎn)關(guān)注了p38MAPK蛋白激酶在SRI抗PCa中發(fā)揮的作用。利用分子對(duì)接技術(shù)驗(yàn)證SRI與p38MAPK蛋白的結(jié)合情況,結(jié)果顯示SRI與p38MAPK蛋白能穩(wěn)定結(jié)合,結(jié)合能是-6.83 kcal/mol。p-p38MAPK、p38MAPK蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明SRI能激活p38MAPK蛋白,p38MAPK蛋白磷酸化水平發(fā)生上調(diào),提示SRI可以通過激活p38MAPK蛋白,誘導(dǎo)凋亡途徑發(fā)揮抗PCa的作用。

綜上,SRI能抑制DU-145細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其凋亡,這可能與其對(duì)p38MAPK的激活作用有關(guān)。然而本研究?jī)H探討SRI在體外對(duì)DU-145細(xì)胞的影響,下一步將進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步深入研究SRI抗PCa的作用機(jī)理。