巨噬細胞極化為M1 型或M2 型對鐵代謝的影響

吳蓮鳳 錢菁菁 詹玲玲 陸紅

巨噬細胞的表型具有可塑性，在不同的微環境作用下，能夠極化為功能狀態截然不同的兩種細胞，如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、IFN-γ 和IL-1β 可誘導巨噬細胞極化為經典激活（M1 型）細胞，而IL-4和IL-13 可誘導巨噬細胞極化為替代激活（M2 型）細胞[1]。其中LPS 和IL-4 為巨噬細胞極化體外實驗常用的誘導劑。近年來，對巨噬細胞在極化過程中代謝譜的相關性研究不斷增多，特別是鐵代謝研究成了學者們的關注熱點，認為巨噬細胞在體內鐵平衡中起著關鍵作用。有研究顯示，炎癥中巨噬細胞通過鐵吸收增加和輸出減少使體內鐵的滯留增加，鐵的積累可進一步誘導巨噬細胞極化為M1 型。M1 型巨噬細胞能產生活性氧、一氧化氮及炎癥因子等殺傷分子，損害鄰近的成纖維細胞，最終導致組織修復能力受損及無法愈合的慢性創傷[2]。同時還發現，M2 型巨噬細胞的條件培養基能更快地維持惡性和非惡性細胞株的生長[3-4]。然而，目前尚不清楚不同極化亞型巨噬細胞鐵穩態的調控模式。本研究使用LPS、IL-4 處理巨噬細胞引起其表型極化，再將誘導后的亞型巨噬細胞與紅細胞和鐵劑共培養，檢測鐵蛋白含量的變化，觀察不同極化亞型巨噬細胞對鐵攝入及存儲的影響，從而為通過調控巨噬細胞極化影響疾病進展提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 小鼠巨噬細胞RAW264.7 細胞系購自中國科學院細胞庫，LPS（批號：IL2020）購自北京索萊寶科技有限公司，IL-4（批號：CK74）購自蘇州近岸生物有限公司，鐵劑（右旋糖酐鐵注射液，批號：316012801）購自浙江天瑞藥業公司，鐵蛋白檢測試劑盒（型號：H129-1-2）購自南京建成生物科技有限公司，兔抗鼠TNF-α 抗體（批號：60291-1-Ig）、精氨酸酶1（arginase 1，Arg-1）抗體（批號：16001-1-AP）和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體（批號：22226-1-AP）均購自美國PeproTech 公司，脫纖維綿羊血（批號：X05002）購自溫州康泰生物技術有限公司，瑞吉染液試劑（批號：BA4017C）購自珠海貝索生物技術有限公司，亞鐵氰化鉀（批號：20210725）購自天津市恒星化學試劑制造有限公司，DMEM 培養基購自美國Gibco 公司，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）購自北京索萊寶科技有限公司，Cy3 山羊抗兔二抗購自美國ProteinTech 公司。緩沖液（磷酸二氫鉀13.28 g/2 L 購自上海聯試化工有限公司、磷酸氫二鈉12.9 g/2 L 購自西隴科學股份有限公司），稀釋鹽酸購自浙江中星化工試劑有限公司，中性紅購自上海三愛思試劑有限公司，光學顯微鏡（型號：ECLIPSE 50i 及Ti-s）購自日本Nikon 公司，激光共聚焦顯微鏡（德國Zeiss 公司，型號：LSM710），凝膠成像儀（型號：Amersham Imager 680）購自美國GE 公司，酶標儀（型號：Infinite M200 PRO）購自瑞士TECAN公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將RAW264.7 細胞置于37 ℃水浴鍋中快速震蕩1～2 min 以解凍，然后置于含有3 mL PBS溶液的15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心5 min（離心半徑10 cm）后棄去上清液，加入DMEM 培養基（含10%滅活PBS 與雙抗）進行重懸浮，細胞濃度約105個/mL，再置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。2～3 d 后更換培養基，待細胞處于對數生長期，細胞濃度約為106個/mL時，加入LPS 20 ng/mL 或IL-4 10 ng/mL 繼續培養24 h，誘導巨噬細胞極化。采用光學顯微鏡觀察誘導后的巨噬細胞形態學變化，并采集圖像。

1.2.2 觀察TNF-α 和Arg-1 表達情況 采用免疫熒光染色法。將極化后的巨噬細胞與TNF-α 抗體（1∶500）或Arg-1抗體（1∶500）在室溫下孵育1 h，隨后與Cy3 山羊抗兔二抗避光孵育1 h。用PBS 洗滌3 次后，將細胞在含有40 mg/mL DAPI的培養基中孵育5 min，隨后在激光共聚焦顯微鏡下采集圖像，觀察誘導后巨噬細胞TNF-α 和Arg-1 表達情況。

1.2.3 TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達水平的檢測 采用Western blot法。將極化后的巨噬細胞經PBS洗滌3 次，加入細胞裂解液裂解細胞后，12 000 r/min 4 ℃離心20 min（離心半徑10 cm）。小心吸出上清液，用BCA 法進行上清液的蛋白質定量。用4%和20%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質樣品，濕轉法將分離膠的蛋白轉移至PVDF 膜上，隨后分別加入抗β-actin（1∶1 000）、TNF-α（1∶1 000）、iNOS（1∶1 000）和Arg-1（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜，第2 天用Cy3 山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，應用超敏曝光液在凝膠成像儀上形成可視化條帶，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參對條帶標準化后對照組相比進行均一化處理，檢測累積光密度值（integrated optical density，IOD）并進行TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達水平的比較。

1.2.4 巨噬細胞吞噬紅細胞實驗 取脫纖維綿羊紅細胞2 μL 分別與極化后的M1 型或M2 型巨噬細胞共培養48 h 后取細胞懸液滴加于玻片上，制備薄血膜片，待玻片充分干燥，滴加瑞吉染液及緩沖液，染色25 min，無菌水沖洗，自然晾干后置于光學顯微鏡下觀察，分別計數1 000 個巨噬細胞，記錄吞噬紅細胞的巨噬細胞數量，并采集圖像。

1.2.5 鐵染色實驗 取鐵劑3 μL 分別與極化的M1 型或M2 型巨噬細胞共培養48 h 后取細胞懸液滴加在玻片上，制備薄血膜，充分干燥后滴加亞鐵氰化鉀與稀釋鹽酸溶液（5∶1）混合液，染色25 min，無菌水沖洗，加入稀釋中性紅溶液復染10 min，無菌水沖洗，待干燥后置于光學顯微鏡下觀察不同極化亞型細胞胞質中吞噬鐵顆粒差異，并采集圖像。鐵顆粒細小、分布稀疏為（±），顆粒約占細胞質1/4 為（+），占細胞質1/4 至1/2 為（++），占細胞質1/2 至3/4 為（+++），布滿整個細胞質為（++++）。

1.2.6 鐵蛋白含量測定 極化的巨噬細胞加入鐵劑共培養，根據說明書采用ELISA 法檢測不同極化亞型巨噬細胞內及細胞培養液中鐵蛋白含量，并使用酶標儀在450 nm 處測量吸光度（A）。將A值傳輸到軟件GraphPad Prism 中，并使用擬合5 個參數的標準曲線計算樣品中鐵蛋白含量。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 統計軟件。計量資料兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS 及IL-4 處理后巨噬細胞的形態學變化 未處理的巨噬細胞胞體規則呈圓形，核染色質細致；LPS處理后巨噬細胞其胞體明顯增大且不規則，細胞質突起易見，胞質量豐富可見空泡，核染色質偏粗，偶見多核；IL-4 處理后巨噬細胞其胞體偏大，胞質量偏多，胞質可見少量突起，核染色質偏細致；見圖1（插頁）。

圖1 LPS 及IL-4 處理后巨噬細胞的形態特點（A：未處理的巨噬細胞；B：LPS 處理后的巨噬細胞；C：IL-4 處理后的巨噬細胞）

2.2 LPS 及IL-4 處理后巨噬細胞TNF-α 和Arg-1 的表達情況 結果顯示，LPS 處理后巨噬細胞表達M1型標志物TNF-α 明顯增加，IL-4 處理后巨噬細胞未見明顯變化，相反表達了M2 型標志物Arg-1 增加，見圖2（插頁）。

圖2 LPS 及IL-4 處理后巨噬細胞TNF-α 及Arg-1 表達差異的免疫熒光染色圖

2.3 LPS 及IL-4 處理后巨噬細胞TNF-α、iNOS 和Arg-1 表達水平的比較 Western blot 結果顯示，LPS 較IL-4處理的巨噬細胞表達M1 型標志物TNF-α 及iNOS 顯著增加（均P＜0.05），而IL-4 較LPS 處理的巨噬細胞表達M2型標志物Arg-1顯著增加（P＜0.01），見圖3。

圖3 LPS及IL-4處理后巨噬細胞TNF-α、iNOS和Arg-1表達的電泳圖及表達水平比較

2.4 M1 型與M2 型巨噬細胞對紅細胞的吞噬作用差異 LPS 處理M1 型巨噬細胞和IL-4 誘導的M2 型巨噬細胞與綿羊紅細胞共培養，經瑞氏染色鏡檢觀察，發現兩者吞噬紅細胞存在差異，M1 型巨噬細胞可見吞噬紅細胞（計數1 000 個巨噬細胞可見3 個吞噬紅細胞)，而M2 型巨噬細胞未見吞噬紅細胞（計數1 000 個巨噬細胞未見吞噬血細胞），見圖4（插頁）。

圖4 LPS 及IL-4 誘導不同極化亞型巨噬細胞吞噬紅細胞差異效果圖[A、C：未處理的巨噬細胞及IL-4 誘導的M2 型巨噬細胞未見吞噬紅細胞細胞；B：LPS 誘導的M1 型巨噬細胞可見吞噬紅細胞（箭頭所示）]

2.5 M1 型與M2 型巨噬細胞對鐵的攝入差異 經鐵染色鏡檢觀察，未處理巨噬細胞鐵染色陽性程度（±）；M1 型巨噬細胞吞噬藍色鐵顆粒明顯增多，鐵染色陽性程度為（++）至（+++），明顯高于M2 型巨噬細胞鐵染色陽性程度（+），說明M1 型巨噬細胞鐵攝入高于M2 型巨噬細胞，表現出固鐵優勢，見圖5（插頁）。

圖5 LPS 及IL-4 處理后不同極化亞型巨噬細胞對鐵攝入差異效果圖（A：未處理巨噬細胞鐵染色陽性程度；B：LPS 處理后M1 型巨噬細胞鐵染色陽性程度；C：IL-4 處理后M2 型巨噬細胞鐵染色陽性程度）

2.6 M1 型與M2 型巨噬細胞胞內及細胞培養液鐵蛋白含量的比較 結果發現，M1 型巨噬細胞鐵蛋白含量明顯高于M2 型巨噬細胞，差異有統計學意義（P＜0.05）。同時細胞培養液鐵蛋白含量低于M2 型（P＜0.05），進一步證實M1 型巨噬細胞的合成儲存鐵增加，表現出固鐵優勢，見圖6。

圖6 LPS 及IL-4 處理后不同極化亞型巨噬細胞細胞內及培養液中鐵蛋白含量的比較

3 討論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞，在不同微環境的刺激下可以形成不同極化亞型，不同極化亞型巨噬細胞在功能上存在異質性，M1 型巨噬細胞主要表現為促進炎癥反應并清除病原體作用，M2 型巨噬細胞表現為抑制炎癥反應并組織修復作用[5-6]。研究發現，LPS及IL-4 分別誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7 在形態上可見明顯差異，LPS 誘導的巨噬細胞胞體明顯增大且不規則，細胞質突起易見，胞質量豐富可見空泡，核染色質偏粗，偶見多核；IL-4 誘導的巨噬細胞其胞體偏大，胞質量偏多，胞質可見少量突起，核染色質偏細致。LPS 較IL-4 誘導的巨噬細胞表現更突出的多形性。同時LPS 誘導的巨噬細胞表達M1 型標志物炎癥因子TNF-α 及促進氧和氮自由基生成的酶iNOS 顯著增高，相反，IL-4 誘導巨噬細胞Arg-1 表達增加，兩組比較差異均有統計學意義，實驗成功利用LPS 及IL-4 誘導巨噬細胞極化為M1 型及M2 型。

鐵是機體必須營養物質，是細胞多種生理過程的重要輔助因子。而巨噬細胞在機體鐵代謝的調節過程中起到非常重要的作用。一方面巨噬細胞可以通過吞噬衰老紅細胞，回收紅細胞內的鐵影響鐵的吸收，另一方面通過調控胞內鐵的可用性影響鐵的儲存和釋放[7-8]。但是不同亞型巨噬細胞在鐵代謝過程中表現明顯不同，實驗中發現，通過紅細胞和鐵劑共培養觀察，LPS 誘導的M1 型巨噬細胞可見吞噬紅細胞并且胞內著色鐵顆粒明顯增多，而M2 型巨噬細胞未見吞噬紅細胞且胞內鐵顆粒較少，顯示了LPS 誘導的M1型巨噬細胞較IL-4 誘導M2 型對鐵的攝入增加。筆者還發現LPS 誘導極化的M1 型巨噬細胞胞內鐵蛋白含量明顯高于IL-4 誘導極化的M2 型巨噬細胞，差異有統計學意義，證實了LPS 誘導極化的M1 型巨噬細胞對鐵儲存增加，而M2 型并未見明顯增加。說明不同極化亞型巨噬細胞在鐵代謝過程中存在明顯差異，即M1亞型巨噬細胞對鐵攝入和儲存明顯增加，與M2 型巨噬細胞相比有明顯固鐵優勢，與國內相關學者研究相符[9]。在炎癥性疾病中，鐵在網狀內皮系統中的滯留是機體鐵穩態對炎癥的主要反應，被認為是宿主阻止入侵病原體的重要作用[10]。但是同時這也限制了紅系祖細胞的鐵供應，并可能導致炎癥相關貧血的常見情況[11-13]。早期的實驗中發現，大鼠腎組織炎癥損傷和修復過程中，M1 型巨噬細胞可以誘導早期損傷，而M2型巨噬細胞參與損傷后的纖維修復[14]，極化的M1 型巨噬細胞對鐵吸收和滯留明顯增加，鐵的積累導致M1型巨噬細胞的進一步極化，繼續誘導活性氧及一氧化氮的合成，并釋放各種炎癥因子，造成組織炎癥損傷加重，難于修復[15]。由此可見，調控不同極化亞型巨噬細胞的鐵代謝，有望成為治療慢性炎癥性疾病等重要切入點，也是后續研究的重點。

綜上所述，本研究從形態改變及免疫方法等多種方式，利用LPS 及IL-4 成功的誘導巨噬細胞極化為不同亞型，且不同亞型的巨噬細胞對鐵代謝表現不同，LPS 誘導的M1 型巨噬細胞較IL-4 誘導M2 型巨噬細胞有明顯固鐵優勢。而導致極化巨噬細胞胞內和胞外鐵的有效性及其微環境的差異可以直接影響相鄰組織細胞增殖、分化甚至損傷等，所以明確不同極化亞型巨噬細胞對鐵代謝差異性調節，可為了解其在病理生理條件下的作用提供了理論依據，為臨床應用提供新的治療策略。