外泌體在肝病中應用的研究進展*

黃華萍 周曉玲

1.廣西中醫藥大學研究生院 (廣西 南寧, 530200) 2.柳州市中醫醫院

1 外泌體的特征及功能

人體中所有細胞都可以分泌脂質雙層膜包裹的,可穿過生物屏障進入細胞的囊泡群[1]。分泌的細胞囊泡群可根據其大小分為外泌體、微泡以及凋亡小體,其中外泌體是一種由細胞內多囊泡與細胞膜分離形成并釋放到細胞外,攜帶一系列復雜生物活性物質,如蛋白質、miRNA、DNA和糖脂等,進入細胞參與生理活動,直徑為30～150 nm大小的小膜結合囊泡,可通過標志物和蛋白質區分外泌體與微泡和凋亡小體[2,3]。

外泌體與靶細胞相互作用方式各不相同,其中主要的是:①通過內吞作用在細胞之間起到傳遞信息、細胞間物質交換、新陳代謝、免疫調節和促進免疫細胞的歸巢等功能[4],例如與琥珀酰亞胺酯(pHrodo)標記的外泌體共同培養的樹突狀細胞(DC)出現了熒光紅色[5];使用光學顯微鏡觀察人胚腎上皮細胞(HEK293T)與含GFP-CD63外泌體(GFP-CD63 EV)共同培育后的細胞質發現細胞質中出現點狀染色模式,且在此基礎上使用發動蛋白(dynamin)抑制劑,出現外泌體的被攝取率減少[6],由上證據可知外泌體通過內吞作用作用于靶細胞;②外泌體因攜帶的物質不同而具有多種不同的活性,如調節免疫、抗凝抗炎等,例如在上皮和內皮細胞衍生的外泌體與Flt3+或Tie2+肺泡巨噬細胞(AM)的培養基共同培養后發現,上皮和內皮細胞衍生的外泌體通過抑制蛋白信號調節因子1(RGS1)來調節AM亞群的免疫表型來達到調節免疫、抗炎等作用[7];人臍帶間充質干細胞分泌的含miR-455-3p的外泌體在肝臟內通過抑制枯否細胞活化和炎性因子分泌來達到改善肝臟以及全身炎癥反應的目的[8];③外泌體可能可作為潛在的特性高的診斷工具,起到診斷標志物的作用,例如HCC細胞旁分泌的外泌體miR-21通過激活癌癥相關成纖維細胞并促進癌癥進展,說明外泌體miR-21可能成為肝細胞癌的新的標志物[9,10]。

肝硬化、肝衰竭、肝癌的發病機制復雜,目前尚未完全明確,但與環境、代謝、遺傳等密切相關,其治療也會受到許多原因限制,如自身免疫、經濟條件等,由此迫切需要找到新的治療方式。外泌體對于肝病的作用及其治療潛力是巨大的,許多證據表明,在受損程度不同的肝臟中,釋放的外泌體種類、含量也會有所不同,因此外泌體可能成為肝病中新的標志物,便于臨床中對疾病更早更準確的診斷,也可通過外泌體介導細胞間通訊、物質交換等作用參與肝病的生理病理的過程中,實現對肝硬化、肝衰竭、肝癌等一系列肝病的干細胞治療[11,12]。

2 外泌體與肝病

2.1 外泌體與肝硬化 肝硬化是一種由多種慢性肝病發展而成的病理階段[13]。有研究證明,肝硬化發展到一定程度,將無法通過消除致病因素促進肝纖維化的消退,但由于人體的肝臟具有較高的再生能力,肝硬化初期可通過消除致病因素使肝纖維化消退,恢復部分肝功能,因此我們可以無細胞療法干預肝硬化的進程[14]。肝纖維化過程為細胞外基質過度沉積,是肝臟組織損傷和修復的病理反應,多因藥物、酒精、病毒以及自身免疫或代謝性疾病所引起;肝臟中多種細胞均參與此病理過程,包括肝星狀細胞(HSC)、成纖維細胞和枯否細胞等[15]。其中星狀細胞被激活和轉化為肌成纖維細胞,并且通過自分泌和旁分泌不斷地釋放細胞因子,促進自身增殖和活化,并分泌膠原纖維,是肝纖維化形成的關鍵過程[16]。在實驗研究中表明,Wnt/β-catenin信號通路通過特定基因的轉錄,特別是WISP1和Cyclin D1,在肝星狀細胞增殖、轉移和細胞外基質形成過程中起重要作用[17];人骨髓間充質干細胞分泌的外泌體(hBM-MSCs-Ex)通過抑制Wnt/β-catenin信號通路導致 HSC 活化的下調,并最終減少肝纖維化[18]。在CCl4誘導的肝纖維化老鼠模型中,通過血清檢測法檢測干細胞、外泌體的治療組血清發現谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBil)、堿性磷酸酶(ALP)和γ-轉肽酶(γ-GT)的水平較未處理組顯著降低,且血清總蛋白(TP)的血清水平較未處理組高,提示干細胞、外泌體的治療組肝功能增高;此外,外泌體治療組與干細胞治療組相比,外泌體治療組的表面肝纖維化指標顯著降低,表明外泌體治療組的效果較干細胞治療組的效果明顯[19]。

另有研究表明,在肝纖維化過程中,信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)是關鍵調節因子,其參與肝星狀細胞和成纖維細胞向肌成纖維細胞樣表型的轉化[20-22]。HBM-MSCs-Ex靶向STAT3,表達嗜肝性,且與STAT3形成iExosiRNA-STAT3和 iExomASO-STAT3,抑制STAT3信號通路,可有效抑制肝纖維化形成[23]。

2.2 外泌體與肝衰竭 肝衰竭與肝硬化均可由慢性乙型肝炎病毒引起,二者不同之處在于目前可應用的常規治療手段中,肝硬化的治療中目前尚缺少有效驗證的藥物,多以治療原發病為主,而肝衰竭患者可通過自身肝臟再生能力而存活[24]。臨床上常用甲胎蛋白(AFP)作為判斷肝臟再生的標志物,但其也可作為肝臟腫瘤、生殖細胞腫瘤標志物。其余標志物均在肝臟中過分表達,缺乏特異性。許多實驗研究表明, 源自肝細胞本身的外泌體所攜帶的蛋白質、RNA或microRNA,隨著肝臟疾病的不同病理特征展現出不一樣的水平波動,可能成為作為不同肝病的潛在標志物[25]。在實驗研究中,通過圖像流式細胞術檢測對照組、慢性乙型病毒性肝炎患者(CHB)和慢加急性肝衰竭(ACLF)患者的血清水平發現,ACLF患者和CHB患者較對照組血清中含白蛋白(ALB)和CD63的外泌體百分比升高,由此可推測源自于肝細胞含有ALB和CD63的外泌體可作為ACLF、CHB的預警標志物;亦發現含有ALB 、CD63和VEGF的外泌體百分比在CHB中增加,但在ACLF中減少,且在ACLF患者死亡組與存活組的血清比較中,存活組血清含CD63、ALB及VEGF的外泌體比死亡組百分比高,含CD63、ALB的外泌體百分比在兩者之間無差異,故可推測可能具有ALB、VEGF的肝源性外泌體可作為肝臟再生及預后評估的特異性高的新標記物[26]。

急性肝衰竭(AHF)多以黃疸、凝血功能障礙以及多器官衰竭為主要臨床表現,由全身炎癥反應綜合征引起的高死亡率的一種疾病,其刺激因素多以肝細胞死亡為主[27]。研究發現,脂多糖/D-氨基半乳糖(LPS/D-GalN)誘導的急性肝衰竭小鼠模型中,脂多糖(LPS)與Toll樣受體4 (TLR4)/CD14 復合物結合,通過Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子 (JAK/STAT) 或核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(NF-κB)等通路激活炎性因子導致肝臟炎性病變及肝細胞死亡,引起急性肝衰竭[28,29]。其中,誘導的炎性因子以NLRP3炎性小體(NLRP3)、白細胞介素1b(IL-1b)和半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)為主,三者為肝臟炎癥損傷決定因素[30]。在動物實驗研究中,通過對肝臟組織進行H&E 染色,羊膜間質干細胞旁分泌的外泌體(hAMSC-Exos)在LPS/D-GalN誘導的AHF小鼠模型組與對照組相比,模型組肝臟組織損傷較對照組減輕,其中包括細胞壞死、炎性滲出以及組織出血均減輕,且在通過兩者的血清檢測中可得,模型組的肝酶水平較對照低;LPS/D-GalN誘導的AHF小鼠模型組中的NLRP3和caspase-1水平顯著比對照組水平減弱,以及模型組血清中IL-1b和白細胞介素6(IL-6)等炎癥因子明顯降低。由此可知,羊膜間質干細胞衍生的外泌體可能通過調節NLRP3 和Caspase-1改善急性肝衰竭的炎癥反應。此外,在HAMSC-Exos與LPS刺激的巨噬細胞體外培養的實驗中表明,外泌體降低了NLRP3、IL-1b和IL-6等炎癥因子的活化,也證明了外泌體可能通過調節NLRP3改善LPS/D-GalN誘導的急性肝衰竭小鼠模型的炎癥反應[31-33]。

2.3 外泌體與肝癌 肝細胞癌(HCC)是常見癌癥之一,其多以慢性肝病以及肝硬化為基礎發病,病程進展快,其確診時多發展為癌癥晚期。肝細胞癌早期診斷的實驗室檢驗標志物多以血清中的甲胎蛋白為主,特異性不高,確定新的具體的特異性高的肝細胞癌標志物更有利于發現早期腫瘤[34]。有許多證據表明腫瘤多位于腫瘤上皮細胞改變的復雜內環境,其中包括非惡性的細胞類型改變,這些細胞類型改變可以通過旁分泌機制分泌外泌體、囊泡、促血管生成因子等細胞因子,并在肝臟內表達[35]。在HCC中,源自腫瘤細胞的高水平外泌體可攜帶腫瘤相關抗原或源自肝細胞的蛋白質、mRNA、miRNA 和 lncRNA等相關生物活性分子,且不同的病理階段和生理環境下其含量以及種類都有所不同,可能成為新的潛在的腫瘤標志物,有助于臨床上對腫瘤早期的非創傷性診斷[36,37]。在動物實驗研究中,通過對進行缺乏膽堿、低蛋氨酸和氨基酸確定的飲食(CDAA飲食)喂養與膽堿充足和氨基酸確定的飲食(CSAA飲食)喂養的不同時期小鼠模型組的血清使用微陣列分析所得結果相比較,在喂養CDAA飲食模型組的第6、18、32 和65周的小鼠中大約有30個miRNA的失調;并且通過實時RT-PCR對CDAA飲食的小鼠模型組進行分析結果顯示由炎癥介質誘導的含miR-155外泌體在不同時期的含量均比對照組水平升高,其結果可以確定參與飲食誘導的肝癌發生的含miR-155的外泌體成為特異性高的新的可能標靶[38- 41]。

目前,HCC的治療手段多以全身化療、射頻消融術、手術切除或肝移植為主,晚期肝癌治療手段更是有限。隨著當前科學技術的不斷發展,在治療手段上多向無細胞治療發展[10,42]。在實驗中將富含AFP的樹突狀細胞旁分泌的外泌體(DEXAFP)連續26天通過尾靜脈注射到原位肝細胞癌的小鼠模型中,其實驗結果發現表達γ-干擾素(IFN-γ)的CD8+ T淋巴細胞明顯增加以及白細胞介素-2(IL-2)和IFN-γ水平明顯升高,并且CD25+Foxp3+減少調節性T細胞(Treg)和降低腫瘤的白介素-10(IL-10)和轉化生長因子-β(TGF-β)水平,且在注射DEXAFP治療周期的不同時間點中對模型組小鼠進行動態觀察發現腫瘤微環境的變化與免疫微環境的變化呈正相關,以上現象可表明模型組小鼠體內的腫瘤微環境得到改善,以及證明DEXAFP在原位HCC的小鼠中可以引起抗原特異性的免疫反應、明顯的延緩腫瘤的生長及提高HCC小鼠存活率[43-45]。在HCC患者的化學治療及免疫治療中會因體質差、免疫功能降低或耐藥性增加等自身條件而出現治療效果不佳的情況,針對這些出現的情況,許多研究者發現可通過外泌體介導藥物進行靶點治療,且治療效果可觀。其通過電穿孔法將去甲斑蝥素(NCTD)加載至骨髓間充質干細胞分泌的外泌體(BMSC-Exos)中形成Exos-NCTD,并將其通過尾靜脈注射至HCC小鼠模型中,治療結束后可發現,與NCTD治療對照組相比較,Exos-NCTD組小鼠的腫瘤重量較輕,且腫瘤細胞發生了明顯的細胞核縮小和細胞密度低等形態學上的改變,表明在使用Exos-NCTD治療過程中腫瘤細胞受到了抑制。在動物實驗中還發現NCTD治療HCC小鼠時,小鼠肝臟和腎臟受到一定程度的損害,但Exos-NCTD治療組中未見明顯器官受損,這表明外泌體介導藥物進行靶向治療與藥物直接治療相比較更安全,療效更好[46- 48]。

3 中醫藥聯合外泌體治療肝病

隨著干細胞療法的興起,研究者們也將中醫藥與干細胞療法相結合,特別是外泌體結合中藥治療肝纖維化、肝癌等。例如,將NCTD與BMSC-Exos共同放入電穿孔杯,通過電穿孔法將藥物載入外泌體,形成Exos-NCTD,并且將其注入老鼠體內,實驗結果顯示Exos-NCTD在體內可表現出對HCC引起肝臟損害的修復[46,49]。另有實驗表明,LPS誘導的巨噬細胞外泌體通過細胞內TGF-β1/Smad信號通路激活肝星狀細胞活化促進肝纖維化,使用黃芪總苷、甘草酸預處理可以有效對巨噬細胞外泌體對細胞內TGF-β1/Smad信號通路活化,從而減輕肝纖維化[50]。

4 總結

基于干細胞移植治療慢性肝病的研究基礎,通過干細胞旁分泌的外泌體治療肝病也得到了實驗研究。雖然國內外的很多研究者都對外泌體進行了動物實驗研究,且取得了一定的研究成果,但外泌體在臨床應用之前尚存在許多問題,如外泌體的來源、提取保存、治療所需要的劑量、使用方法等尚不能統一,缺乏大樣本、大中心的隨機對照數據以及證據等級需要進一步的提升。在疾病診斷方面,外泌體顯現出了較高的特異性,具有一定的應用價值,但在檢測疾病發展過程中特異性的外泌體的過程復雜和技術尚未成熟。隨著時代的發展,科學技術的發展也將逐步成熟,應用外泌體的干細胞治療方式將會更加安全、有效、便捷,這也更加需要我們對外泌體治療各種慢性肝病的機制及臨床應用進行更深入的研究,以更快的使其應用在臨床上,解決更多的臨床問題。