塊菌多糖的提取、結構、功能及應用研究進展

李 盼 曾祥權 李倩倩 李 健

塊菌(Tuber)為盤菌目塊菌科塊菌屬的一類生長于地下的真菌,屬于子囊菌(Ascomycota),是兩大類松露(Truffle)之一。松露可分為塊菌和沙漠松露兩大類,而塊菌通常被認為是盤菌目中“真正的”松露[1],在澳大利亞、新西蘭、中國和許多歐洲國家(如法國、意大利、英國、西班牙和克羅地亞)均有生長[2]。塊菌孢子通常定植于樹木或灌木的根部,形成外生菌根。宿主植物可以通過光合作用為塊菌提供碳水化合物,而真菌促進宿主植物水和礦物質的吸收,同時釋放生長素類激素吲哚-3-乙酸(IAA)和乙烯,促進宿主植物的根生長[3],二者互惠共生。塊菌子實體常呈直徑為2～10 cm的橢圓形或不規則圓形,顏色為黃褐色、深咖色或黑褐色,外表面裝飾著明顯的突疣,多為圓鈍型或錐型,這些突疣被深網狀的溝縫細痕分隔,而內表面具有深棕色和白色靜脈結構[4]。塊菌的種類繁多,主要分為黑袍塊菌(Tubermelanosporum)、夏塊菌(Tuberaestivum)、白麓塊菌(Tubermagnatum)、中國塊菌(Tubersinense)、印度塊菌(Tuberindicum)、攀枝花塊菌(Tuberpanzhihuanense)、假凹陷塊菌(Tuberpseudoexcavatum)、結核塊菌(Tuberregium)、白松露(Tuberborchii)等,其中T.melanosporum、T.aestivum和T.magnatum在市場上的銷售量最高。塊菌中富含多種營養及生物活性成分,包括蛋白質、多糖、多酚、游離氨基酸、礦物質和不飽和脂肪酸等[1],具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗抑郁和免疫調節等生物活性[5],近年來,真菌多糖被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等行業。

文章擬對塊菌多糖的提取工藝、化學結構、功能活性及其在食品加工中的應用進行系統概述,以期為未來塊菌多糖在食品工業中的推廣應用提供依據。

1 塊菌多糖的提取工藝

1.1 溶劑提取法

溶劑提取法是基于相似相溶的原理將目標化合物從混合組分中分離出來,具有經濟、便捷的優點。但與此同時,溶劑提取法也存在耗時長和提取效率低的缺點。對于塊菌多糖來說,常用的提取溶劑包括熱水、堿、酸等。Wu等[6]分別采用熱水提取法和堿提取法提取T.regium多糖,兩種溶劑提取的多糖組分W-PTR和A-PTR在顏色、溶解度、單糖和分子質量上均存在顯著差異,且W-PTP的總糖含量(0.788 mg/mL)約為A-PTP(0.478 mg/mL)的2倍。Zhao等[7]優化了熱水提取T.sinense塊菌子實體多糖的工藝條件,其最佳條件為提取溫度94.75 ℃、料液比1∶16.41 (g/mL)、提取時間2.67 h,此條件下塊菌多糖提取率為10.44%。孔慶龍等[8]發現熱水浸提法提取T.indicum多糖的最佳工藝條件為提取溫度94.68 ℃、提取時間3.71 h、料液比1∶58.66 (g/mL),此時塊菌多糖提取率為10.8%。岳金玫等[9]發現熱水浸提法提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時間60 min、料液比1∶33 (g/mL),此時多糖提取率高達13.32%,提取物中多糖含量為71.55%。

1.2 超聲輔助提取法

超聲輔助提取法主要通過機械作用、熱作用和空化作用破壞塊菌細胞壁,使多糖組分從破裂細胞中釋放出來,具有操作簡便、耗時少、提取效率高、提取溫度低等優點。Mudliyar等[10]研究表明,超聲輔助提取T.aestivum多糖的最佳工藝條件為pH 6.5、振幅25%、液固比75∶1 (mL/g)、提取時間15 min,此條件下的提取率為(68.91±1.54)%。黃治國等[11]優化了超聲波輔助提取法提取攀枝花塊菌多糖的工藝條件,得到最優方案為料液比1∶30 (g/mL)、超聲波處理溫度40 ℃、超聲波處理功率100 W、超聲波處理時間60 min,其提取率可達17.86%。蒲彪等[12]研究表明,超聲輔助提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為超聲功率140 W、超聲處理時間36 min、超聲處理溫度50 ℃、料液比1∶40 (g/mL),此時塊菌多糖提取率為18.15%。與單純的溶劑提取法相比,超聲輔助提取法顯著提升了塊菌多糖的提取率。

1.3 微波輔助提取法

微波輔助提取法是利用微波產生的高頻輻射,將塊菌細胞組織擊穿,從而使組織內部的多糖溶解出來。與此同時,塊菌細胞組織吸收微波輻射轉變的微波能,使組織溫度迅速升高,加速細胞組織分解,從而使多糖類物質更快速地釋放出來。清源[13]確定了微波提取塊菌多糖的最佳工藝條件為微波功率320 W、料液比1∶40 (g/mL)、微波時間200 min,此條件下的多糖提取率高達15.54%。Guan等[14]設置微波輔助提取參數為微波功率280 W、溫度70 ℃、微波輔助提取5 min提取T.aestivum和T.melanosporum多糖,進一步分離純化后得到T.aestivum和T.melanosporum多糖組分TAP和TMP分別為12.97%和11.47%。

1.4 酶輔助提取法

酶輔助提取法是基于酶的水解作用對塊菌細胞壁進行降解,使多糖組分溶于溶劑中,從而達到萃取的目的。相較于溶劑提取法,酶輔助提取法對環境更為友好,是綠色提取工藝之一。而用于食用菌多糖提取的常見消化酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等[15-17]。Bhotmange等[18]采用復合酶輔助提取法提取了T.aestivum多糖,其最佳提取條件為木瓜蛋白酶1.0%、胰蛋白酶1.0%、果膠酶2.0%、提取時間90 min、pH 6.0、提取溫度50 ℃,此條件下多糖得率為46.91%。清源等[19]確定了T.indicum多糖的酶法最佳提取工藝為m中性蛋白酶∶m纖維素酶=1∶7、酶用量3.6%、酶解溫度41 ℃、酶解時間48 min、料液比1∶29 (g/mL)、pH 4.8,多糖的得率和含量分別為14.5%和75.96%。岳金玫等[20]研究發現,酶輔助提取攀枝花塊菌多糖的最佳工藝條件為pH 5.6、酶解時間65 min、酶解溫度61 ℃、木瓜蛋白酶添加量1.6%,此時多糖提取率為14.31%,多糖含量高達74.96%。此外,岳金玫[21]還考察了4種塊菌多糖提取方法(熱水浸提法、酶輔助提取法、超聲波輔助提取法以及超聲波協同酶法)對提取率的影響,發現酶輔助提取法(14.31%)、超聲波輔助提取法(18.15%)相較于傳統的熱水浸提法(13.32%)均能提高塊菌多糖的提取率,而超聲波協同酶法(20.91%)提取塊菌多糖的提取率為熱水提取法的1.6倍。

1.5 加壓液相萃取法

加壓液相萃取法是在密閉容器內,通過升高壓力使溶劑快速充滿萃取池以加速塊菌多糖的萃取,同時提高溫度以增加塊菌多糖在溶劑中的溶解度。Tejedor-Calvo等[22]研究表明,加壓液相萃取法提取T.aestivum多糖的最佳工藝條件為溶劑中V水∶V乙醇=1∶1,提取溫度180 ℃,提取時間30 min,所提取的塊菌多糖含量最高為69.3%。目前,借助加壓液相萃取法提取塊菌多糖的相關研究較少,后續可以進一步擴大該技術的應用范圍。

2 塊菌多糖的化學結構

如表1所示,目前國內外對塊菌多糖化學結構的研究主要圍繞不同種類塊菌多糖的分子質量、單糖組成及比例、單糖殘基的連接方式及構型、多糖構型等方面展開,并借助氣相色譜—質譜(GC-MS)連用、核磁共振(NMR)、高效液相色譜法(HPLC)、高效凝膠滲透色譜(HPGPC)、體積排阻色譜(VEC)、紫外可見光譜法(UV-Vis)和傅里葉紅外光譜法(FT-IR)等技術對塊菌多糖的化學結構進行表征。不同塊菌來源的多糖具有不同的單糖組成、連接單元和分子質量。其中,塊菌多糖的分子質量范圍為5.13～2.18×104kDa,塊菌的品種、生長環境、提取方法、純化步驟等均會導致塊菌多糖分子質量的差異。此外,從塊菌中提取得到的多種不同的塊菌多糖,其單糖組成通常由不同摩爾比的 Rha、Man、Glc和Gal組成,各單糖殘基主要通過1,6-、1,4-以及1,3-等連接。不同塊菌多糖的糖苷鍵構型主要為α構型,部分同時存在α構型和β構型,且絕大多數塊菌多糖為吡喃糖。

表1 塊菌多糖的化學結構?

3 塊菌多糖的功能活性

如表2所示,塊菌多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖和免疫調節等功能活性,與其獨特的化學結構密切相關。

表2 塊菌多糖的功能活性

3.1 抗氧化活性

不同分子質量塊菌多糖的抗氧化活性也存在一定差異。岳金玫[21]對攀枝花產印度塊菌粗多糖進行超濾,分離得到了3種不同分子質量的塊菌多糖組分TIP-Ⅰ(<50 kDa)、TIP-Ⅱ(50～100 kDa)和TIP-Ⅲ(>100 kDa),3種多糖組分的抗氧化能力與其分子質量大小緊密相關,總還原能力和自由基清除能力大小順序為TIP-Ⅲ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅰ,螯合鐵離子能力大小順序為TIP-Ⅰ>TIP-Ⅱ>TIP-Ⅲ。

3.2 抗腫瘤活性

近年來,塊菌多糖被證明具有一定的抗癌作用,與其抑制瘤細胞生長或誘導腫瘤細胞死亡的作用有關。Tao等[34]從T.regium中提取的水溶性超支化β-葡聚糖,編碼為TM3b,在體內和體外均顯示出有效的抗腫瘤活性,可以抑制肝癌細胞系HepG2細胞的生長。而Zhao等[35]從3個塊菌子實體(T.indicum,T.himalayense,T.sinense)和4個塊菌發酵體系(T.melanosporum,T.indicum,T.sinense,T.aestivum)中分離出52個多糖組分,各多糖組分對HepG2、A549、HCT-116、SK-BR-3和HL-60細胞增殖的抑制作用表現出明顯的劑量依賴性。其中,從塊菌發酵體系中分離出的多糖的最大細胞生長抑制率為69.95%,比從塊菌子實體中分離出的高約16%,可能是塊菌發酵體系分離出的多糖中β-D-葡聚糖的三螺旋構象在增強抗腫瘤活性方面發揮了重要作用。此外,通過分析其多糖組分的分子結構發現,過高的重均分子質量還可能會削弱抗腫瘤活性。

3.3 降血糖活性

多糖的降血糖活性通常與其對相關消化酶以及肝臟糖代謝過程中相關酶表達的抑制作用有關[36]。魏鑫悅等[37]測定了攀枝花塊菌多糖的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的體外抑制作用,發現多糖組分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的IC50值分別為1.99,3.30 mg/mL。Huang等[38]從T.regium菌株發酵菌絲體中提取得到3種多糖組分1P、2P和3P,可以顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖水平和糖化血紅蛋白(HbA1c)水平,恢復糖尿病大鼠的胰島素水平,且1P降低血糖作用比2P和3P的更明顯。塊菌多糖的降血糖作用可能歸因于其抗氧化能力,在減少胰島B細胞損傷和恢復胰島素水平方面起關鍵作用。

3.4 抗疲勞活性

塊菌多糖可以通過提高機體的糖原含量、提高機體肌肉組織中相關乳酸清除酶的活性、緩解機體蛋白質、氨基酸的分解代謝以及緩解機體氧化損傷來達到一定的抗疲勞效果。馬寧[39]對印度塊菌多糖EPT進行了體內抗疲勞試驗,發現高劑量(3 g/kg BW)EPT處理能顯著提高小鼠的力竭游泳時間,使游泳小鼠的肝糖原、肌糖原含量恢復到正常水平。EPT還能顯著提高小鼠組織細胞中的乳酸脫氫酶活性,加速肌肉中乳酸的清除代謝,防止肌肉中乳酸積累,降低小鼠血清中肌酸激酶活性、力竭游泳后小鼠的肌肉損傷程度、血清中尿素氮水平和機體蛋白質和氨基酸的分解代謝,從而減緩肌肉力量的降低。此外,EPT處理還可明顯降低小鼠血清中羥自由基含量,血清、肌肉、肝臟中的丙二醛含量,增加小鼠血清中脂肪酸水平,說明塊菌多糖能防止自由基造成的細胞結構和功能的損傷,利用脂肪酸氧化供能,從而減少肌糖原無氧酵解產生乳酸,達到一定的抗疲勞效果。李陸[40]通過印度塊菌多糖灌胃小鼠的負重力竭游泳試驗探究了塊菌多糖的運動抗疲勞效果。研究表明,高、中、低3種劑量的塊菌多糖處理組均可顯著延長小鼠的平均力竭游泳時間。此外,各劑量多糖灌胃處理組小鼠的肝重系數均較對照組顯著升高,且顯著性隨多糖劑量的增加而增大,說明塊菌多糖能延長小鼠的肌肉耐受能力并提高小鼠的肝糖原儲備,從而起到抗疲勞的作用。

3.5 免疫調節

塊菌多糖能夠通過影響免疫器官、免疫細胞、免疫分子、補體系統和細胞因子等對免疫系統進行調節。趙玲[41]對中華塊菌T.sinense粗多糖CTP進行了體內外免疫活性測定,體外試驗結果表明,CTP對小鼠脾淋巴細胞增殖及腹腔巨噬細胞分泌NO的促進作用隨CTP濃度的增加而增加。體內試驗中,CTP能顯著促進免疫抑制小鼠胸腺指數的部分恢復,同時對免疫抑制小鼠脾臟指數也有一定的促恢復作用。此外,CTP還能增強免疫抑制小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞的吞噬作用。其中,低劑量(50 mg/kg)CTP可以顯著增加免疫抑制小鼠外周血中白細胞數量,紅細胞數量與血紅蛋白含量。胡慧娟等[42]對T.sinica中提取得到的多糖PST進行了小鼠免疫調節活性評價,觀察到PST不僅能增加小鼠脾臟的重量,增加小鼠外周血中白細胞數量,促進T淋巴細胞轉化和綿陽紅細胞所引起的遲發型超敏反應,還能提高小鼠血清的抗體水平,說明PST有明顯的免疫調節活性。

4 塊菌多糖在食品工業中的應用

塊菌多糖在食品工業中的應用主要圍繞研制糕點和含片類產品展開。華思寧[43]采用蛋白酶酶解和超聲波等現代工藝技術預處理黑松露,使多糖等有效成分大量析出。隨后將預處理溶液于100 ℃恒溫水浴鍋中,在持續攪拌下加入葡萄糖酸鈣和蘋果酸鋅溶液,最終在高壓脈沖電場下處理3 h得到黑松露溶液。該溶液存在松露多糖螯合鈣和螯合鋅兩種新型微量元素補充劑,可直接被人體吸收利用。在傳統月餅餡料中加入50%的黑松露溶液制得月餅餡料后,按2∶8或3∶7的月餅面皮與餡料的比例制作月餅。與市面上已有的將黑松露直接粉碎加入餡料中制得的月餅相比,該工藝增加了餡料中黑松露多糖、松露多糖鈣和多糖鋅螯合物等有效成分,顯著提高了月餅的營養價值,更加滿足現代健康飲食的需求。

含片具有便于攜帶、方便食用等優點,受到許多消費者的喜愛。清源[13]以塊菌為原料制備得到塊菌多糖粉后,選用甘露醇粉為填充劑、乳糖為甜味劑與其混勻,隨后緩慢加入70%乙醇制軟料,進行制粒、干燥、整粒和壓片后得到多糖含片,以色澤、風味、口感和組織狀態為感官指標對配方進行優化。當塊菌多糖粉用量為100 g,添加2%硬脂酸鎂、20%甘露醇粉、45%乳糖以及體積分數為70%的乙醇,所得含片的甜味協調,口感最佳。鮮欣言[44]將塊菌多糖提取液制成稠浸膏狀后,采用濕法壓片工藝制備得到了塊菌多糖含片,當甘露醇、阿斯巴甜、檸檬酸、硬脂酸鎂添加量分別為65.0%,2.0%,0.1%,0.7%時,含片的感官評價得分最高。塊菌多糖含片的研制不僅豐富了塊菌食品的形式,還在一定程度上推廣了塊菌多糖的保健功能價值。

5 結語

研究系統總結了塊菌多糖的提取工藝、化學結構和功能活性及其在食品工業中的應用,為未來塊菌多糖功能性食品的開發提供了一定的理論支撐。但目前關于塊菌多糖的研究仍存在一定局限性,后續可以嘗試借助其他方法繼續優化塊菌多糖的提取工藝,如超臨界萃取法等。而對于塊菌多糖的化學結構,還需進一步研究其主鏈骨架和螺旋構象等。此外,塊菌多糖的其他潛在功能活性也有待進一步證明,如抗炎、抗菌和降膽固醇活性等。為了擴大塊菌多糖的應用,可將其作為壁材遞送不同生物活性成分以增強其穩定性及利用率,開發成新型乳液穩定劑提高乳液的穩定性或復合膜材料制備可食用薄膜或涂層以延長食品貨架期,以及用于蛋白多糖復合物的制備實現新型脂肪代替物的開發,改善食品品質及營養價值。