動物源性食品中酰胺醇類藥物殘留檢測研究進展

張振宇 崔海燕 王 勇

酰胺醇類藥物作為廣譜抗菌藥被廣泛應用于動物的抗菌治療,常用的酰胺醇類藥物有氯霉素(chloramphenicol)、甲砜霉素(thiamphenicol)和氟苯尼考(florfenicol)[1]。由于酰胺醇類藥物半衰期較長,進入人體后難以通過消化系統(tǒng)排出[2]。氯霉素和甲砜霉素對人體均有較強的毒性,不僅會使人體產生耐藥性,嚴重時還會導致白血病、再生性障礙性貧血及灰色嬰兒綜合癥的發(fā)生;氟苯尼考雖無致癌、致畸和致突變作用,但會可逆性地抑制紅細胞的生成,且具有胚胎毒性[3-4]。GB 31650—2019對食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的最高殘留限量均作出了規(guī)定(表1)。目前酰胺醇類藥物殘留的檢測方法主要有色譜法[5]、質譜法[6-7]、電化學法與電致化學發(fā)光法[8-9]、熒光法[10]、免疫法[11]、表面增強拉曼光譜法[12]等。文章擬綜述近5年來上述方法在動物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考檢測的各種應用,以期為動物源性食品中酰胺醇類藥物殘留檢測新方法的開發(fā)提供依據。

表1 中國規(guī)定的食品中酰胺醇類藥物最高殘留限量

1 色譜法

色譜法可以對復雜的組分進行分離并實現(xiàn)定量檢測,被廣泛應用于藥物、食品、化工等領域,具有分離效率高、重現(xiàn)性能好、能與多種檢測器兼容且易于自動化等特點[13-14]。

樣品前處理過程中萃取方法的選擇是影響色譜法檢測動物源性食品中酰胺醇類藥物殘留的重要因素之一。Moudgil等[15]利用高效液相色譜結合二極管陣列檢測器來檢測牛奶中的氯霉素,借助Oasis HLB固相萃取柱凈化樣品中的氯霉素,在最佳的試驗條件下,氯霉素的線性范圍為50～500 ng/mL,檢出限為21.4 ng/mL。

加速溶劑萃取法是在高溫高壓條件下利用未達到臨界點的液體作為萃取溶劑的提取方法,具有萃取時間較短和溶劑使用量少的優(yōu)點。Wang等[16]使用加速溶劑萃取法提取禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考,利用液相色譜—熒光檢測器可以在5 min內準確檢出甲砜霉素和氟苯尼考,2種殘留物的檢出限為1.8～4.9 μg/kg,回收率>80.1%,說明該法可以用于檢測不同品種禽蛋中的甲砜霉素和氟苯尼考殘留。

濁點萃取法是通過改變pH值、溫度或離子強度等使表面活性劑產生濁點析相,從而將疏水性物質和親水性物質分離,該法不使用揮發(fā)性有機溶劑,是一種較為環(huán)保的提取方法[17]。Sürücü等[18]使用聚乙二醇6000作為表面活性劑,在添加pH為5.0的Britton-Robinson緩沖溶液與20%的硫酸鈉溶液后提取樣品中的氯霉素,經渦旋、孵育、離心、相分離等步驟后,氯霉素便吸附至聚乙二醇6000表面,最后使用乙醇洗脫后利用高效液相色譜—二極管陣列檢測器檢測,該法在檢測牛奶樣品中氯霉素時回收率為95.4%～102.4%,檢出限為2.98 ng/mL。

氣相色譜法在檢測酰胺醇類藥物殘留時一般需經過衍生處理,步驟較為繁瑣,但農業(yè)部958號公告-13-2007(水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測定)選擇氣相色譜法來檢測水產品中的氯霉素和甲砜霉素,說明氣相色譜法具有一定的適用性。胡紅美等[19]利用氣相色譜—電子捕獲方法來測定水產品中的氯霉素,樣品經乙酸乙酯超聲萃取和正己烷除脂后,使用N-丙基乙二胺固相吸附劑凈化并通過硅烷化試劑衍生,再使用氣相色譜進行檢測,氯霉素的線性范圍為1.5～100.0 μg/L,檢出限為0.1 μg/kg,該法在鰻鱺、鱖魚和大管鞭蝦3種不同基質中的回收率為78%～108%,在實際樣品復雜基質檢測的應用中效果良好。

色譜法具有準確度較高、可同時快速檢測多種藥物殘留的優(yōu)點,整體耗費較低,因此較為適合市、縣級檢測機構對酰胺醇類藥物殘留的日常監(jiān)測。但色譜法在檢測酰胺醇類藥物時具有前處理方法較為繁瑣、前處理時間較長以及揮發(fā)性有機試劑消耗較多等缺點,需進一步完善。

2 質譜法

質譜法是根據目標分析物的質荷比進行定量檢測,可以在較短時間內同時檢測上百種目標分析物。質譜儀可連接不同的色譜儀進行分離步驟,GB/T 22338—2008中規(guī)定了動物源性食品中氯霉素類殘留量的氣相色譜—質譜和液相色譜—質譜/質譜測定方法,GB/T 20756—2006、GB 31658.2—2021使用了液相色譜串聯(lián)質譜的測定方法。除了這些國家標準,廣大科研人員也借助質譜法來開發(fā)新的方法用于檢測動物源食品中的酰胺醇類藥物殘留,并取得了令人滿意的結果。

與色譜法一樣,前處理過程的效果直接影響質譜法在檢測藥物殘留應用中的準確度,科研人員在使用質譜法檢測酰胺醇類藥物殘留時,常常會嘗試多種方法以尋找合適的提取試劑和方法。Saito-Shida等[20]建立了一種利用液相色譜串聯(lián)質譜法檢測牛和鰻魚中氟苯尼考與氟苯尼考胺總殘留量的方法,樣品經鹽酸水解及固相萃取凈化,最大限度地降低了基質效應,該法在檢測氟苯尼考殘留時回收率>90%。Xie等[21]利用乙酸乙酯—乙腈—氨水(V乙酸乙酯∶V乙腈∶V氨水為49∶49∶2)混合溶液作為提取劑提取雞蛋中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考藥物殘留,3種藥物殘留的檢出限為0.04～0.50 μg/kg,回收率為90.84%～108.23%。

氣相色譜—質譜法檢測酰胺醇類藥物殘留時也需要對樣品進行衍生化處理。勞哲等[22]對樣品進行提取、凈化、衍生化和定容后,利用在線凝膠滲透色譜—氣相色譜串聯(lián)質譜檢測氯霉素,上機溶液經凝膠滲透色譜柱后由切換閥可以排出殘留的脂肪和色素,在優(yōu)化提取溶劑、衍生溫度、衍生時間等試驗條件后,該法在檢測食品中氯霉素時檢出限為0.05 μg/kg,線性范圍為0.25～10.00 ng/mL。

固相萃取過程中吸附劑的選擇直接影響萃取效果,Zhou等[23]建立了一種新的微波輔助合成硼酸改性膨脹石墨(B-EG)方法,得到了蠕蟲狀和片狀結構的B-EG,并將B-EG作為固相萃取吸附劑來富集和分離雞蛋樣品中的氯霉素,利用液相色譜串聯(lián)質譜法檢測時,檢出限為0.27 ng/g,在50 ng/g的添加濃度下,氯霉素回收率為87%～94%。

內標法可以顯著提高質譜法檢測的準確度,內標物的加入可以在一定程度上消除進樣量和色譜條件的微小變化,并且可以部分補償待測組分在前處理過程中的損失。氘代氯霉素(d5-氯霉素)為氯霉素的內標物,在開發(fā)新的檢測方法時往往會選擇加入氘代氯霉素作為內標物。表2展示了利用內標法在檢測動物源性食品中酰胺醇類藥物殘留的應用效果。

表2 內標法在檢測酰胺醇類藥物殘留中的應用效果

質譜法檢測速度快、準確度和自動化程度高,在農業(yè)、食品、藥品等檢測工作中具有十分重要的作用,但是質譜法也具有儀器和耗材昂貴、前處理過程繁瑣、有機溶劑使用量多等缺點。

3 電化學法與電致化學發(fā)光法

電化學法是通過分子識別元件與目標分析物發(fā)生作用產生信號,經信號轉換器轉換為可以識別的電信號來實現(xiàn)定性與定量分析。電化學法檢測速度較快,通常幾十秒便可以完成一次檢測,靈敏度高,檢出限可達到“fg/mL”級,且電化學法儀器簡單便宜,便于小型化[27-28]。電化學傳感器是電化學法的基礎和重點,其性能直接影響電化學法的靈敏度。常見的電化學法檢測方式有循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法[29-30]。

電致化學發(fā)光法是將電化學法與化學發(fā)光法結合而產生的方法,也是利用電化學傳感器來檢測目標分析物,與電化學法不同的是電致化學發(fā)光法是檢測光信號,因此靈敏度要比電化學法更高[31]。由表3可知,在檢測酰胺醇類藥物殘留時,貴金屬、金屬氧化物、聚合物、石墨烯、核酸適配體、金屬有機框架材料等均可以作為電極材料用于構筑電化學傳感器。

表3 不同電化學傳感器在檢測酰胺醇類藥物殘留中的應用

電化學法在檢測一種藥物殘留時性能優(yōu)秀,但在同時檢測多種藥物殘留時存在較大的缺陷:① 多種藥物的氧化還原峰很接近,難以區(qū)分;② 一種固定濃度藥物的電流響應值會隨另一種藥物濃度的變化而發(fā)生較大變化,嚴重影響測定的準確性;③ 電化學法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不理想,利用滴涂法制作的電化學傳感器在幾個測量之后表面的電極材料脫落嚴重。

4 熒光法

熒光法是基于輻射躍遷原理的檢測方法,當利用一定波長的激發(fā)光照射目標分析物時,具有特定結構的分子/原子會發(fā)出熒光。該法具有特異性,適合復雜樣品中藥物殘留的檢測[41]。Yi等[42]使用上轉換納米材料NaYF4:Yb與金納米粒子設計了一種熒光探針,當加入甲砜霉素時,金納米顆粒會聚集從而抑制熒光共振能量轉移過程,使熒光強度減弱來實現(xiàn)對甲砜霉素的定量檢測,該法在檢測雞蛋中甲砜霉素時回收率為98.2%～105.3%,檢出限為0.003 μmol/L。

與傳統(tǒng)的熒光探針相比,量子點熒光探針的熒光強度高、穩(wěn)定性好,且量子點具有良好的生物相容性[43]。Sadeghi等[44]采用水熱法一步合成了新型離子液體包覆CdS量子點的熒光探針,在堿性介質中加入氟苯尼考后會引起熒光猝滅,可據此來實現(xiàn)對氟苯尼考的定量分析,優(yōu)化試驗條件后,氟苯尼考檢出限為0.098 μmol/L,線性范圍為0.3～56.0 μmol/L,該法在檢測魚肉和雞肉中氟苯尼考時結果令人滿意,可用于肉制品中氟苯尼考殘留的快速篩查。Sa-Nguanprang等[45]制備了CdTe*CdS*ZnS量子點,隨后與介孔碳、分子印跡聚合物結合制備了用于靈敏檢測甲砜霉素的混合熒光傳感探針,在檢測牛奶中甲砜霉素時回收率為93.5%～100.1%。

熒光生物傳感器是將生物技術與熒光技術結合而成,識別元件主要有各種抗原、抗體、蛋白和核酸等,其中由核酸構成的熒光生物傳感器對待測物具有特異性的識別能力,在檢測藥物殘留時具有優(yōu)秀的靈敏度[46]。Li等[47]利用三倍體DNA和雜交鏈式反應擴增的無酶熒光共振能量轉移傳感平臺來檢測牛奶中殘留的氯霉素,氯霉素能夠特異性地與適配體結合引發(fā)雜交鏈式反應形成三倍體DNA導致熒光降低,進而檢測牛奶中的氯霉素殘留,該法對氯霉素的檢出限為1.2 pg/mL,回收率為97.5%～106.0%。

以蛋白為模板合成的金納米簇在生物相容性、光穩(wěn)定性、綠色合成以及表面功能化修飾等方面具有十分重要的研究價值[48]。成玉梁等[49]合成了大豆蛋白—金納米簇,根據氯霉素對大豆蛋白—金納米簇的熒光猝滅現(xiàn)象開發(fā)了可以檢測氯霉素的熒光傳感器,檢出限為22.86 μmol/L,回收率為87.80%～98.45%,可靠性較高,可用于檢測豬肉中的氟苯尼考。

碳點是一種新型的碳納米熒光材料,具有光學性能穩(wěn)定、生物相容性良好、易于制備等優(yōu)點,既可以通過生物質碳源制備,也可以由非生物質碳源制得,來源十分廣泛[50]。Fu等[51]分別利用檸檬酸鹽、乙二胺和香菜制備了非生物質碳點與生物質碳點,然后將SiO2和沸石咪唑酯骨架結構材料(ZIF-8)結合制備了下/上轉換雙激發(fā)多發(fā)射熒光印跡傳感器,在370,780 nm光源激發(fā)條件下,該傳感器對甲砜霉素表現(xiàn)出雙通道熒光響應,線性范圍分別為5.0×10-3～6.0,6.0～26.0 μmol/L,可用于檢測肉類樣品與牛奶樣品中的甲砜霉素,回收率為95.0%～105.0%。

熒光法具有耗費低、儀器結構簡單、靈敏度高等優(yōu)點,適合現(xiàn)場高通量快速篩查,在食品檢測領域應用廣泛。但是熒光物質穩(wěn)定性差的缺點還未解決。

5 免疫法

免疫法是以抗原抗體的特異性反應為基礎而進行測定抗原抗體含量的一種分析方法,主要有酶聯(lián)免疫法和免疫層析法,具有檢測速度快、價格便宜、便攜性好等優(yōu)點[52]。

膠體金免疫層析法是以膠體金作為示蹤物應用于抗原抗體反應的一種免疫法,該法特異性強且靈敏度高,不需要借助任何設備儀器[53]。Lei等[54]利用以納米金為基礎的單克隆抗體和間接競爭酶聯(lián)免疫法建立了可以檢測雞蛋中氟苯尼考和甲砜霉素藥物殘留的方法,優(yōu)化條件后,該試紙條在檢測氟苯尼考與甲砜霉素的檢出限為0.053 ng/mL。

近年來,免疫法與儀器分析技術相結合開發(fā)的時間分辨熒光免疫分析技術具有檢測速度快且可以實現(xiàn)定量分析的特點,該法使用稀土元素作為標記物,可以明顯提升方法的靈敏度[55]。崔乃元等[56]合成了羧基化的銪微球,并將其與氯霉素鼠單克隆抗體進行偶聯(lián)標記,使用氯霉素抗原與羊抗鼠二抗分別包被于硝酸纖維膜上作為檢測線和控制線,將羧基化銪微球標記的氯霉素單克隆抗體噴灑在釋放墊上一起制成了試紙條,利用熒光免疫定量分析儀檢測水產品中的氯霉素時,定量限為0.1 μg/kg。

免疫法常用于養(yǎng)殖場和屠宰場對動物尿液進行現(xiàn)場分析,在動物源性食品安全監(jiān)管方面發(fā)揮了很大作用。但是,免疫法具有假陽性的缺點,當出現(xiàn)假陽性時,還需要借助其他方法進行確證,而且大部分免疫法在檢測酰胺醇類藥物殘留時均不能給出具體的殘留量,免疫法與其他儀器結合使用可以克服這一缺點。

6 表面增強拉曼光譜法

表面增強拉曼光譜法結合了拉曼光譜和表面材料技術,由于局域表面等離子體共振和化學吸附現(xiàn)象導致拉曼散射信號顯著提升,檢測靈敏度得以提升,同時具有樣品消耗少、無損傷、響應速度快等優(yōu)點[57]。Li等[58]合成了具有3D結構的ZnO@Ag納米花,Ag納米粒子均勻分布在ZnO表面,將ZnO@Ag納米花通過浸漬法組裝至聚酯纖維膜上制備了柔性基板,將含氟苯尼考的雞肉樣品利用乙酸乙酯提取后得到的上清液滴加至柔性基板上進行表面增強拉曼光譜測量,在最佳的試驗條件下,該法檢測氟苯尼考的檢出限達0.223 nmol/L。

7 結論

(1) 色譜法與質譜法在同時檢測多種酰胺醇類藥物殘留的應用方面優(yōu)勢明顯,準確度高,已有許多國家標準采用色譜—質譜聯(lián)用法用于檢測動物源性食品中的酰胺醇類藥物殘留,后續(xù)研究重點可聚焦于以下方面:① 開發(fā)有機溶劑使用量少、萃取效率高、綠色環(huán)保以及安全的前處理方法;② 合成性能優(yōu)異的新型吸附劑,如磁性納米材料;③ 建立多種類藥物同時提取、檢測的方法,提高檢測效率,降低試驗成本。

(2) 除了常見的循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法等方法,電化學法也可使用交流阻抗譜進行酰胺醇類藥物殘留的定性與定量分析,以提高電化學法的靈敏度和準確性。此外,可以合成新型功能化納米復合材料用于改善電化學傳感器的重現(xiàn)性,也可探索使用電沉積、電聚合、金—硫鍵反應等方式制作穩(wěn)定性能更好的電化學傳感器。

(3) 聯(lián)合使用免疫法與熒光法,既保留了特異性也滿足定量分析,可合成具有多種顏色的熒光標記物實現(xiàn)多種酰胺醇類藥物殘留的同時檢測,并且利用有機材料包裹熒光物質制成納米微球可以顯著提高熒光探針的穩(wěn)定性。