SARS-CoV-2 S蛋白引起呼吸道上皮細胞炎癥反應的研究進展

劉興健,張華華,張銳鋼

(廣東醫科大學基礎醫學院 1. 生理學教研室; 2. 生物學教研室,廣東 湛江 524023)

新型冠狀病毒感染(COVID -19)是嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome cornavirus 2, SARS-CoV-2)引起的傳染病。病毒在全球的大流行曾給人類生命健康造成巨大威脅,使全球公共衛生面臨巨大挑戰。截至2023年3月10日,全球已確診病例約7.6億,確診死亡病例約692萬[1]。COVID -19表現因患者體征而異,疾病不同階段最常見的臨床癥狀包括發熱、疲勞、咳嗽、食欲不振、呼吸急促等[2-3]。此外,還有咽喉痛、頭痛、咯血、胸悶,以及惡心、嘔吐等并發癥[4-5]。SARS-CoV-2是一種單鏈RNA病毒,該病毒通過刺突蛋白(spike protein,S蛋白)、血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)和跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane protease serines 2, TMPRSS2)之間的作用機制感染宿主細胞。ACE2和TMPRSS2在肺上皮細胞中高表達。S蛋白是SARS-CoV-2最重要的抗原,含有兩個功能亞基:S1含有受體結合域(RBD),負責識別受體ACE2,S2負責將S蛋白固定在細胞膜上并介導病毒與宿主細胞膜融合[6]。S蛋白已被發現在人和小鼠巨噬細胞[7]、血管內皮細胞、Caco-2中誘導炎性細胞因子和趨化因子,如白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、CXC趨化因子配體1(CXCL1)、CXC趨化因子配體2(CXCL2)和C-C趨化因子配體2(CCL2)表達[8-9]。此外,S蛋白可引起細胞自噬和凋亡進而誘導炎癥反應[10]。因此,深入研究SARS-CoV-2 S蛋白引起呼吸道炎癥的機制對于揭示病毒感染和防治具有重要意義。本綜述將對SARS-CoV-2 S蛋白引起呼吸道炎癥的機制做詳細的討論。

1 病毒結構及致病性

SARS-CoV-2屬于Beta冠狀病毒,是一種包膜單鏈RNA病毒,病毒基因組編碼29種不同的蛋白質,包括四種主要結構蛋白:S蛋白、包膜蛋白(envelope protein,E蛋白)、膜蛋白(membrane protein,M蛋白)、核衣殼(nucleocapsid,N蛋白)[11]。SARS-CoV-2通過自身S蛋白識別人體組織中的ACE2并結合,介導病毒進入宿主細胞[12]。然而在與ACE2結合之前病毒蛋白必須折疊成能量穩定的狀態,隨后構象發生轉變,以提供足夠的能量來克服病毒和細胞膜之間的自然排斥[13]。因此,S蛋白在膜融合之前過渡到所謂的亞穩態這種低能狀態。在SARS-CoV-2感染過程中,S蛋白S1/S2被furin蛋白酶切割,隨后在TMPRSS2的作用下激活S2亞基從而轉變為低能狀態,介導病毒S蛋白入侵宿主細胞[14-16]。由此可見,ACE2和TMPRSS2在SARS-CoV-2感染過程中發揮重要作用。研究[17]表明,ACE2是一種跨膜金屬羧肽酶,在肺、下呼吸道、鼻咽部等均有表達,免疫組織化學也已在鼻和支氣管上皮細胞中檢測到ACE2和TMPRSS2,盡管與其他組織器官相比,ACE2和TMPRSS2在氣道上皮細胞中的表達水平較低,但病毒通常通過氣道入侵宿主,從而引起呼吸道感染,導致COVID -19。

2 S蛋白引起呼吸道上皮細胞炎癥反應的發病機制

2.1 SARS-CoV-2 S蛋白引起鼻上皮細胞炎癥反應的發病機制 SARS-CoV-2通過自身S蛋白與受體ACE2結合直接感染并引起細胞損傷,導致炎癥反應。氣道上皮細胞中,ACE2在鼻上皮細胞中的表達最高,尤其是纖毛細胞、杯狀細胞、支持細胞、基底細胞等[18]。在鼻上皮細胞中高表達ACE2使得鼻成為該病毒的潛在靶點。鼻纖毛細胞主要通過擺動起到抗感染的生理防御作用。杯狀細胞在鼻腔中分泌黏蛋白形成黏膜屏障以保護上皮細胞。因此,感染SARS-CoV-2后鼻上皮細胞的防御功能可能受到影響。從無基礎病史的人隆鼻手術患者獲得鼻上皮細胞,經不同濃度的S蛋白處理,qRT-PCR檢測到ACE2和TMPRSS2 mRNA的表達增加;此外,S蛋白顯著增加炎性細胞因子(IL-6β、IL-8和IL-5)及黏蛋白(MUC5AC/5B)的表達[19]。黏蛋白過度表達會引起氣道炎癥和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD),是COVID -19重癥患者最大的危險相關因素[20]。這表明SARS-CoV-2 S蛋白引起鼻上皮細胞的防御功能損傷,進而導致氣道炎癥。

2.2 SARS-CoV-2 S蛋白引起氣管/支氣管上皮細胞炎癥反應的發病機制 支氣管上皮細胞是一種復雜的宿主防御系統,它們以基底柱狀結構為基礎,通過可清除黏液的纖毛細胞和能分泌黏液的無纖毛細胞等組成物理屏障,有效阻止多種有毒物質的侵害,同時還能產生和分泌大量化學介質和細胞因子,保護機體免受外界侵害。人支氣管上皮細胞與主要病理生理疾病(如支氣管肺癌、慢性支氣管炎、支氣管擴張、支氣管狹窄等)有關[21]。呼吸道中,ACE2在支氣管上皮細胞中的表達較低,單細胞RNA測序顯示TMPRSS2在支氣管的表達高于ACE2。而原代人支氣管上皮細胞(HBEC)中觀察到ACE2/TMPRSS2雙陽性細胞顯著富集[22]。支氣管刷和支氣管肺泡灌洗液分析顯示,與健康受試者相比,COVID -19患者的ACE2 mRNA上調三倍[23]。這表明支氣管上皮細胞是SARS-CoV-2的潛在靶點之一。IL-6和IL-8是參與COVID -19“細胞因子風暴”的兩個關鍵分子。分析暴露于SARS-CoV-2 S蛋白的人支氣管上皮細胞系(IB3-1)細胞培養上清液發現,IL-6和IL-8蛋白濃度增加;qRT-PCR檢測到mRNA水平升高;對細胞分泌的蛋白檢測發現S蛋白處理24 h可誘導IL-6、IL-8、IL-9、FGF、G-CSF、GM-CSF、MCP-1和MIP-1β的釋放增加[24]。

自噬是細胞的一種降解過程。自噬誘導不可逆的自噬細胞死亡和自噬依賴性細胞凋亡,已被公認為是機體的一種防御和存活機制。正常情況下的自噬可防止細胞死亡,而過度自噬可導致細胞死亡[25-26]。研究[10]發現,SARS-CoV-2 S蛋白處理人源支氣管上皮細胞系(16HBE14o-)后活性氧(ROS)水平顯著上調,產生促炎細胞因子(IL-6、IL-1和TNF-α),并存在細胞自噬,同時,ROS可調控自噬抑制PI3K/AKT/mTOR信號傳導,從而促進人支氣管上皮細胞的凋亡和炎癥反應。這表明SARS-CoV-2 S蛋白可引起支氣管上皮細胞炎癥和細胞凋亡,支氣管損傷又會導致支氣管炎、支氣管狹窄等,進而導致肺部炎癥和呼吸窘迫。另有研究[27]發現,SARS-CoV-2通過S蛋白與宿主16HBE14o-細胞上的ACE2相互作用進入細胞,病毒在這些細胞中復制可以維持7 d左右,且動態增加,并從感染細胞中釋放;在受感染的細胞中參與免疫調節的IL-4、IL-5、IL-10和IL-17 mRNA表達上調,進一步導致免疫性細胞炎癥反應。此外,SARS-CoV-2 S蛋白可以激活人正常肺上皮細胞(BEAS-2B細胞)Ⅰ型干擾素(IFN)和下游干擾素刺激基因(ISG)表達,qRT-PCR和Western blot(WB)分析發現,ACE2表達和IFN效應子JAK-STAT信號激活,轉錄組分析顯示S蛋白誘導一系列基因表達,包括ISG和ACE2等[28]。這些研究表明SARS-CoV-2通過某些未知機制干擾支氣管上皮細胞的先天免疫反應和應激反應,導致支氣管上皮細胞損傷誘導炎癥反應,進而導致肺組織嚴重炎癥和長期COVID -19病程。

細胞遷移是正常細胞的基本功能之一,是機體正常生長發育的生理過程,也是活細胞普遍存在的一種運動形式。傷口愈合、免疫反應、炎癥反應等過程都涉及細胞遷移[29]。單細胞路徑追蹤和傷口愈合試驗發現,在轉染ACE2質粒的BEAS-2B細胞中,S蛋白處理延遲了BEAS-2B細胞的遷移,這表明S蛋白引起支氣管上皮細胞損傷和炎癥反應,并減緩了細胞的自我損傷修復[30]。MAPK和NF-κB信號通路在細胞遷移、炎癥等方面起到重要的調節作用[31],因此,S蛋白可能通過影響MAPK和NF-κB信號通路導致細胞遷移、損傷和炎癥。

2.3 SARS-CoV-2 S蛋白引起肺部炎癥反應的發病機制 SARS-CoV-2感染患者由最初的無癥狀或輕至中度癥狀,發展為重癥患者,主要表現為嚴重的肺部受累、呼吸窘迫、系統血栓形成[32]。肺泡是肺部氣體交換的主要部位,是肺的功能單位。氧氣從肺泡向血液彌散,依次經過肺泡內表面的液膜、肺泡上皮細胞膜、肺泡上皮與肺毛細血管內皮之間的間質、毛細血管的內皮細胞膜等。在肺部ACE2主要在II型肺泡細胞表達,SARS-CoV-2感染Ⅱ型肺泡細胞,引起肺泡-毛細血管功能障礙,導致氣體交換受損、血管滲漏和液體清除減少,這是重癥COVID -19患者急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的主要原因。COVID -19相關的ARDS標志是彌漫性肺泡損傷,其特征是先天免疫細胞和上皮細胞過度分泌炎性細胞因子導致上皮細胞大量死亡[33]。對18例COVID -19死亡患者的肺部尸檢樣本檢測結果顯示,癥狀發作至死亡時間3～7 d不等,組織病理學特征包括進行性彌漫性肺泡損傷伴過多的血栓形成,以及遲發性肺組織和血管重塑[34]。在SARS-CoV-2 S蛋白誘導的人巨噬細胞中,檢測到大量細胞因子和趨化因子的產生,主要是IL-6和IL-8,而這些細胞因子和趨化因子又作用于人肺泡上皮細胞,進一步導致炎癥介質分泌,并通過激活JAK/STAT途徑損傷上皮屏障,導致肺泡上皮細胞炎癥反應[35]。通過SARS-CoV-2慢病毒感染雄性小鼠和巨噬細胞樣RAW264.7(RAW)細胞,免疫熒光顯示病毒在小鼠肺Ⅱ型肺泡上皮細胞和巨噬細胞中共定位,肺部有明顯病理變化,包括多灶性病變、炎性細胞浸潤、肺泡壁增厚等,q-PCR檢測到RAW細胞IL-6、IL-10和CD80 mRNA水平升高[36]。這表明病毒通過激活小鼠肺巨噬細胞誘導肺部炎癥反應,與前述人肺上皮細胞中觀察到的結果相同。因此,可以推測肺泡上皮細胞和激活的巨噬細胞可能協調肺部炎癥并導致肺部炎癥性肺泡損傷。

細胞因子風暴是機體受到感染后引起體液中多種細胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1和IL-8等)迅速大量產生的現象,是引起ARDS和多臟器衰竭的重要原因[37]。研究[38]發現COVID -19與細胞因子風暴密切相關,而細胞因子風暴又會引起炎癥的惡性循環和ARDS。在S蛋白處理的A549細胞中,檢測到細胞因子和趨化因子水平升高,包括CSF-3(G-CSF)、GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-8、IP-10(CXCL10)、CCL2、CCL3、CCL5、TNFα、VEGF-A和FGF-2等,進一步研究[39]發現S蛋白通過NF-κB/MAPK信號通路誘導這些細胞因子和趨化因子的產生。對武漢150例COVID -19患者臨床檢測結果推測COVID -19病死率可能與病毒激活細胞因子風暴有關[40]。對SARS-CoV-2入院患者血漿細胞因子和趨化因子測量結果顯示IL1B、IL1RA、IL7、IL8、IL9、IL10、FGF、G-CSF、GM-CSF、MCP1、MIP1A、MIP1B、PDGF、TNFα、VEGF等濃度高于健康患者[41]。SARS-CoV-2 S蛋白誘導細胞因子分泌增加,免疫細胞遷移到感染部位清除感染和吞噬損傷細胞,而這種極端免疫防御又進一步引發肺部炎癥循環,導致持續性肺部炎癥。另一項研究[42]發現,SARS-CoV-2 S蛋白可激活A549細胞血管緊張素Ⅱ的1型受體(AT1)信號傳導,通過MAPK激活轉錄調節分子NF-κB和AP-1/c-Fos,誘導IL-6釋放。IL-6是導致COVID -19重癥患者免疫失調的細胞因子之一。此外,IL-6分泌增加和其他細胞因子分泌水平升高引起的侵襲性組織損傷導致高炎癥反應符合COVID -19疾病特征[43]。

細胞衰老是由應激性損傷和某些生理過程引發的,其特征包括不可逆的細胞周期停滯、細胞損傷和代謝改變。衰老細胞分泌大量的可溶性因子,包括促炎細胞因子、趨化因子和血管生成因子等,統稱為衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP),這是細胞衰老的標志[44]。衰老人肺細胞釋放的某些炎癥/SASP因子(包括IL-1α、IL-1β、IL-6、MCP-1、TNFα和MMP-1)是一些COVID -19患者細胞因子風暴的核心[40]。據了解,SARS-CoV-2可引起細胞衰老,在SARS-CoV-2 S蛋白誘導的A549細胞中,WB分析顯示衰老標志物表達水平升高;ROS水平增加3倍;SASP相關炎癥分子IL-1α和IL-6分泌增加[45-46]。體內試驗發現,假病毒感染導致小鼠體內肺細胞衰老和促炎的SASP表達,肺衰老細胞暴露于SARS-CoV-2可引起衰老標志物的表達增加,而TLR-3拮抗劑處理降低了SARS-CoV-2誘導的衰老標志物的表達,表明TLR-3感知病毒感染以促進細胞衰老[47-48]。綜上所述,這些研究結果表明S蛋白引起肺內皮細胞衰老,導致相關炎癥分子釋放進而產生炎癥反應。

3 SARS-CoV-2其它結構蛋白引起呼吸道炎癥反應的發病機制

N蛋白是SARS-CoV-2非常重要的結構蛋白質之一,具有識別和結合RNA的能力,并將RNA基因組包裝成螺旋核衣殼,這對于病毒復制和感染的啟動很重要[49]。盡管S蛋白在SARS-CoV-2感染過程中發揮重要作用,但N蛋白可誘導6～8周齡C57BL/6小鼠急性炎癥反應,小鼠肺白細胞浸潤,肺泡增厚,促炎細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的濃度增加[50]。一項前瞻性研究[51]結果顯示,N蛋白可引起小鼠氣道和BEAS-2B細胞炎癥反應,N蛋白與Smad3相互作用,通過miR-145下調囊性纖維化跨膜調節因子(CFTR)的表達導致Cl-積累,并通過激活Cl-感應蛋白血清糖皮質激素調節激酶1(SGK1)引發氣道炎癥反應;Cl-過多積累通過NF-κB-磷酸二酯酶4(PDE4)-cAMP信號通路導致CFTR功能障礙,又導致持續的Cl-積累和氣道炎癥反應。因此,除S蛋白外,也應關注SARS-CoV-2其他結構蛋白對宿主的影響。

4 針對SARS-CoV-2 S蛋白的疫苗和未來展望

SARS-CoV-2 S蛋白在介導病毒進入宿主細胞中起著關鍵作用。因此,大多數針對SARS-CoV-2治療的中和單克隆抗體和候選疫苗都以S蛋白為靶標[52]。恢復期血清已被用于預防和治療傳染病[53]。在SARS-CoV-2大流行初期,很少有有效的方法用于COVID -19患者,這使得恢復期血清療法成為一種有前途的治療策略。然而隨著病毒突變,位于S蛋白上的變異表現出對恢復期血清中抗體的中和抗性。研究[54]表明,與原始毒株相比,恢復期血清對SARS-CoV-2變異株的中和活性降低。迄今為止,大多數獲得許可或開發的中和單克隆抗體都是以SARS-CoV-2的S蛋白為靶點,抑制S蛋白與ACE2之間的相互作用[55]。其中,大多數單克隆抗體靶向S蛋白RBD,因此,SARS-CoV-2 S蛋白突變,尤其是RBD突變可能會影響中和單克隆抗體的治療效果。研究發現β和γ變異株對多種中和單克隆抗體具有耐藥性,包括REGN10933(Casirivimab),LY-CoV555(Bamlanivimab)和LY-CoV016(Etesevimab)等已經被批準用于緊急治療COVID -19的單克隆抗體。Omicron譜系也對大多數單克隆抗體具有耐藥性[56]。盡管目前關于SARS-CoV-2 S蛋白突變對抗體的耐藥性研究有限,但仍有一些方式可以將突變逃逸的風險降至最低,針對SARS-CoV-2 S蛋白的疫苗和診療方法仍有廣闊的發展空間。在疫苗方面,隨著大規模III期臨床試驗的進行,對于疫苗安全性和有效性的了解將逐漸完善,對疫苗的長期保護效果還需進行深入研究。此外,隨著更多候選疫苗進入臨床試驗,疫苗的研發策略有望更加多樣化,以滿足不同人群的需求。在診療方面,預計會有更多的快速診斷試劑盒開發出來,以提供更加準確和高效的SARS-CoV-2感染檢測。同時,疫苗輔助治療也是一個有潛力的領域,值得進一步研究和探索。

盡管在臨床和臨床前試驗中有數百種SARS-CoV-2候選疫苗,但針對SARS-CoV-2變異株的高效抗體仍然是重大挑戰,針對S蛋白的全長或部分片段的抗體仍是首要選擇。基于目前的候選疫苗設計更優化的疫苗是未來疫苗設計的手段之一,目前SARS-CoV-2疫苗的一些不足可能會得到很大改進,包括產生有效中和抗體,長時間保持中和抗體水平,減少疫苗接種時間間隔或減少疫苗接種次數,以及防止流行的SARS-CoV-2變體和一系列大流行病毒等。

5 小結

SARS-CoV-2引起的COVID -19疫情給全球范圍內的公共衛生和世界經濟帶來了巨大的挑戰。了解病毒感染機制是開發有效治療方法和疫苗的關鍵。本文就SARS-CoV-2 S蛋白引起呼吸道炎癥反應的可能機制做了簡要概括。在SARS-CoV-2的感染過程中,S蛋白起著關鍵作用,其介導病毒與宿主細胞的結合和入侵,在感染初期導致呼吸道上皮細胞炎癥反應的啟動。S蛋白不僅在病毒感染的過程中發揮重要作用,還能獨立于病毒在體內外誘導炎癥反應,其誘導呼吸道上皮細胞損傷、凋亡、衰老和炎癥反應都存在有力的證據,對于其引起的炎癥反應的治療也已被報道。盡管各種藥物抑制S蛋白引起的炎癥反應效果較為明顯,但還需進一步驗證并進行臨床試驗,短時間內用于治療病毒S蛋白引起的疾病仍需很多工作。

隨著病毒的不斷突變和疫苗接種,SARS-CoV-2感染的致死率已經較低,很多人感染過病毒,大多數人群已產生對該病毒感染的免疫防御,對SARS-CoV-2感染的防控有所松弛。然而,病毒在時刻變異,從最初的毒株到現在的Omicron,以及最新的Omicron變異株如BQ.1、XBB等,都具有極強的傳染性。了解Omicron免疫逃逸和宿主免疫應答的確切機制,發現病毒關鍵表位,將有助于開發更好的疫苗和針對SARS-CoV-2變異株的中和單克隆抗體。應繼續進行對SARS-CoV-2及其S蛋白的相關研究,進一步了解其對呼吸道方面的影響,為預防和治療S蛋白引起的各種疾病及其并發癥提供臨床參考。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。