基于PARP1信號通路研究芒柄花素對糖氧剝奪/復氧復糖神經元細胞損傷的影響

郁 麗,王 湄,王文秀,曹麗平,何前松1,

臨床上治療腦梗死常用溶栓恢復血供,但恢復血供后,過量的自由基攻擊神經元細胞,造成缺血/再灌注損傷[1]。芒柄花素是藥用植物錦雞兒的主要活性成分-異黃酮類成分[2]。課題組前期研究顯示該類成分對腦缺血損傷具有保護作用,也有研究報道芒柄花素具有抗炎、抗氧化和抗癌作用[3-4],并且在多種神經疾病中具有保護特性,如阿爾茨海默病[5]、創傷性腦損傷[6]、焦慮和抑郁[7]等。然而,芒柄花素在細胞糖氧剝奪/復氧復糖(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)損傷的作用還有待深入研究。多聚ADP核糖聚合酶1[poly (ADP-ribose) polymerase 1,PARP1]可由DNA損傷激活,能促進聚合物PAR的形成。在腦缺血再灌注大鼠模型中,抑制PARP1和凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)核易位可抑制神經細胞的死亡[8],但是,芒柄花素在PARP1信號通路的作用尚不清楚。因此,本研究通過建立OGD/R細胞損傷模型,基于PARP1通路探究芒柄花素在OGD/R損傷中的作用,為運用錦雞兒異黃酮治療腦缺血再灌注損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑芒柄花素(HY-N0183,MedChemExpress,美國);PARP1抑制劑PJ34(HY-13688A,MedChemExpress,美國);PARG抑制劑Ethacridine lactate(HY-B2174,MedChemExpress,美國);RIPA細胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(E-BC-K318-M,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);P53抗體(AF0879,江蘇親科生物研究中心有限公司);AIF抗體(17984-1-AP,武漢三鷹生物技術有限公司);β-Actin抗體(HC201,北京全式金生物技術有限公司);PARP1抗體(13371-1-AP,武漢三鷹生物技術有限公司);PARG抗體(DF13517,江蘇親科生物研究中心有限公司);Iduna抗體(bs-11669R,北京博奧森生物技術有限公司);Cy3 Goat Anti-Mouse IgG(H+L)(AS008,武漢愛博泰克生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養和糖氧剝奪/復氧復糖小鼠HT22神經元細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司,CL-0697)在添加10% 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和1%P/S的DMEM培養基中,并在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養,每3 d更換1次細胞培養基。將HT22細胞接種24 h后進行OGD/R實驗。將HT22細胞原培養基棄去,用無糖培養基洗滌數次后更換為無糖培養基,培養條件為37°C、1%O2、94%N2和5%CO2,進行糖氧剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)6 h后,更換為正常培養基在95%空氣和5% CO2中37 ℃進行復氧復糖1、2、3、24 h。采用Western blot檢測復氧不同時間(1、2、3、24 h)后細胞內PARP1和PARG蛋白表達情況,確定后續實驗條件;確定OGD/R時間點后,設置6個組,分別為對照組、對照組+芒柄花素組、OGD/R組、OGD/R+芒柄花素組、OGD/R+PJ34組、OGD/R+PARG抑制劑組;對照組HT22細胞正常培養,不進行OGD/R處理。OGD/R+芒柄花素(10 μmol/L)、OGD/R+PJ34(10 μmol/L)和OGD/R+Ethacridine lactate(7.5 μmol/L)處理組在OGD/R后進行加入對應濃度藥物進行孵育。

1.3 免疫熒光各組細胞培養結束后,細胞于培養皿中用4%多聚甲醛固定,PBS洗滌,每次5 min,PBS浸洗培養皿3次,每次5 min,移液槍吸干PBS,在培養皿內滴加5% BSA,37度封閉30 min;棄封閉液,培養皿加入的稀釋好的一抗(P53、AIF,1 ∶200),4 ℃孵育過夜;PBS洗滌,加入稀釋好的熒光二抗Cy3(1 ∶200),37 ℃孵育30 min,PBS浸洗培養皿3次,每次5 min;滴加DAPI避光孵育5 min,對標本進行染核,用流水沖洗多余的DAPI;用50%甘油封閉培養皿,然后在熒光顯微鏡(奧林巴斯CKX53倒置熒光顯微鏡,北京瑞科中儀科技有限公司)下觀察細胞采集圖像。

1.4 Western blot檢測取各組細胞,棄去培養基,用RIPA裂解液提取總蛋白,12 000 r/min高速離心機4 ℃離心10 min,取上清液,BCA蛋白定量試劑盒對總蛋白進行定量。對蛋白樣品進行變性后,進行十二烷基硫酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE)1.5 h,后用300 mA恒流轉膜1 h。PVDF膜(Merck millipore)用脫脂奶粉封閉后,與一抗(AKT、p-AKT、PARP1、PARG、Iduna)4 ℃孵育過夜,次日PVDF膜室溫孵育二抗2 h,用發光液浸濕PVDF膜,置于超高靈敏度化學發光成像系統中進行顯影。使用Image J軟件用密度法定量蛋白條帶灰度值,計算目的蛋白與內參蛋白(β-Actin)灰度值的比值均值或磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白灰度值的比值均值,進行半定量統計分析。

2 結果

2.1 OGD/R可誘導HT22細胞PARP1通路激活為了評價OGD/R對HT22細胞PARP1通路的影響,采用Western blot檢測復氧不同時間(1、2、3、24 h)后細胞內PARP1和PARG蛋白表達情況。如圖1所示,在小鼠神經元HT22細胞中,與對照組相比,進行糖氧剝奪6 h后再進行復氧復糖培養1、2、3 h細胞中PARG表達升高(P<0.05),復氧復糖培養3 h和24 h時細胞中PARP1表達升高(P<0.05)。綜合來看,在OGD/R 3 h時,HT22細胞中PARP1/PARG通路激活最明顯,后續實驗條件確定為OGD/R 3 h。

圖1 Western blot檢測HT22細胞OGD/R不同時間PARP1和PARG蛋白表達水平

2.2 芒柄花素及PARP1通路抑制劑處理對HT22細胞OGD/R損傷后P53和AIF表達影響免疫熒光結果如圖2所示,DAPI染出來的細胞核在紫外的激發下為藍色,陽性表達為相應熒光素標記的紅光。與對照組相比,芒柄花素組細胞中p53和AIF表達無明顯差異變化,OGD/R組細胞中p53和AIF表達均升高(P<0.05);而在OGD/R后加入芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34、PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后,HT22細胞中AIF、p53表達下降。這表明芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34、PARG抑制劑Ethacridine lactate均可降低OGD/R誘導的神經元細胞中AIF、p53表達(免疫熒光量化分析見圖3)。

圖2 免疫熒光檢測HT22細胞P53、AIF蛋白表達情況 ×400

圖3 免疫熒光檢測HT22細胞P53、AIF蛋白表達差異性分析

2.3 芒柄花素對HT22細胞OGD/R損傷后PARP1通路的影響如圖4所示,與對照組相比,HT22細胞經OGD/R后,細胞中AKT蛋白磷酸化比值下降(P<0.05),Iduna蛋白表達下降(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表達量升高(P<0.05)。與OGD/R組細胞相比,在OGD/R后加入芒柄花素或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后,細胞中AKT蛋白磷酸化比值上升(P<0.05),Iduna蛋白表達上升(P<0.05),PARG和PARP1蛋白表達量均下降(P<0.05);細胞OGD/R后加入PARP1抑制劑PJ34孵育,細胞中p-AKT和Iduna蛋白表達量上升(P<0.05),而PARG和PARP1蛋白表達量均下降(P<0.05)。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1/PARG通路對OGD/R誘導的神經元損傷進行保護。

圖4 Western blot檢測芒柄花素對HT22細胞OGD/R損傷后PARP1/PARG通路蛋白表達影響

3 討論

本研究中,PARP1在OGD/R誘導的神經元損傷的調控中發揮了關鍵作用。PARP1及PARG在OGD/R條件下均上調,在復氧復糖3 h時達到高峰,但在24 h,PARG表達發生回降。在OGD/R后使用芒柄花素、PARP1抑制劑PJ34或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育細胞,均可有效抑制HT22細胞OGD/R損傷后凋亡因子P53和AIF表達,并抑制PARP1信號通路相關蛋白表達。表明芒柄花素可通過抑制PARP1信號通路參與HT22小鼠神經元細胞凋亡的調控。

PARP1是多聚ADP核糖聚合酶的一種,主要負責DNA鏈缺口和斷鏈輕度激活后染色體DNA修復,然而,過度活化的PARP1可以將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)轉化為長PAR聚合物,從細胞核轉移到細胞質后產生細胞毒性作用,PAR聚合物可誘導AIF從線粒體外膜池釋放,加劇細胞凋亡的聯級反應,同時多聚ADP核糖甘油水解酶PARG將ADP核糖從蛋白上降解[9]。PARP1在缺血再灌注表達后上調,抑制PARP1信號通路對缺血再灌注損傷具有保護作用[10]。在本研究中,OGD/R誘導的HT22小鼠神經元細胞中PARP1在復氧復糖3、24 h后均升高,PARG在OGD/R條件下以時間依賴性上調,但在24 h表達下降(圖1),故本研究選擇OGD/R 3 h作為后續研究實驗條件。另外,本研究中在OGD/R條件下,HT22細胞中除了PARP1和PARG被激活,凋亡誘導因子AIF和P53表達升高,而芒柄花素與PARP1抑制劑PJ34和PARG抑制劑Ethacridine lactate效果一致,均抑制了PARP1和PARG,同時部分逆轉了AIF和P53的累積,而挽救了細胞的凋亡。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1和PARG激活而抑制OGD/R誘導的HT22小鼠神經元細胞發生凋亡。

Iduna是一種PAR聚合物依賴的E3泛素連接酶,調節DNA損傷,Iduna對PARP1的OAR依賴泛素化靶向其進行蛋白酶體降解,通過PAR結合和泛素E3連接酶活性,Iduna保護細胞免受DNA損傷劑誘導的細胞死亡[11]。Iduna可通過抑制PARP1誘導的細胞死亡來保護HT22細胞免受過氧化氫誘導的氧化應激[12]。本研究顯示在OGD/R條件下,HT22細胞中Iduna蛋白表達水平下降,經芒柄花素或PARG抑制劑Ethacridine lactate孵育后可部分逆轉,但PARP1抑制劑PJ34卻沒有這種效果。這表明芒柄花素是通過上調Iduna來抑制OGD/R誘導的PARP1表達而減輕HT22小鼠神經元細胞損傷。

有研究[13]說明芒柄花素通過激活AKT磷酸化蛋白介導對大鼠腦缺血/再灌注的神經保護作用,本研究結果與之一致。本研究顯示芒柄花素處理OGD/R后的HT22細胞可升高p-AKT蛋白磷酸化比值,同時,在此研究中,PARP1抑制劑PJ34和PARG抑制劑Ethacridine lactate處理可使OGD/R后的HT22細胞中p-AKT比值升高。這表明芒柄花素可通過抑制PARP1通路來激活AKT的磷酸化而抑制OGD/R誘導的HT22細胞凋亡。

綜上所述,本研究結果顯示HT22小鼠神經元細胞在OGD/R條件下,芒柄花素可通過提高Iduna蛋白表達抑制PARP1/AIF/Akt信號通路來減輕HT22小鼠神經元細胞損傷。這些結果為開發運用錦雞兒異黃酮治療腦缺血再灌注損傷提供了依據,后續可在體內動物模型研究中進一步證明這一機制,以排除體外研究的局限性。