華蟾素通過調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移

尚 靖,王 云,陳進(jìn)寶,唐東豪,賈琳琳,李 煒,于宏杰

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是常見的消化道腫瘤,發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是CRC患者死亡的主要原因[2-3]。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)的主要組成部分,通常表現(xiàn)為促腫瘤的M2樣表型,與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-5]。華蟾素是干蟾皮提取物,目前廣泛應(yīng)用于抗惡性腫瘤治療,對(duì)多種癌癥均有明顯的治療作用。研究[6]顯示華蟾素可以通過調(diào)節(jié)M2型TAMs的極化發(fā)揮抗腫瘤作用。因此,該研究旨在探索華蟾素能否通過調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞極化進(jìn)而發(fā)揮抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基、雙抗(青霉素/鏈霉素)溶液和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)購自美國Sigma公司;CD11b-PE抗體和CD206-FITC抗體購自美國BD Pharmingen公司;RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒購自揚(yáng)州艾瑞克生物科技有限公司;白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司;華蟾素注射液(國藥準(zhǔn)字Z34020273)購自淮北華潤金蟾藥業(yè)股份有限公司;CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司;BD Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS和1%雙抗)培養(yǎng)人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1,在含有5% CO2的37 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 條件培養(yǎng)基(conditioned medium,CM)將HCT116細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,48 h后獲得CMHCT116;用華蟾素處理HCT116細(xì)胞24 h后,更換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,48 h后獲得CMHCT116+華蟾素;THP-1細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含400 ng PMA)培養(yǎng)48 h獲得貼壁的M0細(xì)胞;用CMHCT116和CMHCT116+華蟾素分別處理M0細(xì)胞48 h后,獲得HCT116-Mφ細(xì)胞和(HCT116+華蟾素)-Mφ細(xì)胞;將培養(yǎng)基更換為無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,48 h后分別獲得CMHCT116-Mφ和CM(HCT116+華蟾素)-Mφ;CM用0.22 μm濾器過濾,存放在-20 ℃冰箱備用。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)M0細(xì)胞用不同CM(含10% FBS)培養(yǎng)48 h并收集,取1×106個(gè)細(xì)胞,加入CD11b-PE抗體和CD206-FITC抗體各10 μl,室溫避光孵育25 min后,用流式儀器檢測(cè)。

1.5 RT-qPCRM0細(xì)胞用不同CM(含10% FBS)培養(yǎng)48 h,提取細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,通過RT-qPCR反應(yīng),以β-actin作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-10和TGF-β的相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 ELISAM0細(xì)胞用不同CM(含10% FBS)培養(yǎng)48 h,收集CM,用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-10和TGF-β水平。酶標(biāo)板孔加100 μl樣品,37 ℃、90 min;加抗體,37 ℃、60 min;加親和素-過氧化物酶復(fù)合物,37 ℃、30 min;加顯色液,37 ℃、25 min;加終止液,在450 nm處測(cè)吸光度。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)HCT116細(xì)胞接種于12孔板(5×105個(gè)),待細(xì)胞匯合,用槍頭劃出直線,PBS清洗,加入CM,分別于0 h和24 h拍照,用ImageJ軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 遷移實(shí)驗(yàn)HCT116細(xì)胞接種于6孔板(4×105個(gè)),培養(yǎng)過夜,用CM(含10% FBS)培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞并用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,上室加入2×104個(gè)細(xì)胞,下室加入700 μl含20% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,48 h后進(jìn)行固定、結(jié)晶紫染色、清洗和拍照,用ImageJ軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.9 侵襲實(shí)驗(yàn)預(yù)先用基質(zhì)膠包被Transwell上室的底膜,并按照1.8的方法完成侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)HCT116細(xì)胞接種于96孔板(1.5×104個(gè)),培養(yǎng)過夜,用含不同濃度華蟾素的新鮮培養(yǎng)基刺激24 h后,每孔加入CCK-8溶液10 μl,孵育30 min后在450 nm處檢測(cè)吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 HCT116細(xì)胞使M0細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化用THP-1細(xì)胞經(jīng)過PMA刺激后獲得貼壁的M0細(xì)胞,M0細(xì)胞經(jīng)過CMHCT116刺激48 h獲得HCT116-Mφ細(xì)胞,形態(tài)變?yōu)樗笮钨N壁細(xì)胞(圖1)。

圖1 HCT116細(xì)胞使M0細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化 ×200

2.2 HCT116細(xì)胞促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化為了觀察HCT116細(xì)胞對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的影響,用CMHCT116刺激M0細(xì)胞48 h獲得HCT116-Mφ細(xì)胞,收集細(xì)胞進(jìn)行流式實(shí)驗(yàn)和RT-qPCR實(shí)驗(yàn),收集上清液進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2A所示,與M0相比,HCT116-Mφ細(xì)胞中CD11b+CD206+細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)比例明顯上升(t=14.85,P<0.001)。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示,與M0相比,HCT116-Mφ細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志物IL-10和TGF-β的mRNA水平明顯升高(tIL-10=10.27,tTGF-β=8.694,P<0.001)。ELISA實(shí)驗(yàn)(圖2C)也進(jìn)一步驗(yàn)證了該結(jié)果(tIL-10=7.072,tTGF-β=7.085,P<0.01)。以上結(jié)果表明HCT116細(xì)胞可以促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。

圖2 HCT116細(xì)胞促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化

2.3 M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移為了觀察M2型巨噬細(xì)胞對(duì)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響,分別收集CMM0和CMHCT116-Mφ,刺激HCT116細(xì)胞后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A所示,與CMM0組相比,CMHCT116-Mφ處理的HCT116細(xì)胞的平均劃痕愈合率明顯升高(t=5.367,P<0.01)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(圖3B)也驗(yàn)證了M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)HCT116細(xì)胞遷移能力(t=9.871,P<0.001)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C所示,與CMM0組相比,CMHCT116-Mφ處理的HCT116細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目明顯增多(t=8.557,P<0.01)。這些結(jié)果表明M2型巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖3 M2型巨噬細(xì)胞促進(jìn)HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移 ×100

2.4 華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞極化為了研究華蟾素對(duì)M2型巨噬細(xì)胞極化的影響,選用非殺傷濃度 5 mg/ml(圖 4A)作為干預(yù)濃度。流式實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B,與HCT116-Mφ細(xì)胞相比,(HCT116+華蟾素)-Mφ細(xì)胞中CD11b+CD206+細(xì)胞(M2型巨噬細(xì)胞)比例明顯下降(t=4.151,P<0.05)。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4C,與HCT116-Mφ細(xì)胞相比,(HCT116+華蟾素)-Mφ細(xì)胞中M2型巨噬細(xì)胞的生物標(biāo)志物IL-10和TGF-β的mRNA水平明顯下降(tIL-10=11.88,tTGF-β=14.15,P<0.001)。ELISA實(shí)驗(yàn)(圖4D)也具有同樣的趨勢(shì)(tIL-10=7.09,tTGF-β=5.567,P<0.01)。以上結(jié)果表明華蟾素可以抑制HCT116細(xì)胞介導(dǎo)的M2型巨噬細(xì)胞極化。

圖4 華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞極化

2.5 華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移分別收集CMHCT116-Mφ和CM(HCT116+華蟾素)-Mφ,刺激HCT116細(xì)胞后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A所示,與CMHCT116-Mφ組相比,CM(HCT116+華蟾素)-Mφ處理的HCT116細(xì)胞的平均劃痕愈合率明顯下降(t=3.8,P<0.05)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(圖5B)亦有同樣趨勢(shì)(t=3.505,P<0.05)。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5C所示,與CMHCT116-Mφ組相比,CM(HCT116+華蟾素)-Mφ處理的HCT116細(xì)胞發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)目明顯減少(t=3.540,P<0.05)。這些結(jié)果表明華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

圖5 華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移 ×100

3 討論

越來越多的證據(jù)[7]表明,TAMs作為TME中豐富且活躍的浸潤性炎癥細(xì)胞,不僅在CRC的生長和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用,而且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。TAMs可以極化為M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞,M1型巨噬細(xì)胞可以通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和激活腫瘤免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤作用,M2型巨噬細(xì)胞通過促進(jìn)血管生成、產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)、誘導(dǎo)乏氧TME、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)揮促腫瘤作用,而TAMs通常被腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)極化為M2型巨噬細(xì)胞。例如,Cai et al[8]研究發(fā)現(xiàn),TAMs分泌的TGF-β一旦在與CRC細(xì)胞上的受體結(jié)合,就會(huì)激活Smads/Snail信號(hào)通路,促進(jìn)CRC的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)程,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。不僅如此,TAMs還通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲進(jìn)入血管、促進(jìn)血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞存活、促進(jìn)腫瘤外滲遷移到血管外組織和參與轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成等方式,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[9-10]。本研究用CMHCT116刺激M0巨噬細(xì)胞后,得到梭形的HCT116-Mφ細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示HCT116-Mφ細(xì)胞中的CD11b+CD206+細(xì)胞比例明顯增多,PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)顯示HCT116-Mφ細(xì)胞中IL-10和TGF-β的水平明顯升高,表明HCT116細(xì)胞能促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞極化。用CMM0和CMHCT116-Mφ刺激HCT116細(xì)胞后進(jìn)行的劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)表明,M2型巨噬細(xì)胞能顯著提高HCT116細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

中醫(yī)藥作為治療CRC的有效手段之一,在改善手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療引起的毒副作用的同時(shí),可以通過抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、促進(jìn)自噬、抑制血管生成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,并延長患者的生存時(shí)間[11]。此外,中醫(yī)藥還能通過調(diào)節(jié)TME發(fā)揮抗腫瘤作用,例如調(diào)節(jié)TAMs的極化。華蟾素作為傳統(tǒng)中藥,已廣泛用于癌癥治療和基礎(chǔ)研究,包括CRC[12-14]。Wang et al[15]研究表明華蟾素在體外可以有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,在體內(nèi)可以有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活有關(guān)。本研究進(jìn)一步探索了華蟾素是否通過調(diào)節(jié)M2型巨噬細(xì)胞極化來抑制轉(zhuǎn)移,通過流式細(xì)胞術(shù)、PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)表明華蟾素能明顯抑制M2型巨噬細(xì)胞極化。并通過劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)表明,華蟾素可以抑制M2型巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的HCT116細(xì)胞轉(zhuǎn)移。