彗星實驗方法的優(yōu)化及影響因素的分析

范南英,張 鵬

彗星實驗是一種基于凝膠電泳的方法,可在單細(xì)胞水平上測量DNA損傷。目前,彗星實驗根據(jù)裂解液pH的高低可以分為堿性彗星實驗[1]和中性彗星實驗[2]。堿性彗星實驗靈敏度較高,廣泛用于DNA單鏈、雙鏈斷裂或堿不穩(wěn)定位點的檢測。影響彗星實驗結(jié)果的因素比較多,如瓊脂糖濃度、細(xì)胞密度、電壓以及其他未知原因[3-5],因此實驗中選擇合適的陽性對照對于彗星實驗結(jié)果可信度非常重要。過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)是一種強氧化劑,將細(xì)胞暴露于H2O2會導(dǎo)致細(xì)胞DNA發(fā)生損傷[6]。有研究[7-8]通過400 μmol/L H2O2處理構(gòu)建人肝癌細(xì)胞(HepG2)的損傷模型。另有研究[9-12]選用1 mmol/L H2O2處理的心肌細(xì)胞(H9c2細(xì)胞)構(gòu)建損傷模型。不同細(xì)胞對H2O2的敏感性不同,因此,構(gòu)建細(xì)胞損傷模型時應(yīng)根據(jù)細(xì)胞類型來確定H2O2濃度。目前,體外損傷模型的建立主要集中在肝細(xì)胞或心肌細(xì)胞。對于白血病細(xì)胞HL-60損傷模型構(gòu)建的研究很少。因此,該研究以H2O2為DNA損傷誘導(dǎo)劑,探討影響彗星實驗結(jié)果的可能因素,分析各種影響因素對彗星實驗結(jié)果的可能原因,為穩(wěn)定可靠的彗星實驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用血清(fetal bovine serum, FBS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)、100 000 U/L青鏈霉素均來自美國Gibco公司;6孔板和T25培養(yǎng)瓶購自康寧Corning公司;HL-60細(xì)胞為本實驗室保存。30% H2O2來自重慶川東化工有限公司;NaOH來自天津科密歐公司;Na2EDTA、正常熔點瓊脂糖來自北京索萊寶科技有限公司;月桂?；彼徕c、氯化鈉、低熔點瓊脂糖均來自德國Sigma;磨砂載玻片來自廣州帆船;黏附載玻片和蓋玻片來自江蘇世泰。

1.2 方法

1.2.1HL-60細(xì)胞培養(yǎng) HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于T25的細(xì)胞培養(yǎng)瓶,并使用IMDM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),完全培養(yǎng)基組成包括20% FBS、1%青鏈霉素;每天觀察細(xì)胞生長情況,每隔1 d進(jìn)行1次半量換液,細(xì)胞生長密度約90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2制膠方法的優(yōu)化 傳統(tǒng)的制膠流程為：向載玻片上滴加100 μl正常熔點瓊脂糖,加蓋蓋玻片壓平,4 ℃、10 min后,取下蓋玻片,獲得底層膠;在底膠上加入混有細(xì)胞的低熔點瓊脂糖,并用蓋玻片壓平,4 ℃、10 min后,取下蓋玻片,獲得第二層膠。最后根據(jù)制備底膠的方式制備第三層膠,形成類似“三明治”式的膠層結(jié)構(gòu)。Ostling et al[1]的制膠方法需要3個步驟,制備的膠層較厚,在后續(xù)實驗中容易脫膠。因此,本研究對該方法進(jìn)行了優(yōu)化,將制膠步驟由3步改為2步,具體優(yōu)化步驟如下。

① 底層膠的制備：傳統(tǒng)方法需要向載玻片上滴加100 μl正常熔點瓊脂糖,加蓋蓋玻片(壓片法);優(yōu)化方法為用鍍膜法制備底膠,將潔凈預(yù)熱的磨砂載玻片垂直放置于盛有正常熔點瓊脂糖溶液的燒杯中約1 min,然后水平放置于4 ℃的載玻片架上5 min。對不同濃度的正常熔點瓊脂糖(0.8%、1%)進(jìn)行篩選,觀察后續(xù)實驗中是否有脫膠。② 包埋細(xì)胞膠層的制備：將細(xì)胞懸液與低熔點瓊脂糖凝膠混合(37 ℃),滴加100 μl于底層膠上,蓋上載玻片,4 ℃、10 min。對不同濃度的低熔點瓊脂糖(0.5%、0.7%、1%)進(jìn)行篩選,觀察后續(xù)操作中是否有脫膠。

1.2.3瓊脂糖溶劑的篩選 稱取相應(yīng)克重的瓊脂糖,加入超純水和PBS通過微波爐溶解。

1.2.4膠層中細(xì)胞密度的篩選 收集生長狀態(tài)良好的HL-60細(xì)胞,用PBS調(diào)整細(xì)胞密度為2×105和6×104個/ml,將細(xì)胞懸液與低熔點瓊脂糖溶液按1 ∶3的體積比混勻,取100 μl細(xì)胞-瓊脂糖混合物轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)恼Ｈ埸c瓊脂糖包被的磨砂載玻片上。立即加蓋蓋玻片,注意使載玻片盡可能保持水平,4 ℃、15 min。染色后通過熒光顯微鏡觀察凝膠中細(xì)胞密度。

1.2.5堿性裂解時間的優(yōu)化 將包埋有細(xì)胞的載玻片置于染色缸中,加上堿性裂解液,4 ℃下避光、裂解。對不同裂解時間(1 h、過夜裂解)進(jìn)行篩選,觀察細(xì)胞在瓊脂糖層中的拖尾情況。

1.2.6陽性對照實驗H2O2濃度的篩選 H2O2處理HL-60細(xì)胞20 min,對不同H2O2作用濃度(0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%)進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果

2.1 制膠方法的優(yōu)化本研究對傳統(tǒng)制膠法進(jìn)行了優(yōu)化,即只包含底膠和含細(xì)胞膠層。制備底膠時,采用鍍膜法,制備包埋細(xì)胞膠層時采用壓片法。實驗結(jié)果顯示,鍍膜法制備的底膠表面光滑,可以解決脫膠問題,且易于學(xué)習(xí)和操作,在后續(xù)實驗中沒有發(fā)生脫膠。使用濃度為0.8%和1%的正常熔點瓊脂糖進(jìn)行鍍膜時,濃度為0.8%的正常熔點瓊脂糖制膠效果佳。凝膠能較好的吸附于載玻片上,膠面光滑,在后續(xù)實驗中凝膠沒有發(fā)生脫落。根據(jù)實驗結(jié)果,選擇0.8%正常熔點瓊脂糖溶液制備底膠。結(jié)果顯示,采用濃度為0.5%、0.7%和1%的低熔點瓊脂糖包埋細(xì)胞時,0.7%包埋效果最好。此時凝膠與正常熔點瓊脂糖膜的黏附性較好,在后續(xù)實驗中凝膠沒有發(fā)生脫落(制片操作流程見圖1)。

圖1 彗星實驗制片流程

2.2 瓊脂糖溶劑的選擇將未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞包埋在低熔點瓊脂糖中進(jìn)行實驗,結(jié)果顯示,當(dāng)瓊脂糖溶劑為超純水時,HL-60細(xì)胞出現(xiàn)拖尾(圖2A)。當(dāng)瓊脂糖溶劑為PBS時,HL-60細(xì)胞沒有拖尾(圖2B)。

圖2 瓊脂糖溶劑對彗星實驗結(jié)果的影響 ×20

2.3 合適細(xì)胞密度的選擇在熒光顯微鏡下觀察未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞電泳結(jié)果。結(jié)果顯示,當(dāng)凝膠中細(xì)胞密度為2×105個/ml時,視野中細(xì)胞數(shù)量較多(圖3A),視野內(nèi)細(xì)胞過于密集,不利于圖像分析。當(dāng)凝膠中細(xì)胞密度為6×104個/ml時,可觀察到適量細(xì)胞,約為7個(圖3B),視野中細(xì)胞數(shù)量適宜圖像分析,選擇6×104個/ml作為凝膠中的細(xì)胞密度。

圖3 不同細(xì)胞量在視野中的顯示情況 ×20

2.4 細(xì)胞裂解時間的優(yōu)化將未經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞包埋在低熔點瓊脂糖中進(jìn)行實驗,結(jié)果顯示,過夜裂解細(xì)胞,HL-60細(xì)胞DNA存在拖尾(圖4A)。裂解時間為1 h,HL-60細(xì)胞DNA在電泳中沒有拖尾(圖4B)。

圖4 裂解時間對彗星實驗的影響 ×20

2.5 電泳電壓的優(yōu)化結(jié)果顯示,電壓為0.6 V/cm時,0.001% H2O2處理HL-60細(xì)胞DNA在電泳中形成刺猬狀。電壓為1 V/cm時,此時DNA在電泳中形成的彗星尾清晰,容易判讀。電壓為1.5 V/cm時,DNA在電泳中形成的彗星尾清晰度較差,不易判讀。電壓為1.75 V/cm時,DNA在電泳中形成的彗星尾和彗星頭部已經(jīng)分離。見圖5。

圖5 不同電壓大小對彗星實驗的影響 ×20

2.6 陽性對照實驗的篩選本研究通過優(yōu)化后的彗星實驗檢測不同濃度的H2O2(0.1%、0.01%、0.001%、0.000 1%)處理的HL-60細(xì)胞DNA損傷情況,驗證優(yōu)化后的實驗體系是否可靠,并建立DNA損傷模型。結(jié)果顯示,0.1%、0.01%和0.001% H2O2處理細(xì)胞DNA都出現(xiàn)拖尾,但0.1%和0.01% H2O2處理組DNA拖尾較大,彗星頭和彗星尾已分離,不易判讀。0.000 1% H2O2處理組細(xì)胞在電泳中形成刺猬狀,不易觀察。見圖6。

圖6 不同濃度H2O2對HL-60 DNA損傷影響 ×20

3 討論

彗星實驗是一種靈敏、快速的實驗方法,用于檢測真核生物單個細(xì)胞中DNA雙鏈和單鏈斷裂以及堿不穩(wěn)定位點[3]。近年來,該方法已廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)、環(huán)境生物監(jiān)測和細(xì)胞凋亡等研究[4-5]。本研究探討了影響彗星實驗結(jié)果的可能因素,為穩(wěn)定可靠的彗星實驗提供理論依據(jù)。

傳統(tǒng)彗星實驗存在操作復(fù)雜,膠面不光滑和易脫膠等問題[13]。底膠不均勻和脫膠的原因主要是制備底膠時采用壓片法,需要將蓋玻片揭去。本研究采用鍍膜法制備底膠克服了膠體不均勻和脫膠的問題。實驗表明,包埋膠層的脫膠主要與低熔點瓊脂糖的濃度和涂膠方式有關(guān)。若采用“三明治”法制膠,每一層膠凝固后都需移去蓋玻片,極易導(dǎo)致脫膠。經(jīng)優(yōu)化后,以0.7%低熔點瓊脂糖作為包埋層,采用“壓片法”將其展開,這種“雙層凝膠法”操作簡便,較好地解決了脫膠問題。在制膠過程中確保細(xì)胞完整性也是實驗成功的關(guān)鍵點,當(dāng)溶劑為超純水時,未經(jīng)處理的HL-60細(xì)胞出現(xiàn)拖尾。超純水促使細(xì)胞膜破裂,暴露的DNA與凝膠中存在的水和氧自由基(ROS,reactive oxygen species)進(jìn)行水解和氧化反應(yīng),從而導(dǎo)致DNA損傷[14]。以PBS為溶劑,它能較好維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理完整性,有助于細(xì)胞保持在其生理pH范圍內(nèi),并在短期內(nèi)保持細(xì)胞高活力[15]。

細(xì)胞密度也會影響彗星實驗結(jié)果的判讀[4],最佳的細(xì)胞密度是決定實驗成敗的關(guān)鍵因素。一個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)盡可能多,同時又不重疊,這樣圖像的獲取快速又方便。結(jié)果表明,當(dāng)細(xì)胞密度為6×104個/ml時,視野中約有7個細(xì)胞,細(xì)胞分布較好,適合凝膠中的細(xì)胞密度。同時,細(xì)胞密度也需要根據(jù)待測細(xì)胞的類型來確定[4]。當(dāng)細(xì)胞DNA損傷嚴(yán)重時,彗星拖尾較長,應(yīng)適當(dāng)降低細(xì)胞密度。當(dāng)細(xì)胞DNA損傷較輕時,可適當(dāng)增加細(xì)胞密度。

由于電泳電壓和裂解時間會對彗星實驗結(jié)果產(chǎn)生影響,因此,每次實驗的電泳條件應(yīng)保持一致,以避免因電泳條件不同而出現(xiàn)“假陽性”結(jié)果。本實驗中,電壓為1 V/cm,電流為25 mA,電泳時間為25 min可以將損傷的DNA泳出。若電壓太小,斷裂DNA不能被泳出;電壓太大,則形成的彗尾較大,不利于圖像分析。因此,選擇1 V/cm電壓作為該實驗的電泳電壓。

由于彗星實驗結(jié)果的影響因素繁多,因此在實驗中需要設(shè)置對照來確保實驗設(shè)計的合理性、實驗結(jié)果的可靠性和有效性。H2O2進(jìn)入細(xì)胞會產(chǎn)生氧自由基從而造成細(xì)胞的DNA損傷,本研究采用H2O2作為DNA損傷劑誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞以建立陽性對照。實驗顯示,0.001% H2O2誘導(dǎo)HL-60形成的損傷圖像清晰,彗星頭清晰,彗尾長度適中,結(jié)果容易判讀,根據(jù)實驗結(jié)果,選擇0.001% H2O2誘導(dǎo)作為該實驗的陽性模型。高濃度H2O2(0.1% H2O2和0.01% H2O2) 誘導(dǎo)HL-60形成的損傷較嚴(yán)重,彗星頭很小,結(jié)果不容易判讀。同時低濃度H2O2(0.000 1%) 誘導(dǎo)HL-60形成的圖像為刺猬狀,不容易產(chǎn)生彗星。因此,在實際彗星實驗中要針對不同細(xì)胞選擇合適的H2O2作為陽性處理。

綜上所述,彗星實驗作為檢測DNA損傷的經(jīng)典方法,結(jié)果會受到多方面的因素影響,這些影響因素可能出現(xiàn)的原因及解決的方法如表1所示。在實驗過程中通過實驗流程的優(yōu)化和陽性對照實驗的建立才能保證準(zhǔn)確有效彗星實驗結(jié)果。

表1 彗星實驗障礙及解決方法