過表達(dá)NRF1減輕阿爾茨海默病模型小鼠的線粒體和認(rèn)知功能障礙

蘇立寧,王艷兵,張永財(cái)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病,目前尚沒有治愈的方法[1]。近來研究[2]顯示,AD的發(fā)病機(jī)制不單獨(dú)是淀粉樣β蛋白(amyloid-β protein,Aβ)沉積的線性下游結(jié)果,而是一種多種因素共同參與調(diào)控的疾病。其中,線粒體功能障礙可能是驅(qū)動(dòng)更為普遍的散發(fā)遲發(fā)性AD病理生理學(xué)的主要損傷,并將其稱為“線粒體級(jí)聯(lián)假說”[3-4]。線粒體生物發(fā)生在維持和調(diào)節(jié)線粒體穩(wěn)態(tài)以及協(xié)調(diào)核基因組和線粒體基因組方面起著重要作用,但其受一系列信號(hào)因子調(diào)控。核呼吸因子1(nuclar respiratory factor-1,NRF1)是線粒體生物合成和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]。之前已有文獻(xiàn)[6-7]顯示NRF1在包括AD在內(nèi)的多種神經(jīng)退行性疾病中表達(dá)異常降低且其與線粒體生物發(fā)生和功能受損有關(guān),并且擾亂線粒體穩(wěn)態(tài)能加劇學(xué)習(xí)和記憶障礙[8]。這些研究提示了AD的進(jìn)展與NRF1異常潛在相關(guān),但其在AD中的具體作用和機(jī)制仍不明確。因此,該研究檢測了NRF1對AD相關(guān)表型的調(diào)控作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑與抗體 NRF1和GAPDH抗體(美國Sigma-Aldrich公司),HRP或Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司),攜帶過表達(dá)NRF1或?qū)φ?Con)的AAV載體以及稀疏標(biāo)記的AAV(上海和元生物技術(shù)有限公司),BCA蛋白濃度測定試劑盒以及ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.2小鼠 7月齡SPF級(jí)5×FAD小鼠(n=40,雄性,體質(zhì)量26～30 g)作為AD模型小鼠,WT同窩仔(C57BL/6J小鼠,n=20,雄性,體質(zhì)量26～30 g)作為正常對照小鼠。所有小鼠均購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(蘇)2021-0013],飼養(yǎng)在12 h光/暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)SPF條件下,小鼠可自由獲得食物和水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北北方學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.3主要儀器 EM UC7型切片機(jī)(德國Leica公司);JEM-1400 PLUS型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);LSM880型激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司);Western blot印跡系統(tǒng)(美國Bio-rad公司);e-Blot凝膠成像系統(tǒng)(上海易孛特光電技術(shù)有限公司);51730型小鼠腦立體定位儀(上海玉研科學(xué)儀器有限公司);BHV-M1型Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京必海微科技有限公司);MED64型平面微電極矩陣(電生理)記錄系統(tǒng)(日本Alpha Med Science公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫熒光 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠后,用PBS灌注,然后用4%多聚甲醛灌注。將腦取出,然后在4 ℃下在4%多聚甲醛中后固定24 h。之后,將腦在30%蔗糖溶液中脫水,直到腦沉入底部。將樣品嵌入最佳切割溫度復(fù)合物(OCT)中包埋,低溫下用徠卡EM UC7切片機(jī)切為8 μm厚的切片。切片在室溫下晾干,PBS清洗3次,用含0.3% Triton X-100的5% BSA在37 ℃封閉2 h,然后在4 ℃孵育NRF1抗體(1 ∶500)過夜,用PBS清洗3次后,Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗兔IgG抗體(1 ∶500)在室溫下孵育1.5 h,用含DAPI的封片液封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.2腦立體定位顯微注射 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠,將其置于小鼠腦立體定位儀中。用微量注射針將過表達(dá)NRF1和對照的AAV病毒及其稀疏標(biāo)記的AAV雙側(cè)注射入背側(cè)海馬 (AP=-2.0 mm,ML=1.2 mm,DV=2 mm,0.5 μl),注射后,留針5 min,然后慢慢抽出。注射14 d后進(jìn)行行為測試。然后,麻醉下處死小鼠取雙側(cè)海馬,通過Western blot和熒光評(píng)估NRF1的過表達(dá)情況;用電鏡觀察海馬線粒體形態(tài);激光共聚焦顯微鏡下觀察CA1區(qū)稀疏標(biāo)記神經(jīng)元的樹突棘并計(jì)數(shù)。

1.2.3透射電子顯微鏡 戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉小鼠后,用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)灌注,然后再用4%多聚甲醛灌注。將海馬組織(1 mm3)小塊快速解剖分離,并用2.5%戊二醛在4 ℃下固定過夜,再1%鋨酸固定1 h,將組織被嵌入Eponate 12包埋樹脂中,并用徠卡EM UC7切片機(jī)沿冠狀面切成60～80 nm厚的切片。鉛染后,由雙盲的病理學(xué)家通過JEM-1400 PLUS透射電子顯微鏡檢測線粒體形態(tài)。

1.2.4Western blot 用RIPA緩沖液裂解海馬組織,然后按操作說明書步驟,在4 ℃下11 000 r/min離心25 min收集蛋白上清液。根據(jù)制造商的說明,通過BCA法檢測蛋白的濃度。每樣品取蛋白上清液(含25 μg蛋白)與上樣緩沖液在100 ℃下煮沸5 min,然后進(jìn)行電泳分離和轉(zhuǎn)印。在室溫下,用5%牛奶封閉1.5 h,然后在4 ℃下孵育一抗(GAPDH,1 ∶8 000;NRF1,1 ∶1 000)過夜。PBS-T緩沖液(含0.05%吐溫20的PBS)洗滌3次后,室溫下孵育HRP標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1 ∶2 000)1.5 h。用ECL試劑顯示條帶,并用e-Blot成像系統(tǒng)采集圖像。用Image J軟件分析條帶的強(qiáng)度。

1.2.5Morris水迷宮 用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(內(nèi)徑120 cm,高50 cm,可升降的站臺(tái)直徑9 cm)評(píng)估小鼠的空間記憶。將其充滿不透明的水并保持在23 ℃(水深30 cm),分成4個(gè)象限,站臺(tái)位于水面下1 cm處。測試小鼠在1 d內(nèi)從4個(gè)象限釋放,在90 s內(nèi)自由游泳,若老鼠沒有找到隱藏的站臺(tái),引導(dǎo)老鼠到隱藏的站臺(tái)并停留15 s。在最后一次訓(xùn)練24 h后進(jìn)行空間探測試驗(yàn),站臺(tái)降至水底,從放置隱藏平臺(tái)的相反象限釋放小鼠,記錄小鼠停留在隱藏站臺(tái)的時(shí)間。之后,通過在對面的水面上放置一個(gè)帶有旗幟的水下站臺(tái)來進(jìn)行暗示測試。對每只小鼠進(jìn)行1次試驗(yàn),并記錄到達(dá)站臺(tái)的時(shí)間。

1.2.6海馬離體腦片電生理學(xué) 小鼠麻醉后,迅速取出大腦,分離出海馬體,置于人工腦脊液(由124 mmol/L NaCl、3 mmol/L KCl、26 mmol/L NaHCO3、1.25 mmol/L NaH2PO4、2 mmol/L CaCl2、1 mmol/L MgSO4和10 mmol/L D-葡萄糖組成)在室溫下孵育2 h,并制作400 μm厚的海馬切片。在CA1區(qū)的Schaffer側(cè)支-連合纖維CA1錐體細(xì)胞通路中記錄場電位反應(yīng)。用100 Hz脈沖以30 s的間隔刺激,記錄興奮性突觸后電位(field excitatory postsynaptic potential,fEPSP)。在穩(wěn)定基線開始后20 min引入兩列高頻刺激(high frequency stimulation,HFS： 100 Hz,1秒內(nèi)100個(gè)脈沖,間隔30 s),誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)(long-term potentiation,LTP)。通過將HFS期后90 min的平均fEPSP斜率與基線期的平均fEPSP斜率進(jìn)行比較并計(jì)算相對于基線的百分比變化來量化LTP。

2 結(jié)果

2.1 AD模型小鼠中NRF1蛋白表達(dá)情況和NRF1過表達(dá)模型構(gòu)建免疫熒光染色結(jié)果顯示,5×FAD小鼠海馬NRF1染色熒光強(qiáng)度相對于WT小鼠下降(圖1A)。Western blot結(jié)果,與WT對照相比,5×FAD小鼠海馬NRF1蛋白水平顯著降低(t=6.251,P<0.001) (圖1B)。將過表達(dá)NRF1的AAV病毒注射到5×FAD小鼠的海馬區(qū)域,熒光顯微圖片顯示AAV病毒注射成功(圖1C);同時(shí)用Western blot驗(yàn)證NRF1過表達(dá)的效率,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組NRF1蛋白顯著上調(diào)(圖1D,t=8.432,P<0.001),表明NRF1基因在海馬中過表達(dá)成功。

圖1 各組小鼠中海馬NRF1表達(dá)情況

2.2 各組小鼠海馬神經(jīng)元中線粒體形態(tài)變化用透射電鏡觀察AD模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體損傷情況,對照WT小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元線粒體正常,5×FAD小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著改變,呈現(xiàn)線粒體腫脹且線粒體嵴消失(圖2A)。進(jìn)一步觀察了過表達(dá)NRF1對海馬神經(jīng)元線粒體損傷的影響(圖2B),AAV-NFR1組5×FAD小鼠海馬神經(jīng)元線粒體腫脹和線粒體嵴的喪失的病理變化較AAV-Con組減輕,表明NRF1可改善AD小鼠的線粒體損傷。

2.3 NRF1過表達(dá)緩解5×FAD小鼠的認(rèn)知和記憶功能Morris水迷宮測試評(píng)估過表達(dá)NRF1對5×FAD小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶。各組訓(xùn)練路徑中的游泳速度相似,在第2至5天,AAV-NFR1組隱藏站臺(tái)的逃避潛伏期比對照組顯著降低(圖3A,t=4.014、5.906、10.132、12.048,P<0.01或P<0.001),在用于評(píng)估記憶回憶的測試(隱藏站臺(tái)被移除)中,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1在目標(biāo)象限中的時(shí)間百分比以及穿過平臺(tái)的次數(shù)間均顯著增多(圖3B、3C,t=11.536、18.062,P<0.001)。這些結(jié)果表明,在海馬中的NRF1過表達(dá)能增強(qiáng)了AD小鼠的認(rèn)知和記憶功能。

圖3 過表達(dá)NRF1減輕5×FAD小鼠的認(rèn)知和記憶功能障礙(n=8)

2.4 過表達(dá)NRF1改善海馬突觸可塑性為確定過表達(dá)NRF1對樹突棘的影響,在小鼠的海馬中使用稀疏標(biāo)記染色定量樹突棘,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組小鼠的樹突棘密度顯著增高(圖4A、B,t=9.532,P<0.001),表明過表達(dá)NRF1降低了5×FAD小鼠樹突棘的丟失。為測試過表達(dá)NRF1是否可挽救AD中受損的海馬突觸可塑性,研究了其對長時(shí)程增強(qiáng)的影響,與AAV-Con組相比,AAV-NFR1組在整個(gè)90 min的記錄時(shí)間周期內(nèi)產(chǎn)生了持久穩(wěn)定的LTP(圖4C),fEPSP斜率顯著增高(圖4D,t=3.408,P<0.01),表明NRF1干預(yù)可使受損的LTP得到挽救。

圖4 過表達(dá)NRF1挽救AD小鼠海馬突觸可塑性受損(n=8)

3 討論

幾十年來,Aβ一直被認(rèn)為是緩解AD的主要靶點(diǎn),但迄今為止,以靶向Aβ為主的方法在臨床試驗(yàn)中均產(chǎn)生了令人失望的結(jié)果[9]。與此同時(shí),近期越來越多的文獻(xiàn)[3-4]揭示了AD患者腦的海馬神經(jīng)元線粒體功能受損,提示以線粒體為細(xì)胞生物能學(xué)靶點(diǎn)治療AD的策略的可能性。然而,在AD的發(fā)生和發(fā)展過程中,線粒體功能障礙的具體受影響的分子機(jī)制仍不清楚。本研究結(jié)果表明,NRF1介導(dǎo)的線粒體功能障礙在AD模型的5×FAD小鼠中調(diào)控了AD病程的進(jìn)展。

為證實(shí)5×FAD 小鼠(AD模型小鼠)與AD病人在線粒體病理改變方面的一致性,本研究首先對5×FAD小鼠海馬神經(jīng)元的線粒體形態(tài)進(jìn)行電鏡觀察,確認(rèn)了線粒體損傷的發(fā)生。NRF1是一種核轉(zhuǎn)錄因子,主要作為線粒體生物發(fā)生相關(guān)基因的正調(diào)節(jié)因子[5]。本研究中,NRF1在5×FAD小鼠海馬中顯著降低,這提示了NRF1相關(guān)的線粒體功能異常可能在5×FAD小鼠AD相關(guān)癥狀進(jìn)展中發(fā)揮作用。為驗(yàn)證課題組提出的NRF1在AD發(fā)揮作用中的假設(shè),本實(shí)驗(yàn)利用攜帶過表達(dá)NRF1的AAV病毒對5×FAD小鼠進(jìn)行腦立體定位注射干預(yù),并在確認(rèn)病毒工具工作良好后進(jìn)行疾病表型直接相關(guān)的認(rèn)知功能檢測。水迷宮的空間學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)是反映海馬損傷和神經(jīng)認(rèn)知性能的重要指標(biāo)[10-11]。本研究通過Morris水迷宮表現(xiàn),建立了直接干預(yù)海馬中NRF1與5×FAD小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶之間的聯(lián)系。正如預(yù)期,NRF1過表達(dá)小鼠表現(xiàn)出更短的到達(dá)站臺(tái)的時(shí)間,此外,其在目標(biāo)象限花費(fèi)的時(shí)間及穿越次數(shù)也顯著增多,這些Morris水迷宮測試的結(jié)果表明,5×FAD小鼠空間學(xué)習(xí)缺陷的原因至少部是由于其海馬神經(jīng)元的NRF1表達(dá)降低所致。并且在隨后的線粒體檢測中,本研究結(jié)果與之前報(bào)道的一致,NRF1表達(dá)刺激線粒體生物發(fā)生,在維持足夠的功能性神經(jīng)元線粒體質(zhì)量中發(fā)揮重要作用[6-7, 12]。

越來越多的證據(jù)[13-14]表明AD患者的樹突棘減少,而維持適當(dāng)?shù)臉渫患芏葘τ贏D患者和AD小鼠的突觸功能和認(rèn)知行為至關(guān)重要。本研究評(píng)估了過表達(dá)NRF1干預(yù)對5×FAD小鼠樹突棘密度的影響,結(jié)果顯示過表達(dá)NRF1干預(yù)的小鼠海馬組織中更為豐富的樹突棘形態(tài)學(xué)改變。眾所周知,線粒體結(jié)構(gòu)和功能的變化對維持突觸可塑性的功能至關(guān)重要[15]。神經(jīng)元末梢結(jié)構(gòu)受損的線粒體功能,可能無法在突觸處產(chǎn)生ATP,導(dǎo)致突觸損傷[16]。本研究利用NRF1過表達(dá)病毒的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了這一突觸的解剖結(jié)構(gòu)的缺陷,且后續(xù)的LTP功能實(shí)驗(yàn)也佐證了過表達(dá)NRF1可挽救5×FAD小鼠海馬突觸可塑性受損。

綜上所述,本研究觀察表明NRF1異常表達(dá)途徑介導(dǎo)的線粒體功能異常可能是AD表現(xiàn)發(fā)展的病理機(jī)制之一,這種機(jī)制直接參與了認(rèn)知功能相關(guān)的突觸可塑性改變。從治療角度來看,利用NRF1相關(guān)的線粒體干預(yù)靶點(diǎn)可能是一種減緩AD發(fā)病的潛在的藥理學(xué)方法。