基于Nrf2-HO-1/GPX4信號軸探討中藥靛玉紅衍生物E804抑制肺癌A549細胞增殖和遷移的作用機制

袁育珺,曹華華,趙 敏,羅宇慧,張素梅

肺癌主要有兩種類型：非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌,其中NSCLC約占所有新診斷肺癌的85%[1],是肺癌主要的病理類型。越來越多的臨床研究[2]證實,鐵死亡在NSCLC中發揮著重要的調控作用,甚至在一線抗癌藥物中能夠作為一種“催化劑”增強NSCLC的治療療效。鐵死亡是一種新型的非凋亡細胞死亡模式,其特征是鐵依賴性的脂質過氧化和活性氧(reactive oxygen species,ROS)堆積[3]。研究[4-5]表明核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)-血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase 4,GPX4)軸參與鐵死亡調控,與臨床上多種疾病的發生和發展有關,如腫瘤、類風濕性關節炎、神經退行性疾病、缺血再灌注和心臟相關疾病等。課題組前期研究顯示,中藥靛玉紅衍生物E804可通過抑制細胞的增殖、遷移和分化等多種機制發揮抗NSCLC系A549細胞作用,但其抑制肺癌細胞增殖和遷移是否與細胞鐵死亡有關尚不清楚。所以,該研究探討E804抑制A549細胞增殖和遷移與細胞鐵死亡的關系,并從Nrf2-HO-1/GPX4信號軸探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器SW-CJ-1F標準型凈化工作臺購自蘇州安泰公司;NBS 150型CO2培養箱購自美國BioTek公司;自動化酶標儀、蛋白提取儀、垂直和水平電泳槽、電泳儀、蛋白凝膠成像系統均購自美國Bio-Rad公司;DMI3000B倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 試劑E804購自武漢遠成生物科技有限公司;肺癌A549細胞由實驗室內部提供,其基礎營養液(如DMEM和小牛血清)均購自北京索萊寶科技有限公司;細胞壞死抑制劑(necrostatin-1,Nec-1)、細胞自噬抑制劑(chloroquine,CQ)、細胞凋亡抑制劑[Z-Val-Ala-Asp(OMe),Z-VAD]、細胞鐵死亡抑制劑(deferoxamine,DFO)、細胞鐵死亡抑制劑(ferrostatin-1,Fer-1)和細胞鐵死亡抑制劑(Liproxstatin-1,Lip-1)均購自美國TargetMol公司;DCFH-DA試劑盒購自美國Sigma公司;二價鐵離子(Fe2+)檢測試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒和丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒均購自合肥碧云天生物試劑公司;鐵死亡相關一抗(SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Transferrin、Nrf2、HO-1和β-actin)購自美國Santa Cruz公司,分裝后于-70 ℃ 冰箱保存;Western blot相應二抗(如：山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG)均購自美國Pierce公司。

1.3 方法

1.3.1MTT法檢測各組細胞增殖率 A549細胞株接種于含10%小牛血清的DMEM培養基中,置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。取對數期生長的A549細胞進行下列實驗。細胞隨機分為對照組(0 μmol/L E804)、10 μmol/L E804組和不同抑制劑組(10 μmol/L E804分別加10 μmol/L Nec-1、15 μmol/L CQ、10 μmol/L Z-VAD、10 μmol/L DFO、10 μmol/L Fer-1和1 μmol/L Lip-1)。處理72 h。MTT實驗嚴格參考文獻操作,按如下公式計算細胞增殖率：增殖率%=[對照孔(optical density,OD)570-試驗孔OD570]/對照孔OD570×100%[6],實驗重復3次。

1.3.2細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 取對數期生長的A549細胞,按照“1.3.1”進行分組,具體方法嚴格按照參考文獻[6]。各組細胞于0 h做好標記并拍照,處理72 h后拍照。實驗重復3次。

1.3.3DCFH-DA檢測各組細胞活性氧ROS水平 取對數期生長的A549細胞,隨機分為對照組(0 μmol/L E804)、2.5、5和10 μmol/L E804組。處理72 h,室溫下各組加10 μmol/L DCFH-DA處理10 min,PBS洗滌3次,熒光顯微鏡下觀察并拍照,各組熒光含量用熒光酶標儀進行定量。實驗重復3次。

1.3.4試劑盒檢測各組細胞中Fe2+、MDA和GSH水平 取對數期生長的A549細胞,按照“1.3.3”進行分組。用Fe2+檢測試劑盒(比色法)、MDA檢測試劑盒(分光光度法)和GSH檢測試劑盒(微量法)分別檢測各組細胞中的Fe2+、MDA和GSH含量,嚴格按照相應說明書操作。

1.3.5Western blot檢測各組細胞中蛋白表達水平 取對數生長的A549細胞,按照“1.3.3”進行批量分組。按參考文獻[6]方法：提取細胞總蛋白、蛋白濃度定量和蛋白加熱變性。每孔上樣30 μg相應蛋白樣品,采用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行電泳,將相應蛋白轉移置PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫下結合2 h,PBS洗膜3次,分別加入目標蛋白濃度SLC7A11(1 ∶800)、GPX4(1 ∶1 100)、SLC40A1(1 ∶500)、Transferrin(1 ∶800)、β-actin(1 ∶2 000)、Nrf2(1 ∶1 000)和HO-1(1：1 500),置于4 ℃搖床過夜;次日PBS洗膜3次,加入相應目標蛋白二抗SLC7A11(1：1 000)、GPX4(1：800)、SLC40A1(1 ∶1 500)、Transferrin(1 ∶1 000)、β-actin (1 ∶2 000)、Nrf2(1 ∶1 500)和HO-1(1 ∶1 000)室溫下孵育2 h,PBS洗膜3次,暗室內ECL顯影并拍照,實驗重復3次。本次實驗采用β-actin作為參照,運用Image Pro 4.5 軟件掃描目標條帶灰度值,根據灰度值計算目標蛋白表達水平,目標蛋白表達水平=目標蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結果

2.1 特異性抑制劑對各組細胞增殖影響本實驗使用特異性抑制劑處理72 h, MTT檢測結果顯示：與10 μmol/L E804組比較,細胞壞死抑制劑(Nec-1)組和細胞自噬抑制劑(CQ)組對A549細胞的增殖影響較小(P>0.05);而細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)組和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)組A549細胞的增殖有提升(P<0.01)。見圖 1。

圖1 MTT法檢測各組細胞增殖率

2.2 各組細胞遷移情況本實驗使用特異性抑制劑處理72 h, 細胞劃痕結果顯示,與10 μmol/L E804組比較,細胞壞死抑制劑(Nec-1)組和細胞自噬抑制劑(CQ)組對A549細胞的遷移影響較小(P>0.05);而細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)組和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)組A549細胞的遷移距離有提升(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 細胞劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力(×100)

圖3 各組細胞遷移距離

2.3 各組細胞中ROS水平不同濃度 E804處理A549細胞72 h,熒光染色結果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組熒光強度逐漸增強,即各組ROS水平逐漸增強(F=102.3,P<0.01)。見圖4、5。

圖4 E804對A549細胞內ROS的影響 ×400

圖5 各組細胞熒光相對含量

2.4 各組細胞中Fe2+、MDA和GSH水平不同濃度E804處理A549細胞72 h,試劑盒檢測結果顯示,與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組Fe2+和MDA水平逐漸增強(F=71.21、65.02,P<0.01),而GSH水平逐漸減弱(F=76.54,P<0.01)。見圖6。

圖6 E804對A549細胞鐵死亡的影響

2.5 各組細胞鐵死亡相關蛋白表達水平不同濃度 E804處理A549細胞72 h,Western blot檢測結果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/LE804組SLC7A11、GPX4和SLC40A1表達水平逐漸降低(F=25.21、45.13、29.33,P<0.01);而Transferrin表達水平均逐漸升高(F=51.24,P<0.05)。見圖7。

圖7 Western blot法檢測各組細胞鐵死亡相關蛋白電泳圖(A)和直條圖(B)

2.6 各組細胞Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達水平不同濃度E804處理A549細胞72 h,Western blot檢測結果顯示：與對照組比較,2.5、5和10 μmol/L E804組Nrf2和HO-1蛋白表達水平逐漸降低(F=34.58、44.71,P<0.01)。見圖8。

圖8 Western blot法檢測各組細胞Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白表達電泳圖(A)和直條圖(B)

3 討論

腫瘤細胞群體是一個高度異質性的群體,盡管醫學在腫瘤治療領域取得了突破性進展,但腫瘤依然是全球第二大致死因素[7]。對于NSCLC,盡管傳統藥物治療、抗血管生成治療、免疫治療和靶向治療等新興療法都取得了重大突破,但治療仍然存在難點。因此,迫切需要開發用于肺癌患者的新型藥物。天然產物是藥用化合物的寶庫,也是新型抗腫瘤活性成分的重要資源[8]。本課題組前期研究顯示從傳統中藥靛玉紅中分離的有效成分E804能有效抑制A549細胞的增殖和遷移,是具有開發前景的天然抗腫瘤藥物。

耐藥性仍舊是腫瘤患者治愈的主要限制因素,目前多數抗癌藥物主要通過觸發腫瘤細胞凋亡發揮作用,然而,腫瘤細胞對凋亡的內在性、獲得性抵抗,使治療效果受限[9]。因此,利用其他形式的非凋亡性細胞死亡為腫瘤清除提供新的治療策略,如鐵死亡。鐵死亡是近年來發現的一種與凋亡和壞死及自噬不同的程序性細胞死亡方式,特點是細胞內脂質活性氧的增加速度超過細胞自身抗氧化系統的代償,繼而誘導細胞發生死亡[3]。鐵死亡發生時,分子層面主要表現為：細胞內鐵超載、ROS的水平增加、GSH的水平降低以及線粒體發生特征性變化[10];蛋白層面主要表現為：溶質載體家族(如SLC7A11,SLC40A1等)表達降低,GPX4表達降低,Transferrin表達升高,其中GPX4表達降低是鐵死亡中最重要的分子事件[11-12]。本次研究采用不同濃度E804刺激A549細胞,結果顯示細胞內鐵死亡被激活,表現為ROS、Fe2+和MDA水平呈上升趨勢,GSH含量呈下降趨勢;同時,SLC40A1、GPX4和SLC7A11蛋白表達水平呈下降趨勢,Transferrin表達水平呈上升趨勢。進一步的結果顯示,細胞凋亡抑制劑(Z-VAD)和細胞鐵死亡抑制劑(DFO、Fer-1和Lip-1)均能夠部分逆轉E804對細胞的增殖和遷移抑制作用。這些結果提示,E804誘導A549細胞出現氧化損傷,推測E804對A549細胞的增殖和遷移抑制作用可能與鐵死亡有關。

鐵死亡是一個嚴謹并且復雜的過程,受多種轉錄因子和通路調控。Nrf2是一種重要的轉錄因子,通過上調SLC7A11和GPX4抑制細胞鐵死亡,也參與調節細胞的GSH合成、鐵代謝和中間代謝物,被認為是鐵死亡的重要調節因子[13]。HO-1是最典型的誘導型酶,受Nrf2基因調控。氧化應激條件下,轉錄因子Nrf2啟動內源性抗氧化反應元件,并激活若干下游抗氧化酶的轉錄,如HO-1[14]。最近研究[15]表明,在癌旁組織和腫瘤組織中Nrf2-HO-1/GPX4軸異常激活,高表達于不同類型的人類惡性腫瘤中。Western blot結果顯示：E804能明顯降低Nrf2、HO-1和GPX4表達水平,抑制A549細胞內Nrf2-HO-1/GPX4抗氧化軸,增加脂質過氧化和ROS積累,進一步加重細胞鐵死亡。

綜上所述,E804可能通過抑制A549細胞內Nrf2-HO-1/GPX4抗氧化軸,下調SLC7A11、GPX4、SLC40A1、Nrf2和HO-1蛋白表達水平,上調Transferrin蛋白表達水平,使細胞內ROS、脂質過氧化水平和二價鐵離子濃度升高,脂質過氧化產物MDA積累也增多,GSH含量降低,誘導細胞鐵死亡,并且抑制A549細胞增殖和遷移。本研究結果顯示E804對A549細胞株具有良好的抗腫瘤活性,為臨床應用提供實驗依據。