一種綠豆柱頭外露突變體的轉錄組分析

宋夢媛 郭中校 蘇禹霏 鄧昆鵬 蘭天嬌 程鈺鑫 包淑英王桂芳 竇金光 姜澤鍇 王明海,* 徐 寧,*

一種綠豆柱頭外露突變體的轉錄組分析

宋夢媛1,2郭中校1蘇禹霏1,2鄧昆鵬1蘭天嬌1程鈺鑫1包淑英1王桂芳1竇金光1姜澤鍇1,2王明海1,*徐 寧1,*

1吉林省農業科學院作物資源研究所 / 作物種質資源吉林省實驗室, 吉林公主嶺 136100;2吉林農業大學農學院, 吉林長春 130118

柱頭外露作為提高作物異交率、制種純度和降低制種成本的優良性狀, 在雜交制種中得到了廣泛的利用。綠豆是一種閉花授粉的作物, 被報道的柱頭外露突變體很少。通過對冀綠7號的化學誘變, 發現了1個柱頭外露突變體, 為明確該突變體柱頭外露的分子機制, 對該突變體及其野生型冀綠7號即將開放的花蕾進行了轉錄組測序(RNA-seq)分析。根據差異倍數|log2(Fold Change)|≥1,≤0.05的標準篩選, 在中共得到572個差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs), 其中262個DEGs上調, 310個DEGs下調。在基因本體(gene ontology, GO)數據庫中, 差異表達基因顯著富集到代謝和生物合成等生物過程, 定位在質外體和細胞壁、細胞膜等區域, 與結合、氧化還原等分子功能有關。在京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genome, KEGG)數據庫中, 差異表達基因顯著富集在植物激素信號傳導、次生代謝物生物合成等通路。功能注釋發現許多有關細胞壁合成和代謝、細胞分裂和細胞擴張、植物激素相關的基因, 因此推測突變體中龍骨瓣的細胞分裂、細胞擴張以及植物激素信號傳導過程受到影響, 從而導致了柱頭外露。本研究為今后探究綠豆柱頭外露的分子機制以及該性狀在綠豆雜種優勢中的利用奠定了基礎。

綠豆; 柱頭外露; 突變體; 轉錄組; 高通量測序; 雜種優勢

綠豆(L.)屬于豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionaceae)豇豆屬(), 是我國主要食用豆類之一[1]。受市場價格、主產區種植結構調整、種植效益以及國家相關政策等因素的影響, 我國綠豆產業中出現了種植面積先增后減, 進口量連年增加等問題[2]。中國綠豆單產水平雖然高于印度等主產國, 但僅約為1000 kg hm-2 [3], 單產水平的提高成為發展綠豆產業亟待解決的問題。

雜種優勢的利用能夠極大提高農作物的產量。但綠豆花是兩側對稱的蝶形花, 閉花授粉, 天然異交率極低, 限制了雜種優勢的利用。柱頭外露可有效提高作物異交率, 并在棉花[4]、水稻[5]、谷子[6]等植物中得到驗證。柱頭外露是指雌蕊柱頭顯著伸出花蕾, 難以接受自身花粉的一種性狀, 該性狀的應用可免去在雜交制種中去雄工作, 提高制種效率, 降低制種成本, 有利于雜種優勢的利用。目前綠豆中已被報道的柱頭外露突變體僅有[7],于γ射線照射后產生的蘇綠1號突變體庫中選出, 具有起皺的花瓣和外露的柱頭, 但花藥仍封閉在龍骨瓣內部, 柱頭與花藥分離, 阻斷了綠豆的自交過程。相對于其他作物而言, 綠豆柱頭外露突變體較少, 因此挖掘更多的柱頭外露突變體并探究其分子機制至關重要。

柱頭外露通常是由于花器官之間的相對長度差異造成的, 該性狀可受到溫度[8]、植物激素[9]、轉錄因子[10]等因素的調控。目前, 轉錄組測序(RNA- seq)[11]已被應用于多種植物中探究柱頭外露的遺傳基礎和分子機制。Riccini等[11]利用RNA-seq技術分析了番茄柱頭外露植株中的差異表達基因, 并找到了可能參與控制柱頭位置的新候選基因, 其與細胞擴張、植物激素調節等功能有關。Pan等[12]利用轉錄組測序技術在熱脅迫條件下番茄雙細胞花粉期的雄蕊和雌蕊中分別鑒定出69個和30個熱應答miRNA, 其中一些miRNA及其預測靶標在植物信號傳導、花發育和細胞分裂和細胞擴張中起關鍵作用, 這些miRNA的發現有助于闡明高溫誘導柱頭外露的分子機制。

本研究中, 吉林省農業科學院在經過化學誘變的綠豆品種冀綠7號中發現了1個柱頭外露突變體(), 由于這是綠豆中被報道的第2個柱頭外露突變體, 暫命名為。該突變體植株自小花蕾時期開始, 柱頭便伸出花外, 柱頭與雄蕊分離, 導致自身花粉無法落在柱頭上, 從而出現癟莢、不結實的現象。為探究植株柱頭外露的分子機制, 利用該突變體及其野生型材料冀綠7號開花前1 d的花蕾進行轉錄組測序(RNA-seq), 通過比較分析兩者的差異表達基因和代謝通路, 揭示綠豆柱頭外露的分子機制, 為該性狀在綠豆雜種優勢中的利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

綠豆柱頭外露突變體() (圖1-A)及其野生型品種冀綠7號(WT) (圖1-B)種植于吉林省農業科學院公主嶺實驗基地, 均種植10壟, 壟長5.0 m, 壟距0.6 m, 株距14.0 cm, 均進行正常的田間管理。

圖1 柱頭外露突變體se2和冀綠7號(WT)花蕾的表型比較

A: 柱頭外露突變體; B: 冀綠7號(WT)。A: stigma exsertion mutant; B: Jilyu 7 (WT).

1.2 RNA提取、文庫構建與測序

在盛花期, 選取冀綠7號開花前1 d的花蕾及開花前1 d且柱頭外露花蕾用于轉錄組測序, 3次重復(分別命名為WT1、WT2、WT3, SE2_1、SE2_2、SE2_3), 每次重復隨機選取3株, 每株隨機選取花蕾3朵, 用液氮速凍, 并于–80℃保存備用。采用TIANGEN RNAprep Pure Plant Plus Kit (Polysaccharides & Polyphenolics-rich)試劑盒提取葉片總RNA, 利用Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測RNA完整性, 通過Oligo(dT)磁珠富集帶有polyA尾的mRNA, 采用離子打斷的方式, 將mRNA打斷到250～300 bp的片段, 以此構建mRNA文庫。基于Illumina NovaSeq 6000平臺進行雙末端測序。總RNA提取及質量檢測、cDNA文庫構建以及測序均委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.3 生物信息學分析

對原始下機數據(raw data)進行過濾, 去除接頭及低質量reads后, 使用HISAT2軟件(https://www. osc.edu/resources/available_software/software_list/hisat2)將獲得的高質量reads比對到綠豆品種冀綠7號的參考基因組(https://doi.org/10.6084/m9.figshare. 19583446)[13]。根據比對結果, 統計每個基因從起始到終止范圍內覆蓋的reads數, 采用FPKM方法[14]計算每個基因的表達量及WT和重復樣品間的Pearson相關系數。采用DESeq2[15]軟件, 對WT和間基因表達水平進行差異分析, 篩選差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)的標準為: 表達差異倍數|log2(Fold Change) |≥1,≤0.05。為進一步分析DEGs的生物學功能和代謝途徑, 基于超幾何分布原理進行GO富集分析和KEGG通路分析。

1.4 差異表達基因的qRT-PCR驗證

隨機挑選5個差異表達基因并采用qRT-PCR方法驗證其表達水平。每個基因進行3次生物學重復,使用Primer Premier 6軟件設計合成引物(表1), 并采用作為內參基因。用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit對所提取的RNA進行反轉錄合成mRNA, 并采用SYBR Green法qRT-PCR體系(10 μL): 5 μL 2×SYBR Green Mix, 2 μL cDNA, 正反向引物各0.5 μL (10 μmol L–1), 2 μL ddH2O進行反應。qRT-PCR反應條件為: 95℃預變形5 min, 循環1次; 95℃變性10 s, 60℃退火25 s, 40次循環, 隨后進行溶解曲線采集, 并用2–DDCt法定量分析基因的相對表達水平。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序結果評估和結果統計

Illumina測序結果(表2)顯示6個樣品質控后共獲得270,449,698個clean reads。各樣品中clean reads的堿基質量值Q20均高于97%, Q30均高于94%, 表明該樣品堿基識別準確性較高, 測序結果質量良好。將clean reads比對到參考基因組上, 比對率均在96.5%以上。同時各個樣本間的基因表達量相近(圖2-A), 組內和組間3次樣本重復的相關性系數均在0.93以上(圖2-B), 說明本次測序結果可靠, 樣本選擇合理, 滿足后續分析的要求。

2.2 差異表達基因篩選

利用DESeq2軟件以差異倍數|log2(Fold Change)|≥1、≤0.05的標準篩選差異表達基因, 柱頭外露突變體和冀綠7號之間有572個差異表達基因(DEGs), 其中262個DEGs上調, 310個DEGs下調, 下調基因數量高于上調基因數量(圖3)。

2.3 qRT-PCR驗證

為驗證轉錄組數據的可靠性, 隨機選取5個差異表達基因進行qRT-PCR驗證, 比較這些基因在WT和中的表達水平。結果表明, 這些基因的轉錄組測序(RNA-seq)與實時熒光定量PCR (qRT-PCR)結果表達趨勢一致(圖4), 證明本次轉錄組數據結果可靠。

表1 qRT-PCR所用引物

表2 轉錄組測序相關數據

圖2 樣本基因表達分布及相關性分析

A: 各樣本基因表達分布; B: 樣本間相關性。

A: distribution of gene expression in each sample; B: correlation heat map between samples.

圖3 差異基因火山圖

Up: 上調基因; Down: 下調基因; Not significant: 無顯著差異基因。

Up: up-regulated gene; Down: down-regulated gene; Not significant: not significant difference gene.

圖4 se2和冀綠7號(WT)部分差異表達基因的相對表達水平

2.4 差異表達基因的GO富集分析

利用topGO對冀綠7號和的差異表達基因進行GO富集分析, 按照細胞組分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)和生物過程(Biological process, BP)進行GO分類, 在每個GO分類中選擇值最小即富集最顯著的前10個條目進行展示(圖5)。MF分析發現這些DEGs主要與木葡聚糖: 木葡聚糖轉移酶活性、氧化還原酶活性、轉錄因子活性、水解酶活性等功能有關。CC分析發現DEGs顯著富集在細胞外區域(extracellular region)、質外體(apoplast)、細胞壁(cell wall)和外部封裝結構(external encapsulating structure)、細胞膜(membrane)中。BP分析發現, 前10個條目主要與糖代謝過程(如GO:0006073, GO:0044042)、轉錄代謝過程(如GO:0006355, GO:1903506)和生物合成過程(如GO:0009889, GO:0010556)有關。

圖5 se2和冀綠7號(WT)差異表達基因的GO富集分析

BP: 生物過程; MF: 分子功能; CC: 細胞組分。

BP: biological process; MF: molecular function; CC: cellular component.

2.5 差異表達基因的KEGG分析

KEGG分析結果表明572個DEGs被富集到71個代謝途徑, 其中倍半萜和三萜生物合成途徑(ko00909)、異喹啉生物堿生物合成途徑(ko00950)、角質、木栓質和蠟質生物合成途徑(ko00073)、植物激素信號傳導途徑(ko04075)、次生代謝物生物合成途徑(ko01110)這5個KEGG通路被顯著富集(圖6)。植物激素信號傳導途徑和次生代謝物生物合成途徑富集的差異表達基因數量最多, 分別為10個和35個。除植物激素信號傳導通路屬于環境信息處理大類外, 其他4個通路均屬于代謝大類, 說明的生物代謝和信號傳導受到影響。

圖6 se2和冀綠7號(WT)差異表達基因KEGG富集分析

2.6 柱頭外露相關的差異表達基因

2.6.1 細胞分裂和細胞擴張相關的差異表達基因

在本研究中發現了48個與細胞分裂和細胞擴張相關的差異表達基因(表3)。細胞壁在細胞擴張中發揮重要作用[16]。DEGs中共有27個基因參與細胞壁的合成、代謝與修飾, 其中19個基因下調, 下調基因包括5種木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(、、、、)、3種參與次生細胞壁木質素合成的漆酶(、-、-)、纖維素酶、β-1,4-木糖基轉移酶、富含亮氨酸重復延伸蛋白樣蛋白6 ()等基因,[17]、富含亮氨酸的重復序列()[18]在細胞壁擴張中發揮著重要作用。此外,參與細胞擴張的基因、擴展蛋白()、、以及影響細胞膨壓的3個基因(、、)也顯著下調。在細胞分裂相關DEGs中有3個基因上調, 7個基因下調, 下調基因包括囊泡轉運復合體亞基, 驅動蛋白(、), CHD3型染色質重塑因子, 肽基脯氨酰順反異構酶(,)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樣蛋白, 其中, 囊泡轉運復合體在擬南芥胞質分裂中參與細胞板起動、成熟和初生細胞壁形成的細胞分泌過程[19]; 玉米中編碼同源物的基因突變會導致根毛伸長受損, 發育延遲[20]。說明柱頭外露突變體中花器官細胞擴張和細胞分裂這2個生理過程被影響, 這有可能導致柱頭外露。

表3 細胞分裂和細胞擴張相關的差異表達基因

(續表3)

2.6.2 植物激素相關的差異表達基因 在差異表達基因中發現了25個植物激素相關的基因(表4)。生長素相關DEGs中, 2個生長素轉運蛋白(、)下調, 1個生長素通道蛋白()和2個生長素響應蛋白(、)上調。在細胞分裂素相關DEGs中, 細胞分裂素脫氫酶6 ()下調; 2個可以激活A型反應調劑因子的雙組分響應調節子、上調, 而A型雙組份響應調節子下調, A型雙組份調節子在細胞分裂素信號傳導中起負調控作用[21]。在乙烯相關DEGs中, 1個乙烯受體()和3個乙烯響應因子(、、)上調, 2個鋅指結構域應激相關蛋白()下調。此外還有4個赤霉素生物合成相關的氧化酶、HD-ZIP蛋白、-和1個參與茉莉酸生物合成的基因上調。

表4 植物激素相關的差異表達基因

3 討論

綠豆是嚴格自花授粉作物, 花朵在開放前就已完成授粉, 天然異交率極低, 限制了雜種優勢在綠豆中的應用。柱頭外露植株的柱頭顯著高于雄蕊, 并向花器官外延伸, 是提高作物異交率和雜種優勢利用率的一個重要性狀。本研究中, 穩定遺傳的柱頭外露突變體是利用0.7% EMS誘變冀綠7號獲得的, 與其野生型冀綠7號相比,開花數量增多, 花期延長, 且在小花蕾時期開始出現柱頭外露現象, 其龍骨瓣長度顯著減小, 雄蕊和雌蕊長度與冀綠7號無顯著差異, 說明柱頭外露是因為龍骨瓣顯著縮短造成的(數據未發表)。為探究柱頭外露的分子機制, 本研究對其進行了轉錄組測序分析, 篩選出572個差異表達基因(DEGs), 其中262個DEGs上調, 310個DEGs下調, 包含許多與細胞分裂、細胞擴張和植物激素相關的差異表達基因。GO分析發現這些基因顯著富集在代謝等生物學過程, 質外體、細胞壁、細胞膜等細胞組分, 與結合、氧化還原等分子功能有關。KEGG分析發現這些差異表達基因富集在植物激素信號傳導和次生代謝物生物合成等代謝通路, 這與Pan等[12]的研究結果一致。

植物的柱頭外露通常是由于花芽發育過程中花器官之間的相對長度差異造成的。花瓣長度、花冠大小等花器官特征都有可能影響柱頭外露, 這一點已在水稻[22]、番茄[23]等多個植物中被證明。花器官的生長受到復雜網絡的精確調控, 其大小取決于細胞分裂和細胞擴張這2個生理過程[24]。張鋆鋆[25]和胡育瑋[26]發現煙草MSK326SE材料的柱頭外露與其花器官發育不同步有關, 在其花蕾發育早期細胞分裂旺盛, 導致花柱細胞總數增多、花柱變長,柱頭外露; 而在花蕾發育后期花柱長度恢復正常, 但花冠表皮細胞顯著變小導致花冠縮短, 柱頭外露[27]。本研究中發現了13個細胞分裂相關的DEGs, 其中驅動蛋白(), 肽基脯氨酰順反異構酶(,)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶樣蛋白()顯著下調。參與植物發育過程中的細胞增殖和分化[28], 驅動蛋白則在穩定細胞分裂紡錘體中起重要作用[29]。屬于()家族, 該家族首次在玉米中被報道, 它的突變會影響葉表皮分化, 細胞形態大小改變[30], 導致植株矮小和延遲生長[31]; 水稻中,具有促進表皮細胞分化、抑制細胞分裂和維持表皮細胞單層結構的功能[32]。以上差異表達基因可能影響了植株的細胞分裂過程, 導致了柱頭外露。細胞擴張伸長發生在花器官發育后期, 細胞壁在器官生長過程中起限制細胞擴張的作用。細胞壁由纖維素、半纖維素、果膠構成, 它的增大始于細胞壁應力松弛, 降低細胞膨脹壓力, 進而將水吸入細胞以增加細胞體積并恢復膨脹和細胞壁壓力[33]。纖維素和其他細胞壁組分間的復雜相互作用可以通過葡聚糖內切酶、擴展蛋白等幾種細胞壁酶修飾, 這幾種細胞壁酶能夠促進細胞壁應力松弛, 在細胞擴張和植物生長中起著重要作用。GO富集分析和差異表達基因分析發現許多與細胞壁組分和擴張相關的差異表達基因, 其中包括果膠甲酯酶()、纖維素酶1、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(、)、擴展蛋白)、延伸蛋白(,)、β-1,4-木糖基轉移酶、等相關基因, 這些基因均顯著下調。綠豆柱頭外露突變體中, 編碼VrDUF1005的基因由于單個核苷酸突變引起1個氨基酸發生變化, 影響了綠豆發育后期的花瓣細胞分裂和花柱細胞擴張而導致了柱頭外露[7]; 而番茄中一個編碼非典型轉錄因子的基因也可以通過調節細胞伸長調控柱頭外露[34]。本研究中,的柱頭外露是由龍骨瓣縮短引起的,中龍骨瓣的細胞分裂和擴張過程可能受到了影響, 導致柱頭外露。

植物激素在各個花器官間的相對表達水平能夠影響花器官形態, 并在不同植物的柱頭外露中發揮著重要作用。生長素和細胞分裂素均可參與調控細胞的伸長、分裂、分化和花器官發育。植物體內生長素的濃度水平會影響柱頭外露率, Cheng等[35]認為生長素含量增加可以促進花柱生長提高柱頭外露率, 而水稻4號染色體上柱頭外露性狀QTL位點的候選基因生長素響應因子的敲除會使水稻內生長素濃度過高, 柱頭外露率降低[36]。擴展蛋白是調節植物細胞擴張的關鍵內源因子, 生長素和脫落酸分別通過提高擴張素活性和濃度介導細胞擴張過程[37], Pan等[38]發現高溫條件下, 生長素等植物激素信號傳導在雄蕊和雌蕊中的差異表達會影響擴展蛋白的轉錄水平, 導致番茄柱頭外露。赤霉素也參與柱頭外露的調節過程, 它通過控制細胞伸長率調節植物的雌蕊、雄蕊、花瓣長度[39], 王燕等[40]發現在亞高溫脅迫下噴施赤霉素(gibberellin A3, GA3)可提高番茄花柱的外露率和外露程度, 而赤霉素合成抑制劑PAC處理可以減輕花柱外露程度; Carrera等[41]報道的番茄突變體()中編碼赤霉素信號通路阻遏物的基因的區域發生突變, 該突變體表現出柱頭外露、花瓣增多和單性結實現象; 在氧化酶家族中,和在雄蕊花絲伸長和育性中起重要作用[42]。茉莉酸(JA)不僅能夠調節雄蕊長度, 還能在花瓣發育后期通過限制細胞擴張控制花瓣器官生長[43]。據報道, 高溫應激會引起番茄花蕊特別是雄蕊顯著縮短, 導致柱頭外露, 外源施加JA能顯著增加雄蕊和花柱中的細胞數量, 降低柱頭外露率[38]; 而在煙草中,外源施加JA可造成花冠縮短, 柱頭外露率提升[27]。乙烯也有可能導致柱頭外露, 過表達番茄中編碼乙烯受體蛋白的基因會導致乙烯含量降低, 植物信號傳導減緩, 番茄T431品種的柱頭外露表型減輕[35]。本研究中, 發現了許多與植物激素相關的差異表達基因, 其中2個調節生長素穩態的生長素運輸蛋白(,)和1個細胞分裂素脫氫酶6 ()下調, 乙烯受體蛋白AT和參與茉莉酸合成的基因上調。是家族的同源轉錄因子, 它能激活轉錄因子抑制GA的生物合成和信號傳導, 過表達會導致典型的GA缺乏癥狀, 例如植株矮小、開花延遲、雄性不育等[44];也能負調節GA 20氧化酶基因在花序莖中的表達[45]。以上結果表明, 柱頭外露突變體中各種植物激素之間的相互作用可能導致了柱頭外露。

4 結論

本研究對一個綠豆柱頭外露突變體及其野生型植株冀綠7號開花前1 d的花蕾進行了轉錄組測序, 通過差異表達基因功能注釋以及GO富集分析發現差異表達基因主要與糖代謝、轉錄代謝和生物合成等過程有關,的細胞壁合成與修飾受到了影響。KEGG富集分析發現, 差異表達基因主要涉及角質、木栓質和蠟質生物合成、植物激素信號傳導、次生代謝物生物合成等通路。此外, 還揭示了許多與柱頭外露相關的差異表達基因, 包括與細胞分裂和細胞擴張、植物激素相關的差異表達基因。對這些差異表達基因的進一步研究將有助于更全面的了解柱頭外露的分子機制, 促進該性狀在綠豆雜種優勢上的利用。

[1] 鄭卓杰. 中國食用豆類學. 北京: 中國農業出版社, 1997. pp 141–166. Zheng Z J. Food Legumes in China. Beijing: China Agriculture Press, 1995. pp 141–166 (in Chinese).

[2] 田靜, 程須珍, 范保杰, 王麗俠, 劉建軍, 劉長友, 王素華, 曹志敏, 陳紅霖, 王彥, 王珅. 我國綠豆品種現狀及發展趨勢. 作物雜志, 2021, (6): 15–21. Tian J, Cheng X J, Fan B J, Wang L X, Liu J J, Liu C Y, Wang S H, Cao Z M, Chen H L, Wang Y, Wang K. Current situation and development trend of mungbean varieties in China., 2021, (6): 15–21 (in Chinese with English abstract).

[3] 王麗俠, 程須珍, 王素華. 綠豆種質資源?育種及遺傳研究進展. 中國農業科學, 2009, 42: 1519–1527. Wang L X, Cheng X Z, Wang S H. Advances in research on genetic resources, breeding and genetics of mungbean (L.)., 2009, 42: 1519–1527 (in Chinese with English abstract).

[4] 黃穗蘭, 郭寶德, 冀麗霞, 牛永章, 姜艷麗. 棉花種間雜交長柱頭種質系TY35的培育與應用. 山西農業科學, 2015, 43: 777–779. Huang S L, Guo B D, Ji L X, Niu Y Z, Jiang Y L. The selection and application of germplasm line TY35 with long stigma from interspecific crossing in cotton., 2015, 43: 777–779 (in Chinese with English abstract).

[5] 楊保漢. 不育系柱頭外露率及其結實率研究. 雜交水稻, 1997, (1): 15–17. Yang B H. Studies on stigma exsertion rate and outcrossing rate of CMS Lines in rice., 1997, (1): 15–17 (in Chinese).

[6] 崔貴梅, 牛天堂, 張福耀, 袁愛萍, 孫毅. 谷子(Beauv.)高異交結實雄性不育系“81-16”的柱頭性狀觀察. 作物學報, 2007, 33: 149–153. Cui G M, Niu T T, Zhang F Y, Yuan A P, Sun Y. The stigma observation on foxtail millet (Beauv.) male-sterile line “81-16” with high outcross seed setting., 2007, 33: 149–153 (in Chinese with English abstract).

[7] Lin Y, Laosatit K, Chen J, Yuan X, Wu R, Amkul K, Chen X, Somta P. Mapping and functional characterization of stigma exposed 1, a DUF1005 gene controlling petal and stigma cells in mungbean ()., 2020, 11: 575922.

[8] Yan H, Zhang B, Zhang Y, Chen X, Xiong H, Matsui T, Tian X. High temperature induced glume closure resulted in lower ferti-lity in hybrid rice seed production., 2017, 7: 1960.

[9] Elshamey E A Z, Hamad H S, Alshallash K S, Alghuthaymi M A , Ghazy M I, Sakran R M, Selim M E, ElSayed M A A, Abdelmegeed T M, Okasha S A, Behiry S I, Boudiar R, Mansour E. Growth regulators improve outcrossing rate of diverse rice cytoplasmic male sterile lines through affecting floral traits.(Basel), 2022, 11: 1291.

[10] Matthias Benoit. From non-self to self: stepwise mutations in transcription factors promote the transition to self-pollination in tomato., 2021, 10: 3183–3184.

[11] Riccini A, Picarella M E, De Angelis F, Mazzucato A. Bulk RNA-Seq analysis to dissect the regulation of stigma position in tomato., 2021, 105: 263–285.

[12] Pan C, Ye L, Zheng Y, Wang Y, Yang D, Liu X, Chen L, Zhang Y, Fei Z, Lu G. Identification and expression profiling of micrornas involved in the stigma exsertion under high-temperature stress in tomato., 2017, 18: 843.

[13] Mortazavi A, Williams B A, McCue K, Schaeffer L, Wold B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq., 2008, 5: 621–628.

[14] Trapnell C, Williams B A, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren M J, Salzberg S L, Wold B J, Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation., 2010, 28: 511–515.

[15] Love M I, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-Seq data with DESeq2., 2014, 15: 550.

[16] Bashline L, Lei L, Li S, Gu Y. Cell wall, cytoskeleton, and cell expansion in higher plants., 2014, 7: 586–600.

[17] Tsabary G, Shani Z, Roiz L, Levy I, Riov J, Shoseyov O. Abnormal ‘wrinkled’ cell walls and retarded development of transgenicplants expressing endo-1,4-β-glucanase (cell) antisense., 2003, 51: 213–224.

[18] Herger A, Dünser K, Kleine-Vehn J, Ringli C. Leucine-rich repeat extensin proteins and their role in cell wall sensing., 2019, 29: 851–858.

[19] Fendrych M, Synek L, Pe?enková T, Toupalová H, Cole R, Drdová E, Nebesá?ová J, ?edinová M, Hála M, Fowler J E, ?ársky V. Theexocyst complex is involved in cytokinesis and cell plate maturation., 2010, 22: 3053–3065.

[20] Wen T J, Hochholdinger F, Sauer M, Bruce W, Schnable P S. The roothairless1 gene of maize encodes a homolog of sec3, which is involved in polar exocytosis., 2005, 138: 1637–1643.

[21] To J P C, Haberer G, Ferreira F J, Deruère J, Mason M G, Schaller G E, Alonso J M, Ecker J R, Kieber J J. Type-Aresponse regulators are partially redundant negative regulators of cytokinin signaling., 2004, 16: 658–671.

[22] 吳健, 孫玥, 張融雪, 李軍玲, 王曉靜, 閆雙勇, 馬忠友, 孫林靜, 蘇京平, 王勝軍, 劉學軍. 水稻柱頭外露率相關性狀的調查及高柱頭外露率不育系的創制. 天津農業科學, 2017, 23(11): 55–60. Wu J, Sun Y, Zhang R X, Li J L, Wang X J, Yan S Y, Ma Z Y, Sun L J, Su J P, Wang S J, Liu X J. Investigation of characters related to stigma exserted rate in rice and establishment of male sterile line with high stigma exposure., 2017, 23(11): 55–60 (in Chinese with English abstract).

[23] Shang L, Song J, Yu H, Wang X, Yu C, Wang Y, Li F, Lu Y, Wang T, Ou-Yang B, Zhang J, Larkin R M, Ye Z, Zhang Y. A mutation in a C2H2-type zinc finger transcription factor contributed to the transition toward self-pollination in cultivated tomato., 2021, 33: 3293–3308.

[24] 張栩佳, 胡靈芝, 陳哲皓, 李穎, 王利琳. 花器官大小調控機制的研究進展. 植物生理學報, 2014, 50: 691–697. Zhang X J, Hu L Z, Chen Z H, Li Y, Wang L L. Research progress in regulation mechanism of floral organ size., 2014, 50: 691–697 (in Chinese with English abstract).

[25] 張鋆鋆. 煙草細胞質遺傳柱頭外露性狀發育特征研究. 河南農業大學碩士學位論文, 河南鄭州, 2018. Zhang Y Y. Study on the Developmental Characteristic of Cytoplasmic Inheritance of Tobacco Stigma Exsertion. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2018 (in Chinese with English abstract).

[26] 胡育瑋. 煙草細胞質遺傳柱頭外露發生機制研究. 河南農業大學碩士學位論文, 河南鄭州, 2019. Hu Y W. Study on the Stigma Exsertion Formation Mechanism in Cytoplasmic Inheritance of Stigma Exsertion Tobacco. MS Thesis of Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan, China, 2018 (in Chinese with English abstract).

[27] Li J X, Li M, Wang W M, Wang D, Hu Y W, Zhang Y Y, Zhang X Q. Morphological and physiological mechanism of cytoplasmic inheritance stigma exsertion trait expression in tobacco ()., 2023, 326: 111528.

[28] Smyczynski C, Roudier F, Gissot L, Vaillant E, Grandjean O, Morin H, Masson T, Bellec Y, Geelen D, Faure J D. The C terminus of the immunophilin pasticcino1 is required for plant development and for interaction with a NAC-like transcription factor., 2006, 281: 25475–25484.

[29] Garcia M A, Koonrugsa N, Toda T. Two kinesin-like KIN I family proteins in fission yeast regulate the establishment of metaphase and the onset of anaphase A., 2002, 12: 610–621.

[30] Becraft P W, Stinard P S, McCarty D R. Crinkly4: a tnfr-like receptor kinase involved in maize epidermal differentiation., 1996, 273: 1406–1409.

[31] Kang S G, Lee H J, Suh S G. The maizegene is expressed spatially in vegetative and floral organs, 2002, 45: 219–224.

[32] Pu C X, Ma Y, Wang J, Zhang Y C, Jiao X W, Hu Y H, Wang L L, Zhu Z G, Sun D, Sun Y.receptor-like kinase is required to maintain the interlocking of the palea and lemma, and fertility in rice, by promoting epidermal cell differentiation., 2012, 70: 940–953.

[33] Cosgrove D J. Growth of the plant cell wall., 2005, 6: 850–861.

[34] Chen K Y, Cong B, Wing R, Vrebalov J, Tanksley S D. Changes in regulation of a transcription factor lead to autogamy in cultivated tomatoes., 2007, 318: 643–645.

[35] Cheng M, Gong C, Zhang B, Qu W, Qi H, Chen X, Wang X, Zhang Y, Liu J, Ding X, Qiu Y, Wang A. Morphological and anatomical characteristics of exserted stigma sterility and the location and function of SLLST (long styles) gene in tomato., 2021, 134: 505–518.

[36] Guo N, Wang Y, Chen W, Tang S, An R, Wei X, Hu S, Tang S, Shao G, Jiao G, Xie L, Wang L, Sheng Z, Hu P. Fine mapping and target gene identification of QSE4, a QTL for stigma exsertion rate in rice (L.)., 2022, 13: 959859.

[37] Zhao M, Han Y, Feng Y, Li F, Wang W. Expansins are involved in cell growth mediated by abscisic acid and indole-3-acetic acid under drought stress in wheat., 2012, 31: 671–685.

[38] Pan C, Yang D, Zhao X, Jiao C, Yan Y, Lamin-Samu A T, Wang Q, Xu X, Fei Z, Lu G. Tomato stigma exsertion induced by high temperature is associated with the jasmonate signalling pathway., 2019, 42: 1205–1221.

[39] Cheng H, Qin L, Lee S, Fu X, Richards D E, Cao D, Luo D, Harberd N P, Peng J. Gibberellin regulatesfloral development via suppression of DELLA protein function., 2004, 131: 1055–1064.

[40] 王燕, 潘長田, 王潔, 秦力, 鄒滔, 盧鋼. 赤霉素對亞高溫脅迫下番茄花柱外露及相關基因表達的影響. 浙江大學學報(農業與生命科學版), 2015, 41: 449–457.Wang Y, Pan C T, Wang J, Qin L, Zou T, Lu G. Effects of gibberellin on tomato stigma exsertion and hormone-related gene expression under moderate heat stress.(Agric Life Sci Edn), 2015, 41: 449–457 (in Chinese with English abstract).

[41] Carrera E, Ruiz-Rivero O, Peres L E P, Atares A, Garcia-Martinez J L. Characterization of the procera tomato mutant shows novel functions of the sldella protein in the control of flower morphology, cell division and expansion, and the auxin-signaling pathway during fruit-set and development., 2012, 160: 1581–1596.

[42] Rieu I, Ruiz R O, Fernandez G N, Griffiths J, Powers S J, Gong F, Linhartova T, Eriksson S, Nilsson O, Thomas S G, Phillips A L, Hedden P. The gibberellin biosynthetic genesandact, partially redundantly, to promote growth and development throughout thelife cycle., 2008, 53: 488–504.

[43] Brioudes F, Joly C, Szécsi J, Varaud E, Leroux J, Bellvert F, Bertrand C, Bendahmane M. Jasmonate controls late development stages of petal growth in., 2009, 60: 1070–1080.

[44] Dong S, Tarkowska D, Sedaghatmehr M, Welsch M, Gupta S, Mueller-Roeber B, Balazadeh S. The HB40-JUB1 transcriptional regulatory network controls gibberellin homeostasis in., 2022, 15: 322–339.

[45] Son O, Hur Y S, Kim Y K, Lee H J, Kim S, Kim M R, Nam K H, Lee M S, Kim B Y, Park J, Park J, Lee S C, Hanada A, Yamaguchi S, Lee I J, Kim S K, Yun D J, S?derman E, Cheon C I. ATHB12, an ABA-inducible homeodomain-leucine zipper (HD- Zip) protein of, negatively regulates the growth of the inflorescence stem by decreasing the expression of a gibberellin 20-oxidase gene., 2010, 51: 1537–1547.

Transcriptome analysis of a stigma exsertion mutant in mungbean

SONG Meng-Yuan1,2, GUO Zhong-Xiao1, SU Yu-Fei1,2, DENG Kun-Peng1, LAN Tian-Jiao1, CHENG Yu-Xin1, BAO Shu-Ying1, WANG Gui-Fang1, DOU Jin-Guang1, JIANG Ze-Kai1,2, WANG Ming-Hai1,*, and XU Ning1,*

1Institute of Crop Germplasm Resources, Jilin Academy of Agricultural Sciences / Jilin Provincial Laboratory of Crop Germplasm Resources, Gongzhuling 136100, Jilin, China;2College of Agronomy, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, Jilin, China

Stigma exsertion has been widely used in hybrid breeding as an excellent trait to improve crop outcrossing rate, seed purity, and seed production cost. As a closed-pollinated crop, few stigma exsertion mutants have been reported in mungbean. A stigma exsertion mutantwas discovered in mungbean variety Jilyu 7 after chemical mutagination. In order to clarify the molecular mechanism of stigma exsertion, transcription-sequencing (RNA-seq) analysis was conducted on the next day's opening buds ofand its wild type Jilyu 7. A total of 572 differentially expressed genes (DEGs) were obtained in, among which 262 DEGs were up-regulated and 310 DEGs were down-regulated, based on the screening criteria of difference multiplier |log2(Fold Change)| ≥1 and≤ 0.05. In GO database, differentially expressed genes were significantly enriched in biological processes such as metabolism and biosynthesis, and localized in regions such as apoplast, cell walls, and membranes, and mainly associated with molecular functions such as binding and redox. In the kyoto encyclopedia of genes and genome (KEGG) database, differentially expressed genes were significantly enriched in plant hormone signal transduction and biosynthesis of secondary metabolites. Functional annotation revealed many genes related to cell wall synthesis and metabolism, cell division and cell expansion, and plant hormones. Therefore, we hypothesized that cell division, cell expansion, and plant hormone signaling processes of the keel flap inmutants were affected, leading to stigma exsertion. This study laid a foundation for future investigations into the molecular mechanism of stigma exsertion in mungbean and its application in heterosis.

mungbean; stigma exsertion; mutant; transcriptome; high-throughput sequencing; heterosis

10.3724/SP.J.1006.2024.34080

本研究由吉林省農業科技創新工程項目(CXGC2021ZY131, CXGC2021TD111)和財政部和農業農村部國家現代農業產業技術體系建設專項(CARS-08-Z8)資助。

This study was supported by the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Jilin Province (CXGC2021ZY131, CXGC2021TD111) and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-08-Z8).

徐寧, E-mail: xunig2008@163.com; 王明海, E-mail: shiyongdou@163.com

E-mail: smyuan2023@163.com

2023-05-09;

2023-09-13;

2023-10-07.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20230928.1446.010

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).