間充質干細胞及其外泌體在藥物性肝損傷治療中的作用

邢國靜， 羅龍龍， 王麗菲， 王順娜， 鄭曉鳳， 盧利霞 ，張久聰

1 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院消化內科， 蘭州 730050

2 寧夏醫科大學總醫院消化內科， 銀川 750001

3 蘭州大學第二醫院消化內科， 蘭州 730030

藥物性肝損傷（drug-induced liver injury，DILI）是指由化學藥品、生物制品、中成藥等按處方藥或非處方藥管理的藥品，以及中藥材、天然藥物、保健品、膳食補充劑等產品，或其代謝產物乃至其輔料、污染物、雜質等所導致的肝損傷［1］，是常見的藥物不良反應，可在短期內造成肝衰竭，甚至死亡。據估計，我國DILI的年發生率至少為23.8/10萬，高于其他國家［2］。N-乙酰半胱氨酸、糖皮質激素、水飛薊素等藥物雖然對DILI有一定治療作用，但療效和安全性有一定局限性［3-5］。人工肝作為一種臨時肝支持系統，因其設備復雜、體積大，限制了其應用［6］。肝移植是目前唯一有效手段，由于器官供體短缺、免疫排斥反應和醫療費用高限制了其應用。近年來，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）在DILI治療中的潛在優勢逐漸突顯，越來越多的研究表明，MSC可通過其歸巢能力、肝源分化、免疫調節和旁分泌效應促進肝細胞再生及減少肝細胞凋亡，從而減輕肝損傷［3］。MSC來源的外泌體（mesenchymal stem cell-derived exosome，MSC-EXO）具有類似MSC的功能，不僅無致瘤風險，且具有更低的免疫原性、較長的循環半衰期、良好的滲透性和生物相容性［7］，在肝損傷的治療中頗受關注。因此，本文將從MSC和MSC-EXO的作用及干預DILI的作用機制進行綜述，以期為DILI的診治提供新的思路。

1 MSC及其外泌體概述

1.1 MSC概述 MSC是一種具有紡錘狀結構和塑性底物黏附特性的非造血干細胞，具有強大的自我更新能力，可分化為中胚層譜系細胞和其他外胚層譜系細胞［8］。目前，已從臍帶、月經血、脂肪、骨髓等組織中分離出MSC，臨床常用的主要來源為骨髓、臍帶血和脂肪組織。MSC表達表面標志物CD73、CD90和CD105，但不表達造血標志物CD45、CD34、CD14和CD79［9］。MSC具有多種生物學作用，如多譜系分化、免疫調節、血管生成、抗凋亡、抗纖維化活性和組織修復［10-11］；此外，還釋放多種生物活性成分（包括蛋白質、生長因子、趨化因子、微小RNA（microRNA，miRNA）和細胞因子），參與組織修復及再生［12］。MSC如此強大的功能被認為是細胞治療中最有前途的干細胞類型之一，已在肌肉骨骼系統、神經系統、心肌、肝臟、角膜、氣管和皮膚等相關組織得到廣泛研究和應用［13］。

1.2 外泌體概述 外泌體是直徑為40～160 nm的細胞外囊泡，存在各種體液中并且可由多種細胞分泌；其攜帶大量生物活性物質，如DNA、mRNA、非編碼RNA、脂質和各種蛋白質，不僅在細胞間物質轉運和信號轉導中起著重要作用，還在各種病理生理條件下作為診斷性的生物標志物和治療載體，具有巨大的潛力［14］。此外，外泌體還含有大量的膜聯蛋白、四跨膜蛋白家族（如CD63、CD81和CD9）和熱休克蛋白（如Hsp60、Hsp70和Hsp90）［15］。早期研究表明，外泌體在炎癥、細胞凋亡、凝血、細胞內信號傳導、抗原呈遞和細胞穩態等多種生物活動中起著至關重要的作用［16］。MSC-EXO作為MSC旁分泌作用的關鍵成分，不僅含有細胞因子、生長因子、信號脂質、mRNA和調節性miRNA，還表達血管內皮生長因子、細胞外基質金屬蛋白酶誘導劑和基質金屬蛋白酶9，這些因子在血管生成和組織修復中發揮重要作用［17］。MSC-EXO作為一種新型的無細胞療法，已被應用于各種疾病模型中，包括神經、心血管、免疫、腎臟、肌肉骨骼、肝臟、呼吸系統、眼部和皮膚疾病以及癌癥［18］。

2 MSC及其外泌體移植治療DILI的作用機制

2.1 減輕肝臟炎癥反應 肝細胞作為肝實質細胞的重要組成部分，生理功能獨特、所處環境特殊，極易在各種藥物作用下受到侵襲而發生炎癥反應。因此，有效減輕肝臟炎癥反應被認為是緩解肝損傷的重要措施。

在對乙酰氨基酚（APAP）引起的肝損傷模型中，損傷的肝組織可分泌多種細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、單核細胞化學引誘蛋白-1、生長調節蛋白、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、轉化生長因子-β1、血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子和基質細胞衍生因子1等，這些細胞因子可有效誘導MSC遷移到受損肝臟部位，促進受損組織修復［19］。Salomone等［20］給APAP誘導的肝損傷大鼠移植脂肪組織MSC，發現其可使血漿ALT和AST表達下調、凝血酶原時間減少、血氨水平正常；HE染色顯示肝組織壞死也被完全抑制。人臍帶MSC（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）給藥不僅可以改善APAP誘導的肝損傷小鼠血清ALT水平、病理損傷；還可抑制肝臟促炎細胞因子和趨化因子［包括TNF-α，IL-1β，單核細胞趨化蛋白-1和趨化因子（CXC基序）配體1］mRNA水平，并減少巨噬細胞、中性粒細胞向肝組織浸潤。特別是Notch激活的hUC-MSC，可大大增強上述抗炎活性和治療作用［21］。

MSC-EXO是一種重要的旁分泌效應體，在組織、器官損傷修復過程中可有效降低肝臟炎癥反應，避免肝組織進一步損傷、惡化。在D-氨基半乳糖/脂多糖（D-GalN/LPS）誘導的小鼠肝損傷模型中，脂肪組織MSC-EXO可通過抑制miR-17介導的硫氧還蛋白互作蛋白減少肝巨噬細胞中NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NLRP3）炎癥小體的活化來改善肝臟炎癥反應［22］。此外，在TNF-α預處理后，hUC-MSC釋放大量富含miR-299-3p的外泌體，可通過抑制NLRP3通路的激活來減輕炎癥并促進肝組織修復［23］。由此可見，除了MSC和MSC-EXO在減輕肝臟炎癥反應，維持肝臟穩態方面發揮重要作用；外泌體相關非編碼RNA也在肝臟保護作用方面發揮重要作用，為肝損傷的治療提供了新的方向和依據。

2.2 促進肝細胞增殖及再生 肝臟損傷后，肝細胞增殖及再生是肝臟從損傷中恢復所依賴的一個重要過程，在肝細胞存活和肝穩態中起著至關重要的作用，也是治療DILI的重要途徑。MSC遷移至受損肝臟后發生肝源分化，并釋放生長因子，如肝細胞生長因子、成纖維細胞生長因子、IL-6、纖維蛋白原和轉化生長因子-α等促進肝細胞增殖及再生［24］。在胺碘酮誘導的體內外肝損傷模型中，脂肪組織MSC不僅可以增加損傷肝細胞的細胞活力、阻止細胞凋亡途徑的激活、刺激啟動期基因的表達，還可使免疫細胞浸潤減少及再生反應增強，顯著減弱小鼠肝損傷［25］。

MSC-EXO也可有效促進肝細胞增殖及再生，阻止DILI的進展。在采用APAP和H2O2誘導的體外肝細胞損傷模型和CCl4誘導急性肝損傷的小鼠模型中觀察到，人類胚胎MSC-EXO干預后，啟動期因子表達增加、細胞活力得到改善、肝臟再生基因［核因子（NF）-κB、cyclin D1和cyclin E］和細胞增殖標志物（增殖細胞核抗原）的表達明顯上調［26］。因此，不管是體內還是體外實驗，MSC及MSC-EXO均可改善受損肝臟，并刺激剩余的肝細胞再生和恢復，延緩疾病進展。

2.3 抗肝細胞凋亡作用 細胞凋亡是一種高度調控的細胞死亡形式，是許多穩態和病理所必需的流程，涉及一系列基因的激活、表達以及調控。Liu等［27］證實hUC-MSC移植可使D-GalN/LPS誘導的急性肝衰竭小鼠末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記染色陽性細胞減少、Bcl-xl/Bax蛋白比率增加、裂解半胱天冬酶-3和TNF-α水平下調。

自噬是由溶酶體介導的細胞分解代謝過程，在維持肝細胞和代謝穩態方面起著重要作用。骨髓MSC-EXO通過增加自噬標記蛋白（微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ、Beclin-1）的表達促進自噬體的形成，在自噬體的誘導下促凋亡蛋白Bax和裂解半胱天冬酶-3的表達水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平上調，顯著減輕D-GaIN/LPS誘導的肝細胞損傷和凋亡，提高存活率［28］。另有研究［29］發現，hUCMSC-EXO可通過激活胰島素樣生長因子-1/磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B和細胞外信號調節激酶（ERK）1/2信號通路，進而逆轉APAP誘導的肝細胞凋亡。近些年，關于MSC及MSC-EXO的研究尚處于起步階段，其抗凋亡所涉及的信號通路仍需進一步研究。

2.4 改善氧化應激 氧化應激是多種肝臟疾病常見的病理生理基礎，氧化應激與抗氧化應激失衡即可影響DILI的進展。越來越多的證據表明MSC和MSC-EXO在治療肝損傷過程中可通過降低氧化應激發揮其治療作用。Huang等［30］證實小鼠視網膜脂肪組織MSC可抑制細胞色素P450活性、減少毒性硝基酪氨酸的積累、增加抗氧化酶（超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶）活性及抗氧化因子（核因子紅細胞2相關因子2、血紅素氧合酶1、醌氧化還原酶1）基因的表達來保護肝細胞免受APAP誘導的細胞損傷。深入研究發現這與下游MAPK信號激活被抑制和炎性細胞因子（IL-1α、IL-1β）的產生密切相關。另有研究［31］證實hUC-MSC條件培養基可通過下調miR-486-5p和上調絲氨酸/蘇氨酸激酶蛋白Pim-1減輕H2O2誘導的肝細胞氧化應激損傷，其機制與抑制TGF-β/Smad通路有關。

越來越多的研究表明MSC-EXO可減輕損傷肝細胞的氧化應激狀態，逆轉氧化應激誘導的細胞凋亡。研究人員［32］在CCl4誘導的小鼠肝損傷中比較了hUC-MSCEXO與保肝劑（聯芬雙酯）的抗氧化作用，結果顯示，hUCMSC-EXO具有更明顯的抗氧化和保肝作用。更重要的是，hUC-MSC-Ex可通過調節多條信號通路改善氧化應激，如在CCl4和H2O2誘導的肝損傷模型中，hUC-MSC-Ex可通過上調ERK1/2和Bcl-2及下調IκB激酶B/NF-κB/胱天蛋白酶-9/-3途徑，并輸送谷胱甘肽過氧化物酶1以改善氧化應激誘導的細胞凋亡［33］。

2.5 免疫調節作用 免疫失衡是肝損傷重要的發病機制。在炎癥組織部位，MSC可以直接影響先天和適應性免疫細胞的浸潤和活性，誘導肝組織修復和再生。一項刀豆球蛋白A誘導的急性肝損傷小鼠模型的研究［34］表明，扁桃體MSC通過抑制淋巴細胞、樹突狀細胞和Kupffer細胞的浸潤，降低損傷小鼠血清炎癥因子（TNF-α、TNF-γ和IL-4）水平，并增加肝保護因子IL-10的血清水平。Wang等［35］證實骨髓MSC分泌的前列腺素E2可誘導巨噬細胞從M1（促炎）向M2（抗炎）表型極化，減少促炎因子的釋放，抑制D-GaIN/LPS誘導的肝臟炎癥反應和肝細胞凋亡。骨髓MSC還可通過下調肝臟自然殺傷T淋巴細胞中的IL-17及增加產生IL-10的調節性自然殺傷T淋巴細胞數量減弱CCl4誘導的急性肝衰竭［36］。此外，MSC還可通過抑制中性粒細胞的募集和活性，改善D-GalN/LPS誘導的大鼠肝功能，降低病死率［37］。MSC對適應性免疫細胞（如T淋巴細胞或B淋巴細胞）的增殖和活化作用也被研究所證實［38］。

MSC-EXO也參與DILI的免疫調節，研究發現IL-6預處理可顯著上調hUC-MSC-EXO中miR-455-3p的水平，這些外泌體通過下調靶基因PIK3r1，抑制巨噬細胞活化。在小鼠內毒素血癥和化學性肝損傷模型中，過表達miR-455-3p可減輕肝損傷、減少巨噬細胞浸潤及血清炎癥因子水平，改善肝損傷［39］。小鼠骨髓MSC-EXO可通過減弱Kupffer細胞M1型極化，減輕肝臟炎癥反應，促進CCl4誘導的體內外肝組織修復［40］。由此可見，MSC和MSCEXO均可通過免疫調節作用，有效抑制促炎免疫細胞的活化及促炎細胞因子分泌，阻斷免疫反應的級聯活性，恢復肝臟免疫穩態。

3 MSC-EXO移植治療其他肝臟疾病的作用機制

MSC-EXO除了在DILI中具有保護作用，在其他肝病中也發揮重要作用。如在CCl4誘導的肝纖維化小鼠中，hUC-MSC-EXO通過遞送miR-148a靶向巨噬細胞中的Kruppel樣因子6/信號轉錄和轉錄激活因子3途徑發揮抗纖維化作用［41］。在非酒精性脂肪性肝炎動物和細胞模型中，hUC-MSC-EXO被證實可通過減少細胞脂質沉積，減輕肝損傷［42］。在缺血/再灌注肝損傷模型中，人誘導多能干細胞來源MSC-EXO通過抑制炎癥細胞的浸潤、減少炎癥因子的釋放、改善氧化應激，減輕肝細胞壞死和凋亡［43］。近年來，MSC-EXO對腫瘤的作用一直是研究熱點，其在肝癌治療中展現出“雙刃劍”作用，一方面可抑制腫瘤生長，另一方面也可促進腫瘤的生長和遷移［44］。

4 MSC及其外泌體在疾病治療中的局限與挑戰

如上所述，MSC移植在體內外實驗中均可有效減輕肝損傷，但研究［45］表明，MSC在受損組織區域的存活率低，移植潛力低和潛在的致瘤性也限制了其在組織修復中的有效性。此外，MSC在接受體外預處理（如化學試劑、缺氧或炎癥）后可增加療效，但這些因素的適用劑量及是否會對MSC產生不利影響尚不清楚［46］。MSC-EXO在疾病的治療中顯示出良好的應用前景，但也存在很多挑戰：（1）尚無統一的分離、純化技術來獲得外泌體；（2）分離的外泌體其儲存以及運輸條件的系統標準和方案尚未建立；（3）外泌體注射的最佳劑量和注射頻率尚不確定；（4）外泌體來源多樣、成分復雜，目前尚無法確定改善DILI的具體物質；（5）大多數研究都是短期的，長期治療效果未知。綜上，雖然MSC-EXO在再生醫學方面理論上優于MSC，但仍需要更多的臨床前實驗和基礎研究來克服外泌體在治療應用中的局限性。

圖1 MSC及MSC-EXO移植治療DILI的作用機制Figure 1 The mechanism of MSC and MSC-EXO transplantation in the treatment of DILI

5 小結與展望

MSC-EXO作為無細胞療法，為DILI提供了一類有效的治療方法，為改善肝損傷、逆轉肝衰竭和改善預后提供了新的方向。盡管臨床前研究中的絕大多數陽性結果尚未轉化為臨床療效，相信隨著相關技術的日益成熟，MSC-EXO背后分子機制不斷深入研究，MSC-EXO的治療潛力可以得到充分發揮。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：邢國靜負責課題設計，撰寫論文；王麗菲、羅龍龍、王順娜、鄭曉鳳參與修改論文；盧利霞、張久聰負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。