基于PI3K/AKT 通路探討何氏補腎厚膜方改善大鼠薄型子宮內膜的作用機制

徐新亞 陳碧霞 吳曉婷

薄型子宮內膜（thin endometrium，TE）是近年來生殖醫學領域研究的熱點，是影響輔助生殖技術（ART）臨床妊娠結局的關鍵因素[1]。2019 年加拿大生育和男科學會（CFAS）指南規定，人絨毛膜促性腺激素給藥當天子宮內膜厚度＜8 mm，冷凍移植周期子宮內膜厚度＜7 mm 代表TE[2]。TE 的發病與炎癥、醫源性操作等有關，然而相關機制尚不清楚。研究表明，除了子宮內膜厚度的差異外，TE 患者還患有血管發育不良，導致子宮動脈血流阻力顯著增加，從而抑制子宮內膜容受性[3]。何氏補腎厚膜方（Heshi Bushen Houmo Prescription，HBHP）是何氏婦科多年經驗的總結，臨床應用可以改善缺血后子宮內膜血流、增加內膜厚度。然而，目前關于HBHP 的作用機制缺乏相應的實驗數據支持。磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路激活是血管生成的調節中心[4]。研究證實，PI3K/AKT 信號通路抑制血管生成障礙導致子宮內膜容受性降低與TE 不孕癥的發生有關[5]。因此，本研究基于PI3K/AKT 信號傳導通路探究HBHP治療TE 的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動 物 48 只SPF 級雌性SD 大鼠（6～8 周，180～220 g）購自上海市計劃生育科學研究所實驗動物經營部[實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006]。動物飼養在浙江中醫藥大學動物實驗研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2021-0012]。本實驗遵循浙江中醫藥大學實驗動物的相關管理和規定。

1.2 藥物與試劑 HBHP 方藥組成：紫河車3 g，鹿角片、仙靈脾各10 g，菟絲子20 g，覆盆子15 g，枸杞子12 g，熟地10 g，當歸15 g，川芎、炒白芍、赤芍、香附各10 g，黃芪15 g，由本院中藥房提供（杭州華東中藥飲片有限公司，批號20200628），用蒸餾水浸泡藥物0.5 h，煮沸0.5 h 取濾液，煮兩次合并濾液，用濾液沖泡紫河車粉，攪拌使充分溶解，再次過濾，取濾液滅菌后放入4 ℃冰箱冷藏備用。阿司匹林腸溶片（25 mg/片，辰欣藥業股份有限公司，批號B20013021）。蘇木精試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，貨號7211），伊紅試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，貨號7111）；磷酸化AKT（p-AKT）抗體試劑盒（美國Immunoway 公司，批號YT0185）、AKT 抗體試劑盒（美國Immunoway公司，批號YP0006）和PIK3 抗體試劑盒（美國Immu-noway 公司，批號YM0127）；超敏酶標山羊抗小鼠IgG 聚合物（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號2251D0509）；DAB（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號232010317）；柱式法通用型RNA 提取試劑盒（日本Takara 公司，批號AK20985A）；預混型定量用反轉錄試劑盒（日本Takara 公司，批號AK22355A）；TB Green Premix Ex TaqTM熒光染料（日本 Takara 公司， 批號AK3112BA）。引物由上海生工合成。

1.3 主要儀器 顯微鏡（尼康，型號ECLIPSE 80i）；掃描儀（日本濱松，NanoZoomer 2.0RS）；JJ2000 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；AR1140 高精密電子分析天平（美國奧豪斯電子分析天平）。

1.4 動物分組與造模、給藥 48 只SD 雌性大鼠飼養在溫度20～25 ℃、濕度45%～55%，12 h 循環照明的環境中，自由攝食飲水。適應1 周后按體質量隨機分為對照組、模型組、陽性組和HBHP 組，每組12只。除對照組外，其他組參照文獻方法在發情期對大鼠右側子宮建立TE 模型[6]。運用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹部常規消毒后，在下腹部距腹中線右側5 mm 處做一個垂直切口（1～2 cm）。暴露腹腔后，將右側子宮輕輕拉出。用兩個止血夾封閉子宮、卵巢和近端陰道之間的連接處。用1 mL 注射器將約0.3 mL 95%乙醇從卵巢遠端緩慢注入子宮腔。5 min 后，移除子宮內乙醇，并移除夾鉗。然后，用無菌鹽水沖洗子宮腔2～3 次，并逐層關閉腹腔。術后給大鼠保溫，蘇醒后放回動物室。對照組大鼠采用相同的手術方式，只暴露子宮但未對子宮進行任何處理。

按照60 kg 成人與大鼠等效劑量比率為1∶6，計算出大鼠灌胃劑量。HBHP 組予HBHP 10 g/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃。陽性組接受小劑量阿司匹林腸溶片0.5 mg/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃；對照組及模型組每日灌服生理鹽水1 mL/100 g。各組大鼠連續灌胃15 d 后，通過腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉安樂死，稱大鼠體質量，取出子宮。

1.5 子宮濕重測量 用高精密電子天平秤大鼠子宮的質量，即子宮濕重。子宮臟器指數=子宮濕重/大鼠體質量×100%。

1.6 蘇木精-伊紅染色 石蠟包埋切片（3 μm）用二甲苯（20 min，2 次）、100%乙醇（5 min，2 次）和95%乙醇（5 min，2 次）進行脫蠟。HE 染色后，切片通過逐漸增加的乙醇梯度脫水，并用二甲苯透明。最后，用中性脂固定載玻片，在顯微鏡下觀察腺體。使用NDP圖像處理軟件（2.7.52 版本）計算每單位面積的子宮內膜腺體數量。從每個切片中隨機選擇5 個視野用于計數子宮內膜腺體的數量。對每個切片進行3 次計數以獲得平均值。此外，使用NDP 圖像處理軟件（2.7.52 版本）測量子宮內膜厚度。隨機選擇一個子宮樣本的3 個切片進行觀察。在每個切片的3、6、9 和12 點鐘位置測量子宮內膜厚度，計算4 次測量的平均值作為一個切片的平均子宮內膜厚度。然后將3個切片的平均子宮內膜厚度作為特定組中一個樣品的最終子宮內膜厚度。

1.7 免疫組織化學染色 內源過氧化物酶的活性用甲醇中的3%過氧化氫（H2O2）淬滅15 min。在預熱的0.05%檸檬酸鈉緩沖液中進行15 min 的抗原修復，然后用10%正常山羊血清封閉。載玻片在初級抗體[小鼠抗大鼠PIK3 單克隆抗體（1∶200 稀釋）、小鼠抗大鼠AKT 單克隆抗體（1∶500 稀釋）、小鼠抗大鼠p-AKT 單克隆抗體（1∶500 稀釋）]中孵育過夜。將切片與辣根過氧化物酶（HRP）標記的第二抗體[超敏酶標山羊抗小鼠IgG 聚合物（1∶5000 稀釋）]在室溫孵育2 h。最后，切片用蘇木精和DAB（3，3′-二氨基聯苯胺）并用中性脂覆蓋，在顯微鏡下觀察載玻片。使用Image Pro Plus 6.0 軟件計算不同組中p-AKT、AKT和PIK3 的表達。

1.8 逆轉錄-定量實時聚合酶鏈反應（reverse transcription -quantitative real -time polymerase chain reaction，RT-qPCR） 使用柱式法通用型RNA 提取試劑盒從各組大鼠子宮組織中提取總RNA。使用逆轉錄酶試劑盒將RNA 轉錄成cDNA。然后采用快速TB Green Premix Ex TaqTM和CFX384 多重實時熒光定量PCR 儀進行RT-qPCR 分析。PCR 反應條件設定為：在95 ℃循環30 s 后，進行38 個PCR 循環，每個循環包括變性步驟（95 ℃，5 s）和退火步驟（65 ℃，30 s）。相對mRNA 表達標準化為β-actin，用2-ΔΔCT法計算。引物序列：AKT：5′-TATATCTTCAAGCCGTCCTTG-3′（正向）和5′-TTGTTCTATCTTTTTGGTCTGC-3′（反向）；PI3K：5′-TGAGCATGAACTTCTGAAAAACG-3′（正向）和5′-CTCTTTGATCTGGTTCATGAGGT-3′（反向）；β-actin：5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′（正向）和5′-AGCACTGTTGGCATAGAGG-3′（反向）。

1.9 統計學方法 應用SPSS 22.0 軟件處理數據。符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般觀察 實驗過程中，模型組、陽性組、HBHP 組各有1 只大鼠死亡，其余大鼠處于良好的生活狀態，各組間沒有表現出明顯的差異。用藥后未出現明顯的藥物不良反應或其他不適。

2.2 各組大鼠子宮組織學分析 大鼠子宮的組織學分析顯示，對照組大鼠子宮腔形態完整，間質中腺體和血管分布正常。模型組大鼠宮腔較大，子宮壁整層變薄呈波狀，結構不完整，腺體少，毛細血管稀疏。HBHP 組和陽性組顯示子宮內膜厚度略厚，主要是完整的腺上皮細胞和管腔上皮細胞，連續的子宮內膜，腺體數量增加，毛細血管數量增多，排列整齊。與對照組比較，模型組的子宮濕重、子宮臟器指數、子宮內膜厚度和腺體數量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮濕重、子宮臟器指數、子宮內膜厚度和腺體數量均明顯增加（P＜0.05），HBHP 組較陽性組增加更明顯（P＜0.05）。見圖1 和表1。

表1 各組大鼠子宮濕重、子宮臟器指數、子宮內膜厚度和腺體數量比較（±s）

表1 各組大鼠子宮濕重、子宮臟器指數、子宮內膜厚度和腺體數量比較（±s）

注：HBHP 為何氏補腎厚膜方；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性組比較，cP＜0.05

組別對照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數12 11 11 11子宮濕重（g）0.80±0.06 0.42±0.05a 0.75±0.06bc 0.68±0.08b 7.123＜0.001子宮臟器指數（%）0.30±0.03 0.16±0.02a 0.26±0.02bc 0.24±0.03b 5.831＜0.001子宮內膜厚度（μm）526.08±23.21 357.34±14.35a 476.74±21.42bc 438.18±22.39b 4.772＜0.001腺體數量19.08±1.31 8.09±1.57a 16.09±1.34bc 13.91±1.45b 8.754＜0.001

2.3 各組大鼠子宮內膜組織PI3K、AKT 及p-AKT蛋白表達比較 免疫組化分析結果顯示，與對照組比較，模型組子宮內膜組織PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達顯著下調（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮內膜組織PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達顯著上調（P＜0.05），陽性組與HBHP 組無顯著差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮內膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠子宮內膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表達比較（±s）

注：HBHP 為何氏補腎厚膜方；AKT 為蛋白激酶B；p-AKT 為磷酸化AKT；PI3K 為磷脂酰肌醇激酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數12 11 11 11 AKT 蛋白0.71±0.11 0.21±0.01a 0.57±0.03b 0.43±0.05b 5.232 0.002 p-AKT 蛋白0.88±0.06 0.37±0.02a 0.71±0.04b 0.54±0.03b 6.111＜0.001 PI3K 蛋白0.42±0.02 0.15±0.01a 0.33±0.03b 0.28±0.02b 4.462 0.012

圖1 各組大鼠子宮的組織學分析（HE 染色，×20）

注：A 為對照組；B 為模型組；C 為HBHP 組；D 為陽性組；HBHP 為何氏補腎厚膜方

2.4 各組大鼠子宮內膜AKT、PI3K mRNA 相對表達量比較 與對照組比較，模型組大鼠子宮內膜AKT、PI3K mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，HBHP 組和陽性組子宮內膜AKT、PI3K mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.05），陽性組與HBHP 組比較無顯著差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠子宮內膜AKT、PI3K mRNA 相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠子宮內膜AKT、PI3K mRNA 相對表達量比較（±s）

注：HBHP 為何氏補腎厚膜方；AKT 為蛋白激酶B；PI3K 為磷脂酰肌醇激酶；與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別對照組模型組HBHP 組陽性組F 值P 值鼠數12 11 11 11 AKT mRNA 1.02±0.23 0.42±0.20a 0.97±0.33b 0.86±0.30b 11.612＜0.001 PI3K mRNA 1.06±0.35 0.58±0.22a 0.98±0.55b 0.87±0.33b 3.363 0.028

3 討 論

本研究成功建立了95%乙醇誘導的TE 模型大鼠，通過HE 染色觀察子宮內膜的厚度和形態，表明TE 模型大鼠建立成功。光鏡檢查顯示，經95%乙醇灌注的模型組子宮內膜明顯薄于對照組；HBHP 治療后，子宮內膜厚度增加，腺體數量增加。因此，我們推斷HBHP 改善TE 可能與促進子宮內膜腺上皮的生長和修復有關。

子宮內膜中PI3K/AKT 通路的表達受雌激素和孕激素的調節，可以將子宮內膜從薄而致密轉變為厚而透明[7]。與女性激素結合，PI3K/AKT 通路可以在子宮內膜的增殖、分泌和脫落中發揮作用。月經期PI3K/AKT 通路的低表達水平與子宮內膜脫落有關，而分泌期PI3K/AKT 通路的高表達水平促進新血管形成和血管通透性，有助于修復子宮內膜和胚胎植入[8]。McCoski 等[9]研究發現，PI3K/AKT 通路在綿羊子宮內膜的整個著床窗口期均有表達，認為PI3K/AKT通路可能有助于子宮內膜容受性。本研究中PCR 和免疫組化結果顯示，模型組PI3K/AKT 通路表達明顯低于對照組正常子宮內膜。然而，在進行HBHP 治療后，PI3K/AKT 通路的表達顯著增加。因此，HBHP 可通過增加PI3K/AKT 通路的表達促進血管生成和局部血供，從而改善子宮內膜厚度和容受性。

中醫學沒有TE 的病名，根據其臨床癥狀，可將其歸屬于“不孕”“月經過少”“閉經”等范疇。腎主生殖，腎精虧虛，精血無以滋養胞宮，而致子宮內膜變薄。HBHP 是何氏婦科多年經驗的總結，方中紫河車為血肉有情之品，生精益血，溫補腎陽，溫和而滋養力強；鹿角片、仙靈脾溫補腎陽，菟絲子、覆盆子、枸杞子、熟地、炒白芍補益肝腎，養血生精，當歸、川芎、赤芍活血，香附理氣；黃芪為補中升陽之要藥，張錫純謂其補益之功能生肌肉。全方補中有散，動靜結合，溫潤并行，具有補腎、填精、活血、養血功效，諸藥合用，不僅可以增加子宮內膜厚度，還可以改善缺血后子宮內膜血流，從而增加受精卵著床機會。

綜上，目前的研究證實HBHP 可通過增強PI3K/AKT 通路來改善TE 模型大鼠的子宮內膜厚度和容受性，但是我們發現，HBHP 組與陽性組比較，PI3K/AKT 通路表達無明顯差異的情況下，在增加子宮內膜厚度和腺體數量上優于陽性組，因此推斷可能存在其他的信號通路。在未來的研究中，我們擬構建網絡藥理學分析和實驗驗證的綜合策略來鑒定參與HBHP 對TE 有益作用的潛在活性成分和分子機制，并通過體外網絡藥理學和分子對接實驗建立關鍵靶點和信號通道[10]。