載神經毒素的透明質酸可溶性微針制備、評價及鎮痛作用研究

吳 婷 鐘家浩 姚文棟

神經毒素（neurotoxin，NT）是一種從眼鏡蛇毒中分離的多肽，具有鎮痛、抗炎、抗衰老及免疫抑制等作用[1-3]，現已有肌內注射劑上市[4]。相較于傳統的鎮痛藥，NT 長期應用無成癮性與耐受性，不但可應用于急性疼痛，還可應用于晚期癌痛、類風濕性關節炎等[3-4]。可溶性微針（dissolving microneedle，DMN）是一種由可生物降解的水溶性聚合物組成的微針，用于透皮遞送水溶性藥物[5]。通常將水溶性藥物封裝在DMN 的針頭部分，一旦穿過角質層，由生物相容性聚合物構成的針體在接觸組織液后就會溶解，從而釋放出包封的化合物。除了微針的其他優點外，DMN還具有成本低廉，可以完全溶解針頭，不引起二次危害的優點[6]。本研究采用兩步離心法以高生物相容性材料——透明質酸（hyaluronic acid，HA）作為針體材料，羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）作為背襯材料，制備載神經毒素的可溶性微針（DMNNT），通過對DMN-NT 體內外的評價，為分子量較大的多肽類藥物以及鎮痛藥物經皮遞送提供參考。

1 實驗材料

1.1 儀 器 微針模具，臺州薇凱生物科技有限公司；HF-50 數顯推拉力計，美國PACK 公司；B008 便攜式顯微鏡，深圳超眼科技有限公司；TL6R 立式離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；Nikon Eclipse Ci-L 正置顯微鏡，日本尼康株式會社；YLS-12A 鼠尾光照測痛儀，山東省醫學科學院設備站；Waters Alliance e2695 高效液相色譜儀，美國Waters 公司。

1.2 試 劑 NT，云南龍鳳谷生物藥業有限公司，批號H45021228；HA，上海艾偉拓醫藥科技有限公司，批號42122；CMC，國藥集團化學試劑有限公司，批號C10085620；其余試劑均為分析純。

1.3 動 物 健康SPF 級的6 周齡ICR 小鼠72 只（雄27 只、雌45 只），體質量（20±2）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，飼養于SPF 屏障系統中，食物充足，光照條件為12 h 明暗交替，溫度20～22 ℃，相對濕度40%～70%，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0012，按照浙江中醫藥大學動物飼養規則和使用指南進行飼養及應用，實驗后頸椎脫位處死。

2 方 法

2.1 DMN-NT 的制備 在前期工作基礎上，采用兩步離心法制備DMN-NT[6-7]。（1）加入NT 水溶液調節HA 濃度分別為10、20、30、40 mg/mL，攪拌均勻后將含藥的HA 液注入微針模具；在4 ℃，4 000 r/min 離心10 min，除去微針模具表面的HA 液，干燥1 h 后取出備用；（2）稱取CMC 溶脹為水溶液（4%），注入含干燥定型HA 的模具，離心10 min，取出后干燥成型，脫模，即得DMN-NT。DMN-NT 的機械強度通過使用拉力計測得的縱向與橫向斷裂力體現。以機械強度為指標，篩選制備DMN 最合適的HA 濃度。

2.2 表 征

2.2.1 形態特征 將所制備的DMN-NT 置于便攜式顯微鏡下觀察其形態；在正置顯微鏡下觀察形態并記錄微針的長度及寬度。

2.2.2 載藥量 將DMN-NT 溶于去離子水（1 mL）中，在充分溶解后離心，隨后取上清液，采用前期研究中的HPLC 法檢測每片載藥量[7]。

2.2.3 穩定性 取制得的DMN-NT 在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下分別保存1 周及1、3 個月后，測定其剩余載藥量。

2.3 體外透皮釋放度 按前期研究處理得到無毛的離體鼠皮并設置擴散池相應條件，隨后DMN-NT 透皮給藥[7]；分別于DMN-NT 透皮給藥0、10、20、30 min和1、2、3、4、6、8 h 收集0.5 mL 接收液，隨后補充等量接收液。對取出的接收液處理后，用高效液相色譜法測定含量并計算累計釋放率。

2.4 藥效學

2.4.1 醋酸扭體法鎮痛試驗 取36 只小鼠，雌雄各半，將其隨機數字表法分成生理鹽水（normal saline，NS）組、NT 組、DMN-NT 組；每組又分為1 h 與4 h 兩個亞組，每組6 只。按組分別給藥，NT 組肌肉注射NT 溶液（100 μg/kg），DMN-NT 組使用DMN-NT 透皮給藥，每片（2.2±0.2）μg；NS 組肌肉注射與NT 組等量的NS。給藥后1、4 h 每只小鼠按10 mL/kg 劑量腹腔注射0.6%醋酸，觀察并記錄30 min 內小鼠的扭體次數。

2.4.2 熱板法鎮痛試驗 設定溫度為（55±0.5）℃，以舔足或躍起時間為痛閾指標，篩選出基礎痛閾在10～30 s 內的雌性小鼠18 只。為避免組織損傷，設定60 s 為加熱的上限。將篩選出的18 只小鼠隨機數字表分成NS 組、NT 組、DMN-NT 組。按組給藥，隨后分別測定在30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛閾值變化。

2.4.3 鼠尾測痛法鎮痛試驗 篩選出基礎痛閾在5～10 s 內的小鼠18 只，雌雄各半，分層隨機數字表分為NS 組、NT 組、DMN-NT 組。為避免組織損傷，設定16 s 為持續加熱的上限。按組給藥，分別測定給藥后30、60、90、120、180、240、480、720 min 的痛閾值變化。

3 結 果

3.1 DMN-NT 的制備 所得DMN-NT 機械強度如表1 所示，隨HA 濃度的升高，所制備DMN-NT 機械強度升高；HA 濃度30 mg/mL 時，機械強度達到最大值，縱向斷裂力為（0.173±0.004）N，橫向橫向斷裂力為（0.598±0.042）N。然而HA 濃度40 mg/mL 時，由于濃度過高，影響DMN 成型，無法制備得到形態標準的DMN。

表1 不同濃度HA 對DMN-NT 機械強度的影響（N，±s）

表1 不同濃度HA 對DMN-NT 機械強度的影響（N，±s）

注：HA 為透明質酸；DMN-NT 為載神經毒素的可溶性微針；“-”為無此項結果

HA 濃度（mg/mL）10 20 30 40橫向斷裂力0.412±0.031 0.545±0.046 0.598±0.042-DMN-NT 片數6666縱向斷裂力0.148±0.004 0.165±0.005 0.173±0.004-

3.2 表 征 結果如圖1 所示，DMN-NT 針體呈金字塔形，表面平整，長度約為500 μm，底部寬度約為350 μm。所得每片DMN-NT 載藥（2.2±0.2）μg。穩定性結果如表2 所示，隨保存時間的延長，不同保存條件下的DMN-NT 剩余載藥量均有所下降。而相同保存時間下，低溫更有利于NT 的保存，-20 ℃條件下DMN-NT 保存3 個月仍有（98.4±1.8）%的剩余載藥量。由此可知，DMN-NT 冷凍保存穩定性較為良好。

圖1 便攜式顯微鏡（4×，A）與正置光學顯微鏡觀察DMN-NT表觀形態（100×，B）

表2 DMN-NT 在不同條件下的穩定性（%，±s）

表2 DMN-NT 在不同條件下的穩定性（%，±s）

注：DMN-NT 為載神經毒素的可溶性微針

溫度-20 ℃4 ℃室溫DMN-NT 片數剩余載藥量666 1 周100.2±1.8 100.5±2.0 99.8±2.1 1 個月99.8±1.5 99.2±2.2 99.0±2.7 3 個月98.4±1.8 96.5±1.5 95.2±2.0

3.3 體外透皮釋放度 根據釋放時間及通過計算處理后累計釋放率，繪制藥物的累積滲透曲線。結果如圖2 所示，前10 min 釋放較慢，累計滲透百分比約為10%；20～30 min DMN 中的NT 釋放較快，在20 min時已有33%累積滲透，而30 min 后透過離體皮膚的NT 累積釋放率已高于60%。并且，在2 h 后基本釋放完全，3 h 基本達到最大值95%。

圖2 DMN-NT 累積滲透曲線

3.4 藥效學

3.4.1 醋酸扭體法鎮痛試驗 如表3 所示，與NS 組比較，NT 組及DMN-NT 組小鼠不同時間點的扭體次數均顯著減少（P＜0.01）。1 h 時，DMN-NT 組小鼠的扭體次數顯著高于NT 組（P＜0.01）；4 h 時，DMNNT 組的扭體次數顯著低于NT 組（P＜0.01）。

表3 各組小鼠醋酸扭體法鎮痛試驗結果比較（次，±s）

表3 各組小鼠醋酸扭體法鎮痛試驗結果比較（次，±s）

注：NS 為生理鹽水；NT 為神經毒素；DMN-NT 為載神經毒素的可溶性微針；與NS 組比較，aP＜0.01；與NT 組比較，bP＜0.01

組別NS 組NT 組DMN-NT 組鼠數666 1 h 60.12±9.06 30.13±2.91a 37.38±3.56ab 4 h 60.25±8.96 39.64±3.52a 33.15±3.18ab

3.4.2 熱板法鎮痛試驗 結果如圖3 所示，與NS 組比較，NT 組及DMN-NT 組在給藥后30～480 min 的痛閾均顯著升高（P＜0.01）。但NT 組在30～90 min 的痛閾顯著高于DMN-NT 組，表明肌肉注射的起效時間比微針透皮快。但在240～480 min，DMN-NT 組的痛閾顯著高于NT 組，顯示微針透皮給藥延長了NT的作用時間。

圖3 各組小鼠熱板法鎮痛試驗結果

3.4.3 鼠尾測痛法鎮痛試驗 鼠尾測痛法結果（見圖4）與熱板法結果類似，與NS 組比較，NT 組在30～240 min 的痛閾顯著升高（P＜0.01），DMN-NT 組在給藥后30～480 min 的痛閾顯著升高（P＜0.01）。NT 組在30～90 min 的痛閾顯著高于DMN-NT 組；但在180～480 min，DMN-NT 組的痛閾顯著高于NT 組，再次驗證了NT 經DMN 封裝后透皮給藥延長了NT 的作用時間。

圖4 各組小鼠鼠尾測痛法鎮痛試驗結果

4 討 論

NT 主要通過與膽堿能受體結合，發揮鎮痛療效，但其對外周也具有明顯的鎮痛作用[1]。目前NT 臨床制劑主要采用肌肉注射給藥，造成患者注射部位的疼痛；而慢性疼痛的反復注射更降低了患者依從性，在有替代藥物時，不作為優先考慮，限制了其臨床應用。DMN 以穿刺形式在角質層形成通道；DMN隨后接觸組織液，針體在皮膚中逐步溶解，釋放包封在針體的藥物并發揮療效[5-6]。即使是分子量在6900左右的NT 也能通過DMN 實現透皮遞藥。

DMN 主要由高水溶性的生物相容性材料構成。與其他類型的微針（例如固體、水凝膠、包被的和空心的微針）比較，DMN 不會在皮膚上留下生物危害殘留物[8-9]。HA 是一種廣泛分布于細胞外基質的黏多糖，具備優越的生物相容性及生物可降解性[10]。HA無免疫原性，在潤滑關節、促進傷口愈合、調節血管通透性、抑制炎癥等生理功能方面具有重要意義[11]。因此，以HA 作為微針材料，不僅保證了生物安全性，還可加速皮膚微孔道愈合[12]。由于皮膚的彈性與異質性，微針針頭應具備極佳的成形性與機械強度以確保能順利穿過角質層且不變形[6]。HA 的濃度直接影響到DMN 機械強度，本研究考察不同濃度HA 制備得到DMN 的機械強度，確定了最佳制備濃度。在前期工作基礎上，我們確定了CMC 作為背襯材料可以保證DMN 柔韌性[7]。制備的DMN 主要為金字塔形，這種結構相對常見的圓柱狀、圓錐狀微針，針體更為穩固，不易在給藥過程出現斷針等現象[7，13]。微針的載藥量目前仍主要通過NT 濃度調節。本次主要用于ICR 小鼠鎮痛，根據小鼠常用量（100 μg/kg）及體質量（20±2）g 換算的小鼠肌注給藥量應為（2.0±0.2）μg。微針給藥類似于皮下注射，給藥量應略高于肌注，DMN-NT 最終載藥量為（2.2±0.2）μg，可以滿足小鼠鎮痛給藥劑量。HA 制備的微針初期釋放較慢，這可能是由于微針針體材料釋藥有一個溶脹-釋放過程[6，14]。隨后DMN 釋放較快，2 h 基本釋放完畢。DMN釋藥速率與制備材料有關，如硫酸軟骨素制備的微針在45 min 內基本釋藥完全[15]，而PVP 制備的微針相對釋藥較為持久[7，16]，HA 制備的DMN 釋藥速度相對較快。

本研究的鎮痛試驗從外周鎮痛（醋酸扭體法）和中樞鎮痛（熱板法與鼠尾測痛法）全面考察DMN-NT的鎮痛作用[17-18]。醋酸扭體研究結果表明，相比于NT組，小鼠4 h 后扭體次數明顯下降（P＜0.01），DMNNT 組作用時間明顯延長，但DMN-NT 組在1 h 時的藥效不如NT 組（P＜0.01），表明DMN 透皮給藥起效時間久于肌肉注射。熱板法中，30～90 min NT 組小鼠痛閾明顯高于DMN-NT 組（P＜0.01）；而在240～480min，DMN-NT 組痛閾明顯高于NT 組（P＜0.01），DMN 的緩釋作用使其鎮痛作用延長。但NT 組的最高痛閾較DMN-NT 組高，表明肌肉注射在初期起效劑量更多，DMN-NT 釋放持續而緩慢。鼠尾測痛試驗顯示，NT組與DMN-NT 組相較NS 組也均展現明顯的鎮痛作用，但在具體時間上有所差異，總體趨勢結果與熱板法類似。

綜上所述，NT 經DMN 負載后可以實現無痛透皮給藥；相比于肌肉注射，DMN-NT 可以提高患者依從，在不改變鎮痛效果的情況下，延長鎮痛作用時間。