溫和灸對IBS 小鼠結(jié)腸Trp-kyn/5-HT 代謝的調(diào)控機制研究

馬金丹，趙 琛，朱笑吉，陳嘉宜，馬曉芃，黃 艷，王照欽，吳璐一，陳子怡，周次利，陸 嫄*，黃儒德

（1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030；2.上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院，上海 201805）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種以反復(fù)腹痛，伴有排便習(xí)慣改變的功能性胃腸疾病。IBS 的發(fā)病率高，造成了較大的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。其病因復(fù)雜，可能和遺傳、飲食、感染、腸道微生物和心理問題有關(guān)[1]。羅馬IV 標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)為IBS 是一種典型的腦腸互動障礙，其發(fā)病與腦-腸軸具有較大關(guān)聯(lián)[2]。色氨酸（tryptophan，Trp）代謝是參與腦-腸軸的關(guān)鍵通路。研究表明，Trp 代謝與IBS 發(fā)病相關(guān)，其代謝產(chǎn)物可參與機體內(nèi)臟痛敏過程，產(chǎn)生內(nèi)臟痛[3]。本研究以IBS 模型小鼠為研究對象，測定艾灸干預(yù)對結(jié)腸組織Trp 相關(guān)產(chǎn)物含量及限速酶的表達狀況的影響，研究艾灸對IBS模型小鼠Trp代謝途徑的調(diào)節(jié)作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究采用雄性清潔級C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2018-0040]。飼養(yǎng)環(huán)境：12 小時晝夜節(jié)律交替，室溫（20±2）℃，室內(nèi)濕度50%～70%。實驗符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》（倫理編號：YYLAC-2019-032）。7 只為正常對照組，余28 只造模。正常對照組預(yù)留1 只、造模組預(yù)留4 只作模型鑒定。

1.2 試劑與儀器 2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）：Sigma-Aldrich Corporation，美國，P2297；DL-4-氯苯丙氨酸（p-chloro-phenylalanine，PCPA）：Sigma-Aldrich，美國，C8655；1-甲基-D-色氨酸（1-methyl-D-tryptophan，1-MT）：Sigma-Aldrich，美國，452483；抗色氨酸羥化酶1（anti-tryptophan hydroxylase 1， anti-TPH1）：Merck，德國，AB15570-I；抗吲哚胺2，3-雙加氧酶（anti-Indoleamine 2，3-dioxygenase，anti-IDO）：Santa Cruz， 美 國，sc-137012；RT reagent Kit：TAKARA，日本，RR047A；TB Green qPCR 試劑盒：TAKARA，日本，RR420A；LC-MS/MS AB Sciex API 4000 Qtrap，美國， Thermo Fisher；PCR 儀Veriti 96-Well Thermal Cycler（Applied Biosystems）；qPCR 儀LightCycler?480II，美國，Roche。

1.3 動物造模方法 制備IBS 小鼠模型[4]。1M TNBS原液（Sigma-Aldrich Corporation，美國，P2297）溶于30%乙醇液中制備（130 ug/mL，30% EtOH）TNBS 乙醇灌腸液。造模組小鼠提前一天予以禁食，排空消化道，5%葡萄糖溶液飲水。造模時，使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，單次直腸灌注TNBS 灌腸液0.1 mL/只誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥反應(yīng)。正常對照組麻醉后灌注0.1 mL 生理鹽水。造模完成后，當(dāng)天取正常對照及造模組各1 只，第3、7、28 天取1 只進行模型鑒定。自制小鼠腸球囊[5]，進行腹部撤回反射評分（abdominal withdrawal reflex，AWR）評估小鼠內(nèi)臟痛敏程度變化。解剖并剪取遠(yuǎn)端結(jié)腸組織作肉眼觀察，HE 染色鏡下確認(rèn)無明顯炎癥潰瘍，確認(rèn)造模成功。

1.4 分組與干預(yù) 確認(rèn)模型成功后，將剩余6 只正常對照歸為正常組，余24 只造模小鼠采用隨機數(shù)字表法隨機分為模型組、艾灸組、1-MT 組和PCPA 組，每組6 只：1）正常組（n= 6）：不進行任何干預(yù)，僅做艾灸組相同的固定，腹腔注射生理鹽水。2）模型組（n=6）：同正常組。3）艾灸組（n= 6）：造模后第28 天，進行固定，行艾灸干預(yù)，共7 d，每天1 次。腹腔注射生理鹽水。4）1-MT 組（n= 6）：與艾灸治療同時開始，不進行艾灸干預(yù)，僅做與艾灸組相同的固定；配置IDO 阻斷劑1-MT 10 mg/mL 溶液，1 mL 早晚2 次皮下注射[6-7]，共7 d。5）PCPA 組（n= 6）：艾灸治療開始后第5 天，不進行艾灸治療，僅做與艾灸組相同的固定；采用TPH 阻斷劑PCPA 干預(yù)[8-9]，小鼠腹腔注射PCPA 500 mg /kg，連續(xù)3 d。

1.5 艾灸干預(yù)操作方法 在通風(fēng)環(huán)境下，由受訓(xùn)人員進行干預(yù)。安撫小鼠后，仰面固定于固定架，頭套遮住雙眼。參照《實驗針灸學(xué)》取小鼠雙側(cè)足三里[10]，5 mm 小艾條溫和灸干預(yù)，紅外測溫控溫（45±1）℃，每日1 次每次10 min，雙側(cè)同時施灸。

1.6 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

1.6.1 標(biāo)本采集 觀察小鼠一般情況、大便次數(shù)及性狀等。將小鼠稱重后按1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，自肛門向上2 cm處剪取2～4 cm結(jié)腸組織，縱向剖開，靠近肛門端結(jié)腸4%多聚甲醛固定后石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，HE 染色。其余于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 內(nèi)臟痛敏檢測 治療前后對小鼠進行直結(jié)腸擴張刺激，測AWR 評分[5]。操作前12 h 禁食，刺激前撫摸小鼠腹部，促排糞便。小鼠清醒狀態(tài)下將球囊從肛門順直腸生理曲度插入，小鼠置于固定器內(nèi)。擴張強度分別為15、30、45、60 mm Hg（1 mm Hg ≈0.133 kPa）壓力分級。每個強度測試3 次，根據(jù)小鼠行為進行評分。

1.6.3 小鼠結(jié)腸TPH1、IDO1 蛋白及mRNA 表達檢測 免疫組化法。每張隨機取3 個視野，計算平均AOD 值。

Real-Time PCR 法：冷凍結(jié)腸100 mg 研磨至成粉狀，1 mL Trizol 裂解10 min，取上清加氯仿后室溫10 min，取上清。加入異丙醇混勻，沉淀離心取上清后加入乙醇，吸取乙醇后干燥，加入nucleasefree water，55 ℃水浴溶解RNA，紫外分析濃度。配置反應(yīng)液，37 ℃孵育15 min，設(shè)置兩步法PCR 標(biāo)準(zhǔn)程序。定量分析采用2-ΔΔCT法。引物設(shè)計參照Gene Bank 庫，NCBI Primer-blast 設(shè)計引物序列，上海捷瑞生物合成，見表1。

表1 TPH1、IDO1 mRNA 引物序列

1.6.4 小鼠結(jié)腸Trp-Kyn/5-HT 代謝物檢測 LC-MS/MS 法上機測試結(jié)腸Trp、Kyn、5-HTP、5-HT、5-HIAA水平。10 mg 結(jié)腸加入80%甲醇300 μL 預(yù)冷10 min 后勻漿裂解；4 ℃15 000 r/min 離心10 min；取250 μL 上清液。色譜上樣3 μL，流動相流速0.2 mL/min，洗脫液A 相為0.1%甲酸水溶液，洗脫液B 相為0.1%甲酸乙腈溶液。質(zhì)譜條件：正離子模式，簾氣（CUR）40 psi，碰撞氣medium，IonsprayVoltage 5 500V，溫度500 ℃，Ionsource gas1（GS1）50 psi，Ionsourcegas2（GS2）50 psi。利用Skyline 數(shù)據(jù)處理。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量數(shù)據(jù)若服從正態(tài)分布且方差齊，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），自身前后對照采用配對樣本t檢驗；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊時用Kruskal-Wailis H檢驗分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗，自身前后對照采用Wilcoxon 符號秩和檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況 正常組小鼠一般情況無異常；小鼠造模后見皮毛干枯，活動減少，飲食尚可，體質(zhì)量增加減緩，大便質(zhì)軟；干預(yù)后1-MT 組及PCPA 組體質(zhì)量增長緩慢，艾灸組皮毛色澤、精神狀態(tài)均有不同程度改善，攝食增加。各組小鼠結(jié)腸組織肉眼觀察狀態(tài)正常。

2.2 各組小鼠結(jié)腸病理學(xué)改變 各組小鼠結(jié)腸組織學(xué)無明顯差異，黏膜上皮結(jié)構(gòu)均完整，可見由單層柱狀上皮，固有層和黏膜肌層排列整齊，結(jié)構(gòu)完整，未見炎癥潰瘍，見圖1。

圖1 各組小鼠結(jié)腸病理學(xué)觀察（HE，×40）

2.3 各組小鼠AWR 評分比較 各組小鼠不同強度刺激，30 mm Hg 下，治療前模型組小鼠AWR 評分均高于正常組（P＜0.05），艾灸組小鼠AWR 評分治療后較治療前明顯降低（P＜0.05），見表2。15、45、60 mm Hg 下AWR 評分無明顯差異。

表2 各組小鼠30 mm Hg 下AWR 評分比較

2.4 艾灸對小鼠結(jié)腸組織IDO1、TPH1 蛋白表達的干預(yù) 各組小鼠結(jié)腸IDO1、TPH1 蛋白表達，與正常組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織IDO1 蛋白表達顯著增高（P＜0.05），模型組小鼠結(jié)腸組織TPH1 蛋白表達顯著增高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組和1-MT組小鼠結(jié)腸組織IDO1 蛋白表達明顯下調(diào)（P＜0.05），艾灸組和PCPA 組小鼠結(jié)腸組織TPH1 蛋白明顯下調(diào)（P＜0.05），見表3，圖2，圖3。

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織IDO1 蛋白表達（免疫組化法）

圖3 各組小鼠結(jié)腸組織TPH1 蛋白表達（免疫組化法）

表3 各組小鼠結(jié)腸IDO1、TPH1 蛋白表達比較（± s，n = 6）

表3 各組小鼠結(jié)腸IDO1、TPH1 蛋白表達比較（± s，n = 6）

注：與模型組比較，# P ＜0.05；與正常組比較，△P ＜0.05

組別 IDO1（AOD 值） TPH1（AOD 值）正常組 119.399±12.480 121.704±9.637模型組 146.230±5.925△ 142.515±15.980△艾灸組 125.435±8.411# 128.341±7.170#1-MT 組 97.537±3.160# 129.300±13.503 PCPA 組 138.695±6.143 80.792±7.612#

2.5 艾灸對小鼠結(jié)腸組織IDO1、TPH1 mRNA 表達的干預(yù) 與正常組相比，模型組結(jié)腸組織IDO1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05），模型組結(jié)腸組織TPH1 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，1-MT 組結(jié)腸組織IDO1 mRNA 表達明顯降 低（P＜0.05），PCPA 組結(jié) 腸 組 織TPH1 mRNA 表達明顯降低（P＜0.05），見表4。

表4 各組小鼠結(jié)腸IDO1、TPH mRNA 表達比較（n = 6）

2.6 艾灸對小鼠結(jié)腸組織Trp-Kyn/5-HT 代謝的影響

2.6.1 各組小鼠結(jié)腸組織Trp-Kyn代謝物含量比較 與正常組相比，模型小鼠Kyn/Trp 比值顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組Kyn/Trp 比值、1-MT組Kyn 含量及Kyn/Trp 均顯著降低（P＜0.05），見表5。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織Trp-Kyn 代謝相關(guān)物質(zhì)比較[M（QL， QU），n = 6] pg/mL

2.6.2 各組小鼠結(jié)腸組織Trp-5-HT 通路相關(guān)代謝物含量比較 與正常組相比，模型小鼠結(jié)腸組織5-HT 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，PCPA 組5-HT/Trp 含量顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組小鼠結(jié)腸Trp-5-HT 通路代謝物含量比較[M（QL， QU），n = 6）] pg/mL

3 討論

IBS 治療包括止瀉藥、抗抑郁藥或腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等方式[11]。艾灸是借灸火的溫?zé)嵝?yīng)（艾灸溫通作用的理論探討），基于其溫經(jīng)散寒、通腑止痛的功效，通過腹部所過之任脈及胃腸病所屬之足陽明胃經(jīng)為介導(dǎo)，以達到平衡脾胃氣機升降之效。前期研究結(jié)果表明，艾灸可顯著改善IBS 患者腹痛腹脹等癥狀[12]，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)研究結(jié)果也已證實[13]。艾灸可能通過調(diào)節(jié)免疫功能、5-羥色胺以及腸道微生物群等途徑改善IBS[14]，然而尚不清楚艾灸對于IBS 中Trp 代謝的影響。

本實驗中選取的足三里是胃腸疾病的首選穴之一，對“腹痛”“泄瀉”“便秘”等疾病的古代文獻進行數(shù)據(jù)顯示足三里度值最高，與其他穴位連通性好[15]。研究表明，TRPV1 的激活溫度大于43℃。本課題組研究顯示，以艾灸干預(yù)內(nèi)臟痛模型小鼠，（45±1）℃可增加其足三里局部穴區(qū)nTRPV1熒光表達，而（37±1）℃nTRPV1 熒光表達未見增多[16]。

慢性內(nèi)臟痛是一個中樞外周共同作用產(chǎn)生的病理現(xiàn)象[17-18]，隔藥灸、溫和灸均對慢性炎性內(nèi)臟痛大鼠有良好的鎮(zhèn)痛作用[19-20]。艾灸可改善痛覺過敏大鼠結(jié)腸相關(guān)鎮(zhèn)痛物質(zhì)濃度，提高痛閾值[21]。其痛敏改變是多種物質(zhì)及通路共同作用的結(jié)果[22]。胃腸道局部病變會導(dǎo)致外周穴區(qū)到結(jié)腸組織中的腸嗜鉻細(xì)胞和肥大細(xì)胞活化，釋放5-HT[23]降低下丘腦異常升高的P物質(zhì)、5-羥色胺等含量，可提高痛閾[24]。本研究提示正常與模型小鼠間AWR 評分有差異，模型小鼠存在內(nèi)臟痛敏現(xiàn)象，艾灸可改善IBS 模型小鼠內(nèi)臟痛敏程度。

慢性疼痛過程中存在Trp 的代謝紊亂，內(nèi)臟痛為IBS 的主要癥狀，犬尿氨酸是Trp 參與神經(jīng)功能調(diào)節(jié)的重要途徑，亦是內(nèi)臟疼痛的關(guān)鍵[25]。Trp 分解代謝物如Kyn、KA、3-HK 和QA 等具有神經(jīng)活性，Kyn 代謝物可能通過QA 和KA 調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，從而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。慢性收縮損傷模型小鼠海馬和脊髓中IDO 表達升高，Kyn/Trp 比值升高，5-HT/Trp 比值降低，5-HT/5-HIAA 比值降低[26]。除疼痛等胃腸道癥狀外，IBS 的共病如情緒障礙等與Kyn 濃度改變也有一定相關(guān)性，Kyn/Trp 升高，IDO 活性的增強，導(dǎo)致IBS 精神病共病患者重度抑郁現(xiàn)象[27]。IBS患者5-HIAA 水平和5-HIAA/5-HT 比值較健康對照組降低[28]。5-HT 在腸粘膜與5-HT 受體結(jié)合。研究表明IBS 模型動物存在內(nèi)臟高敏感，且血清5-HT、5-HIAA含量均顯著升高，艾灸可通過減少IBS 模型大鼠血清5-HT、5-HIAA 含量改善內(nèi)臟敏感性[29]，與本研究結(jié)果相似，提示IBS 模型小鼠內(nèi)存在內(nèi)臟高敏感現(xiàn)象，且存在TPH、IDO 蛋白及mRNA 的過表達，Trp-Kyn途徑限速酶IDO 活性增強。溫和灸治療可下調(diào)IBS 模型小鼠體內(nèi)TPH、IDO蛋白的過表達，降低IDO酶活性。