基于網絡藥理學及分子對接技術探討魚腥草治療前列腺癌分子作用機制

李 進 楊青斌 徐 靜▲

前列腺癌（prostate cancer，PCA）是指發生在前列腺上皮細胞的惡性腫瘤。前列腺癌在全球的發病率不斷上升，是嚴重威脅男性健康的常見惡性腫瘤之一。多數患者確診時已處于晚期[1]。激素去勢治療是晚期前列腺癌的首選方案[2]，但是大多數接受去勢治療的患者最終都會進展為去勢抵抗性前列腺癌。近年來，關于前列腺癌的治療方法及藥物研究不斷更新發展，但是晚期前列腺癌患者（尤其是晚期去勢抵抗性前列腺癌）的總體生存率仍未得到明顯改善。目前，中醫藥在抗腫瘤方面發揮著重要作用。魚腥草具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫等多種藥理作用，有研究表明魚腥草提取物對于肺癌[3]、肝癌[4]、乳腺癌[5]、結腸癌[6]均有明顯的抑制作用，但其具體抗腫瘤作用機制尚未明確。相關研究顯示，魚腥草可通過降低前列腺癌細胞中的細胞周期蛋白、調節凋亡相關蛋白、激活凋亡途徑，以及通過抑制HER/neu 及VEGFR 在腫瘤中的功能，從而有效地抑制PCA發展[7]，但目前關于魚腥草抗前列腺癌相關機制的研究仍比較少，也并不全面。

網絡藥理學可以反映和明確多種化合物、多個靶點、多種途徑之間的相互作用關系，是當前的研究熱點。本研究通過網絡藥理學方法，探究魚腥草抗前列腺癌的作用機制、關鍵靶點及關鍵活性成分，希望為魚腥草抗前列腺癌的臨床研究和進一步開發提供更多的參考。

1 資料與方法

1.1 魚腥草成分及作用靶點篩選通過搜索中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）篩選魚腥草有效成分，設置條件為口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性≥0.18[8]，同時查找相關文獻進行補充，建立魚腥草活性成分數據庫。將獲取的魚腥草化學成分轉化為MoL2 格式結構文件，將其結構文件上傳至PharmMapper 平臺（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/），選擇物種為“Homo sapiens”，尋找潛在藥物靶點。利用UniProt 數據平臺（ http:www.uniprot.org/）將蛋白質名稱轉化為基因名稱。

1.2 前列腺癌靶點篩選以“prostatic cancer”作為關鍵詞，通過GeneCards 數據庫（https//www.genecard.org）、OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、Drug Bank數據庫（https://go.drugbank.com/）查找前列腺癌相關靶點，并對上述3 個數據庫獲得的靶點進行整理、合并、去重。通過微生信息數據處理平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/），將前列腺癌相關的疾病靶點和魚腥草藥物活性成分靶點取交集，繪制Venn圖，獲得魚腥草治療前列腺癌的潛在治療靶點。

1.3 構建靶點蛋白互作網絡（protein-protein interaction，PPI）將潛在治療靶點上傳String 數據庫（https://cn.string-db.org/），設置最小相互作用閾值為0.4，蛋白種類為Homo sapiens，將從String數據庫得到的蛋白質互作數據導入軟件Cytoscape3.9.1，運用Network analyzer 功能及CytoNCA 功能分析靶點度（degree）值，根據度值大小排列。度值越大，說明該靶點在魚腥草發揮抗腫瘤中的作用越關鍵，為魚腥草治療前列腺癌的核心靶點。

1.4 “藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網絡圖構建將藥物活性成分及交集靶點和疾病導入Cytoscape3.9.1 軟件，構建“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網絡（target-pathway），便于數據可視化分析。通過對網絡圖進行分析，篩選出魚腥草治療前列腺癌的關鍵成分。

1.5 通路富集分析DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov/）是用于基因注釋、分類、富集和途徑分析的在線工具。使用DAVID 工具進行GO 基因功能和KEGG 信號通路富集分析，設定參數Select Identifier為“official gene symbol”，List Type 選擇“gene list”，物種選擇“homo sapiens”，以“閾值P＜0.05”為條件；并使用微生信息數據處理平臺（http://www.bioinformatics.com.cn） 對結果進行可視化處理，選擇關系密切的分析結果進行繪圖。

1.6 分子對接通過Autodock Vina軟件[9]，將篩選出的關鍵有效活性成分與關鍵靶點進行分子對接，計算結合能，利用Pymol 軟件進行作圖分析。受體-配體的結合程度可以通過分子對接結果中的結合能水平來判斷，當結合能小于0 時，代表二者之間可以自由結合，結合能越低，表示二者結合越穩定[10]。

2 結果

2.1 魚腥草活性成分及靶點共檢索到7 個活性成分，主要為異熱馬酮、山奈酚、1-甲基-2-二十九烷基-4-喹諾酮（1-甲基-2-九糖基-4-喹諾酮）、菠菜甾醇、槲皮素、黃夾次苷丙等；同時查找文獻發現魚腥草中β-谷甾醇、魚腥草素對前列腺癌細胞有抑制作用[11-12]，故共計9種成分（見表1）。去除重復靶點后得到388個活性成分作用靶點。

表1 魚腥草有效成分基本信息

2.2 前列腺癌相關靶點通過檢索GeneCards、OMIM 和Drug bank 3 個數據庫分別篩選到798、492、22 個疾病相關基因，將得到的基因靶點匯總去重，最終得到1158個疾病靶點。將藥物活性成分靶點與疾病靶點取交集，繪制Venn圖，得到與前列腺癌相關的藥物活性成分靶點98個，見圖1。

圖1 魚腥草治療前列腺癌靶點Venn圖

2.3 PPI圖的構建 將潛在治療靶點上傳String 數據庫建立PPI 網絡，通過軟件Cytoscape3.9.1，運用Network analyzer功能及CytoNCA功能分析，共有96個靶點蛋白節點（有2 個靶點游離），2560 條邊，顏色較深、半徑較大的為表皮生長因子受體（EGFR）、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、雌激素受體1（ESR1）、HRas 原 癌 基 因(HRAS)、半 胱 天 冬 酶-3(CASP3)等靶點蛋白，見圖2。度值排名前10 的靶點為核心靶點，表明其在網絡中發揮了重要作用，其靶點蛋白詳細信息見表2。

圖2 魚腥草治療前列腺癌交集靶點PPI網絡

表2 魚腥草治療前列腺癌核心靶點基本信息

2.4 “藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網絡圖的構建將98 個潛在治療靶點上傳String 數據庫得到的蛋白質互作數據導入軟件Cytoscape3.9.1，使用Cytoscape3.9.1 軟件構建“魚腥草-活性成分-共同靶點-疾病”網絡圖，見圖3。共得到109 個節點，798 個關系。圖中粉色表示前列腺癌，橙色表示魚腥草活性成分，黃色表示潛在治療靶點。圖中填充物顏色越深，說明該靶點連接的邊越多，也就是節點degre值越高；節點越大，說明該成分的degree值越大，表示其相互作用越強，圖3 中提示菠菜甾醇、山奈酚、魚腥草素、槲皮素、β-谷甾醇可能是魚腥草治療PCA方面的潛在活性成分。

圖3 魚腥草治療前列腺癌的“藥物－活性成分－共同靶點－疾病”網絡圖

2.5 GO分析及KEGG分析 GO分析結果顯示，生物學過程（BP）共富集464 個條目，主要涉及信號轉導、凋亡過程的負向調控、細胞遷移的正向調控、蛋白質磷酸化、細胞增殖的正調控、蛋白質自磷酸化、磷脂酰肌醇3-激酶信號傳導的積極調控等生物學過程相關；細胞組分（CC）共富集63個條目，主要涉及細胞溶質、細胞質、核、黏附斑、富含無花果蛋白酶-1的顆粒腔、受體復合物、核質等；分子功能（MF）共富集96 個條目，主要與蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、蛋白激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、配體激活的序列特異性DNA 結合、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結合等功能有關。因富集條目較多，選取排名前10 的通路建立柱狀圖，見圖4。KEGG 信號通路富集分析結果顯示，魚腥草治療前列腺癌的主要靶點主要涉及癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、Ras信號通路等，見圖5。通過交集靶點與通路網絡圖（圖6）可知，PI3K-Akt 信號通路、癌癥通路、前列腺癌通路等為核心通路；癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、癌癥蛋白聚糖等通路上均具有AKT1、HRAS等靶點（見表3）。

圖4 魚腥草治療前列腺癌的GO富集分析

圖5 魚腥草治療前列腺癌的KEGG信號通路富集分析

圖6 魚腥草治療前列腺癌的KEGG通路-交集靶點網絡圖

表3 魚腥草治療前列腺癌的核心通路表

2.6 分子對接驗證綜和核心靶點PPI 網絡與KEGG通路-核心靶點網絡圖選取AKT1、HRAS2與魚腥草核心成分進行分子堆積，通過圖2中篩選出的山奈酚、魚腥草素、菠菜甾醇3 個有效活性成分與AKT1、HRAS2 靶點進行分子對接驗證，結果顯示，HRAS與菠菜甾醇結合能力最強，AKT1與菠菜甾醇未找到氫鍵，AKT1 與山奈酚、HRAS 與山奈酚、AKT1 與魚腥草素、HRAS 與魚腥草素均可自由結合，見表4；將結合較好的配體受體可視化，見圖7。

圖7 菠菜甾醇和HRAS分子對接

表4 主要活性物質分子與關鍵靶點對接結合能

3 討論

網絡藥理學是多學科相互交融，構建“藥物-靶點-基因-疾病”網絡，綜合分析藥物與疾病的相互作用，揭示藥物協同作用于人體的機理的一門新學科[13]。魚腥草具有利尿通淋、清熱解毒、消癰排膿等作用，可用于泌尿系感染、前列腺炎等疾病，近年來臨床發現魚腥草對肺癌、肝癌、結腸癌、乳腺癌等各類腫瘤具有明顯的抑制作用，針對前列腺癌也有其抑制作用。但是，目前關于魚腥草抗前列腺癌相關機制的研究比較少，作用機制也尚未深入研究。本研究綜合網絡藥理學及分子對接，對魚腥草治療前列腺癌的機制進行了初步探索。

“藥物-活性成分-共同靶點-疾病”網絡圖運用Betweenness、Degree 算法拓撲分析，綜合分析魚腥草活性成分，結果得出排名較前的活性成分分別為菠菜甾醇、山奈酚、魚腥草素、槲皮素、β-谷甾醇。β-谷甾醇可直接作用到AKT1、HRAS、RHOA、CASP3、SRC、ESR1 等關鍵靶點。菠菜甾醇為植物甾醇的一種類別[14]，研究顯示，植物甾醇可誘導線粒體介導的細胞凋亡，從而抑制癌癥的發展，減少癌細胞遷移并導致G2/M 細胞周期停滯，抑制JAK/STAT 信號通路等過程，控制多種癌癥類型的進展[15]；菠菜甾醇對宮頸癌細胞系HeLa和鼠巨噬細胞系RAW 264.7具有抗增殖作用，顯示出了抗腫瘤的潛力[16]。山萘酚可能通過調控Cleaved caspase-3 及Notch1 蛋白的表達從而抑制乳腺癌SK-BR-3 細胞增殖，誘導其發生凋亡[17]；山奈酚可通過調控 Ki67 的表達，從而誘導前列腺癌的細胞周期分布，誘導前列腺癌細胞凋亡[18]；宋文斌[19]研究表明山奈酚通過影響IGF/AKT/ERK1/2 信號通路，增強前列腺癌LNCaP 細胞對于凋亡誘導劑TRAIL 的敏感性，下調雄激素受體依賴性基因——前列腺特異性抗原（PSA）及5α 還原酶-1 的表達等方面發揮抗前列腺癌作用。魚腥草素可通過抑制STAT3/核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路而從改善炎癥性腸病[20]，而炎癥是腫瘤微環境的特征之一，腫瘤的發生、發展與炎癥有一定的相關性，STAT3通過介導多種炎癥因子信號調控免疫細胞、腫瘤細胞等生物學行為，在慢性炎癥誘導腫瘤發生和腫瘤相關性炎癥形成過程中發揮重要作用[21]，STAT3的表達與癌癥的發生、發展和轉移等密切相關。槲皮素是一種重要的黃酮類化合物，具有抗腫瘤作用，可誘導腫瘤細胞的凋亡，抑制代謝活性和細胞死亡，并可通過滅活caspase/Cyto-c 途徑、抑制AP-2β/hTERT、抑制NF-κB/COX-2和阻斷Akt/ERK1/2、PI3K-Akt信號通路而發揮抗腫瘤作用[22]。同時，通過拓撲參數可知AKT1、HRAS靶點在核心靶點中較為重要。AKT1 是治療癌癥中常見的靶蛋白，可激活PI3K-Akt 信號通路中的下游分子，在細胞增殖、分化和凋亡等過程中發揮作用，AKT基因的異常活化可促進腫瘤血管生成和腫瘤的發生[23-24]。HRAS 基因屬于致癌基因，是RAS 致癌基因家族的一個主要成分，有研究[25]表明，Ras 激活可通過PI3K 信號通路降低人乳腺癌MCF-7 細胞中相關成分表達水平，從而調控腫瘤相關基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖和遷移。RAS 基因突變通過抑制GTP 酶活性激活其下游的PI3K 信號通路，使其異常活化，引起細胞的持續生長導致癌變[26]，RAS 基因在從酪氨酸激酶和G 蛋白偶聯受體到MAPK和PI3K-AKT通路信號轉導中發揮重要作用，約三分之一的腫瘤中存在RAS 突變，其中較常見的為HRAS[27]。閻臻[28]研究顯示，抑制HRAS基因表達可激活PTEN信號通路，促進上皮間質的轉化、細胞自噬和凋亡，抑制宮頸癌的發生。

本研究通過分子對接發現，山奈酚、魚腥草素與AKT1、HRAS 等關鍵靶點具有良好的結合力；KEGG富集結果顯示，魚腥草治療前列腺癌主要通路集中在癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt信號通路等，且在上述通路中，均存在AKT1、HRAS 等蛋白。本研究通過PPI 網絡圖、GO 及KEGG 富集分析表明，魚腥草通過調節ATP結合、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等，并通過癌癥通路、前列腺癌通路、PI3K-Akt 信號通路等對PCA 起治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學分析結合本領域相關研究成果得出，HRAS 是魚腥草抑制前列腺癌細胞生長的重要靶點；魚腥草中以菠菜甾醇、山奈酚、魚腥草素為主的活性成分與其抑制前列腺癌細胞生長的機制關系最為密切。從本研究結果可推測，魚腥草主要通過作用于PI3K-Akt 信號通路，影響下游HRAS 相關蛋白的表達，從而達到抑制前列腺癌細胞增殖的效果。這一推斷可以通過深入研究獲得驗證，并指導進一步臨床研究，希望能為魚腥草的新藥開發以及臨床應用提供依據。