犀角地黃湯加減方抑制焦亡相關(guān)蛋白減輕膿毒癥致急性肺損傷機(jī)制研究*

趙 媛 劉 登 施 榮△

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201204；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201204）

膿毒癥是機(jī)體對感染失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致器官功能障礙的臨床綜合征，住院率及病死率極高［1］。膿毒癥易引發(fā)肺損傷，早期表現(xiàn)為肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，通透性增高，肺泡內(nèi)滲出增加，影響氣體交換，導(dǎo)致急性肺損傷（ALI），甚至進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。細(xì)胞焦亡是一種區(qū)別于凋亡、自噬、壞死的程序性細(xì)胞死亡新形式，其特征為依賴于半胱天冬酶-1（Caspase-1），并伴有大量促炎癥因子的釋放。研究證明細(xì)胞焦亡在膿毒癥進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用［2］，焦亡途徑最終釋放白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）等炎癥因子，導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)［3］。炎癥反應(yīng)是膿毒癥相關(guān)性肺損傷發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，與肺損傷的病理生理過程相關(guān)［4］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，犀角地黃湯加減方可減輕膿毒癥小鼠的肺損傷，但具體機(jī)制尚不清楚。基于焦亡在膿毒癥致ALI 中的核心作用，本實驗擬觀察犀角地黃湯加減方對膿毒癥小鼠肺組織焦亡相關(guān)蛋白、炎癥介質(zhì)水平及病理切片等的影響，探討犀角地黃湯加減方減輕膿毒癥肺損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠30只，清潔級，雄性，體質(zhì)量16～18 g，購自上海必凱科翼有限責(zé)任公司，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房，自然照明，溫度25 ℃，相對濕度50%，自由進(jìn)食、飲水，環(huán)境保持清潔、安靜，通風(fēng)良好。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物實驗符合上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院倫理規(guī)定（PZSHUTCM2211070005）。

1.2 試藥與儀器

犀角地黃湯加減方：犀角（水牛角代替）30 g，生地黃24 g，白芍12 g，牡丹皮9 g，麻黃12 g，杏仁30 g，石膏30 g，炙甘草15 g，葶藶子15 g，大棗20 g。中藥材購于上海中醫(yī)藥大學(xué)曙光醫(yī)院，經(jīng)浸泡、煎煮、過濾及濃縮后分別制成低質(zhì)量濃度（3.3 g/mL）、高質(zhì)量濃度（6.6 g/mL）的濃縮液。Ac-YVAD-CMK（Batch：0647578-10，Cayman）；抗Caspase-1抗體（貨號AF1681，碧云天）、抗NF-κB（貨號AF5243，碧云天）；抗NLRP3（單克隆兔抗）（貨號AF2155，碧云天）、抗GSDMD（貨號66387-1-Ig，Proteintech）；IL-1β、IL-18ELISA 試劑盒（貨號EK201B/3-AW1、EK218-AW1，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能，型號：4200SF）；多功能酶標(biāo)儀（BioTek，型號：Synergy 2）；實時熒光定量系統(tǒng)（美國賽默飛世爾科技公司，型號：ABI SetpOnePlus）。

1.3 分組與給藥

30 只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、抑制劑組、中藥低劑量組和中藥高劑量組，每組6 只。抑制劑組在造模前30min 予AC-YVAD-CMK（Caspase-1 抑制劑）0.1 mL/100 μg 腹腔內(nèi)注射。藥物組在造模前予犀角地黃湯加減方連續(xù)灌胃7 d，每日1 次，每次0.2 mL（中藥低劑量組為3.3 g/mL，高劑量組為6.6 g/mL）。對照組予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.4 造模方法

采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥小鼠模型。麻醉小鼠后，用75%乙醇消毒小鼠腹部，行腹正中線切口，暴露盲腸，在距離盲腸遠(yuǎn)端約1/3 處采用3-0號縫線進(jìn)行結(jié)扎，采用21G針頭貫通穿刺結(jié)扎的盲腸2 次，輕輕擠壓使少量腸內(nèi)容物從穿刺孔溢出；將處理好的盲腸回納入腹腔，逐層縫合腹膜、肌層和外層。假手術(shù)組照常手術(shù)，但不進(jìn)行盲腸結(jié)扎和穿孔。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

術(shù)后12 h眼球取血處死小鼠，將全血靜置后離心，留取血清。

1.5.1 ELISA 檢測血清IL-1β、IL-18 含量 實驗步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.2 左側(cè)肺葉組織觀察 HE 染色，切片，光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變。

1.5.3 肺含水量檢測 麻醉后切開胸腔取下全肺，去除多余組織包膜以及心臟，用紗布擦凈表面水分與血漬，并用電子秤稱量肺濕重（W）。將濕肺放入80 ℃烤箱中烘烤48 h，以獲得干肺質(zhì)量（D）并記錄，肺含水量=（WD）÷W×100%。

1.5.4 肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD、NLRP3 蛋白檢測 取肺組織加入RIPA 裂解液，勻漿60 s×2 次，于冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清，BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行定量。上樣（80 μg蛋白），通過10%變性SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)PVDF 膜，5%脫脂牛奶于25 ℃封閉2 h，加入NLRP3（1∶500）、Caspase-1（1∶500）、Gasdermin D（1∶500）、NF-κB（1∶500）及GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（1∶500）室溫孵育2 h，顯影檢測免疫復(fù)合物，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像，以GAPDH為內(nèi)參。

1.5.5 肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD、NLRP 基因表達(dá)檢測 取肺組織，按Trizol 試劑盒提取組織總RNA。引物NLRP3，F(xiàn)：5′-GGCTGCTATCTGGAGGAA CTT-3′，R：5′-CATCTTCAGCAGCAGCCCTT-3′。Caspase-1，F(xiàn)：5′-ACTGACTGGGACCCTCAAGT-3′，R：5′-GCAAGACGTGTACGAGTGGT-3′。GSDMD，F(xiàn)：5′-GG CCCTACTGCCTTCTGAAC-3′ ，R：5′-TCCCATGCCTGACAACATCA-3′。NF-κB，F(xiàn)：5′-GACACGACAGAA TCCTCAGCATCC-3′，R：5′-CCACCAGCAGCAGCAGACATG-3′。β-Actin，F(xiàn)：5′-GCTCCTAGCACCATGAAGAT-3′ ，R：5′-GTGTAAAACGCAGCTCAGTA-3′ 。SYBR Green One-Step qRT-PCR 試劑混勻后置于實時熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為50 ℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，65 ℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)。以β-Actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較

見表1。與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β 和IL-18 水平均明顯增加，差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組能夠下調(diào)血清中IL-1β和IL-18水平，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；中藥組IL-1β和IL-18水平顯著下降，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組IL-1β和IL-18水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05和P＜0.01）。

表1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表1 各組小鼠血清IL-1β和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

注：與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與中藥低劑量組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

IL-18 133.35±25.56 611.84±14.71 413.01±14.95**503.79±29.19**476.26±14.81**△△組 別假手術(shù)組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6 IL-1β 126.49±10.15 421.86±13.96 226.26±25.43**319.75±34.49**250.44±27.62**△

2.2 各組小鼠肺組織HE染色比較

見圖1。可見對照組肺內(nèi)的各級結(jié)構(gòu)完整，無炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡上皮細(xì)胞腫脹，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)大量炎性滲出，毛細(xì)血管明顯擴(kuò)張和充血，微血栓形成；抑制劑組和中藥高、低劑量組的肺水腫、肺間質(zhì)及肺泡出血滲出均減輕。

圖1 各組小鼠肺組織病理觀察（HE染色）

2.3 各組小鼠肺組織干/濕重比值比較

見表2。與假手術(shù)組相比，模型組肺組織肺干/濕重比值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，抑制劑組、藥物組肺干/濕重比值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。中藥高劑量組干/濕重比均值大于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺干/濕重比值比較（%，±s）

表2 各組小鼠肺干/濕重比值比較（%，±s）

組 別假手術(shù)組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6干/濕重24.70±0.11 21.58±0.48 24.02±0.53**22.93±0.28**23.01±0.66**△

2.4 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3基因表達(dá)比較

見表3。與假手術(shù)組相比，模型組NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3 基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，抑制劑組Caspase-1、GSDMD 基因表達(dá)水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），NF-κB 和NLRP3 表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。中藥低、高劑量組NFκB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因表達(dá)水平均顯著下降，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組NF-κB、Caspase-1、GSDMD 和NLRP3 基因相對表達(dá)水平下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因相對表達(dá)量比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、GSDMD和NLRP3基因相對表達(dá)量比較（±s）

組 別假手術(shù)組模型組抑制劑組中藥低劑量組中藥高劑量組n6 6 6 6 6 NF-κB 1.03±0.26 12.58±1.63 10.21±1.36 6.45±0.13**2.89±0.13**△Caspase-1 1.16±0.72 3.73±0.89 0.24±0.10**1.37±0.29**0.70±0.24**△GSDMD 1.08±0.55 5.80±1.64 0.24±0.07**2.72±0.31**1.58±0.40**△NLRP3 1.01±0.13 12.35±2.31 11.12±0.94 5.20±0.69**1.51±0.40**△

2.5 各組小鼠肺組織中NF-κB、NLRP3、Caspase-1 和GSDMD蛋白表達(dá)的比較

見圖2。與假手術(shù)相比，模型組小鼠肺組織中NFκB、NLRP3、Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。與模型組相比，抑制劑組Caspase-1 和GSDMD-N 蛋白的表達(dá)降低，中藥高劑量組、中藥低劑量組NF-κB、NLRP3、Caspase-1、和GSDMD-N 蛋白表達(dá)量均下降。與中藥低劑量組相比，中藥高劑量組NF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)有下降趨勢。

圖2 各組小鼠肺組織NF-κB、Caspase-1、NLRP3、GSDMD和GSDMD-N焦亡相關(guān)蛋白條帶

3 討 論

肺損傷是膿毒癥病程中最常見的并發(fā)癥之一，在膿毒癥早期即可出現(xiàn)，其院內(nèi)死亡率高，極度耗費(fèi)醫(yī)療資源，嚴(yán)重威脅人類生命健康。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查顯示，68.2%的膿毒癥患者合并肺損傷，死亡率約35%［5］。西醫(yī)主要以機(jī)械通氣治療為主，但即使是保護(hù)性的通氣策略，也只是為肺屏障的修復(fù)及藥物發(fā)揮作用爭取時間，無法避免肺損傷［6］。

近年來，中醫(yī)中藥在膿毒癥急性肺損傷防治中發(fā)揮著重大作用。葉天士在《外感溫?zé)崞分赋觯骸皽匦吧鲜埽紫确阜巍薄Ｖ嗅t(yī)認(rèn)為，膿毒癥屬于溫病，主要為熱毒侵襲，熱毒致病暴戾猛烈，常入內(nèi)毒害臟腑，導(dǎo)致疾病急速惡化。宋代張杲提出“肺為嬌臟，怕寒而惡熱，故邪氣易傷而難治”。肺主氣司呼吸，肺為水之上源，通過肺氣的宣發(fā)肅降推動全身水液輸布。熱毒致病并入肺，一方面熱毒耗傷津液，表現(xiàn)為燥、渴；另一方面，肺臟受熱毒所傷，主水之功能失司，致水熱互結(jié)于肺，表現(xiàn)為氣促、燥熱。因此，我們認(rèn)為膿毒癥肺損傷核心病機(jī)為熱毒壅盛、水熱結(jié)肺。基于以上認(rèn)識，我們以犀角地黃湯為基礎(chǔ)，加麻杏石甘湯、葶藶大棗湯應(yīng)用于臨床。犀角地黃湯清熱解毒，麻杏石甘湯清宣肺熱，葶藶大棗湯逐飲、泄肺平喘。全方配伍共起清熱涼血、瀉肺逐水作用。以上方劑均為臨床治療膿毒癥、肺損傷之經(jīng)典方劑。研究顯示，犀角地黃湯能顯著降低膿毒癥患者血清中白細(xì)胞、超敏CRP、降鈣素原、IL-6、TNF-α等炎癥介質(zhì)水平［7］，改善凝血功能指標(biāo)及其預(yù)后，降低ICU 住院率、ICU 住院時間和28 d病死率［8］。有學(xué)者報道麻杏石甘湯化裁能有效清泄肺熱［9］，緩解LPS 所致急性肺損傷的炎癥反應(yīng)［10］。

膿毒癥肺損傷的病因及發(fā)病機(jī)制錯綜復(fù)雜，炎癥反應(yīng)失控是其發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11-12］。膿毒癥肺組織損傷表現(xiàn)為肺泡壁通透性增加，彌漫性肺泡及肺間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管淤血與微血栓形成等。本實驗肺組織病理切片中，模型組肺組織病損程度嚴(yán)重，中藥組肺組織炎癥反應(yīng)明顯減輕，表明犀角地黃湯加減方能減輕膿毒癥炎癥反應(yīng)、降低肺損傷、保護(hù)肺組織。

NF-κB 是多種信號通路的核心，LPS 通過胞膜模式識別受體（TLRs 等）可以激活NF-κB 途徑，為NLRP3 炎性小體的激活奠定物質(zhì)基礎(chǔ)［13］。有研究報道NF-κB 是犀角地黃湯減輕炎癥的重要靶點(diǎn)之一［14］。地黃、石膏可抑制促炎基因的表達(dá)和NF-κB的激活［15-16］，牡丹皮可通過抑制TLR4 信號通路抑制炎癥反應(yīng)［17］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用犀角地黃湯加減方灌胃的膿毒癥小鼠肺組織的NF-κB表達(dá)較模型組明顯下調(diào)。在經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中，NLRP3 等炎癥小體被激活后將活化并裂解Pro-Caspase-1形成具有活性的Caspase-1，活化的Caspase-1裂解GSDMD蛋白形成具有活性的N端和C端，N端作用于胞膜形成孔洞，釋放出IL-1β和IL-18；同時Caspase-1 還可以處理pro-IL-1β 形成有活性的IL-1β，釋放到細(xì)胞外擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致組織損害。在非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑中，活化的Caspase-4/5/11可以直接與細(xì)菌的LPS 等接觸激活，然后切割GSDMD蛋白，并間接激活Caspase-1，引發(fā)焦亡［3］。

邵峰院士團(tuán)隊［18］證實膿毒癥病程中活化的Caspase-1可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)釋放，從而引起炎癥反應(yīng)，表明焦亡在膿毒癥進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。本研究顯示，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠肺組織Caspase-1 和GSDMD 蛋白表達(dá)水平上調(diào)，提示在膿毒癥早期，肺組織內(nèi)細(xì)胞焦亡已經(jīng)發(fā)生。Ming 等［19］的研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素血癥動物模型中，Caspase-1基因敲除的小鼠與野生型小鼠相比有著更高的存活率。本研究中，與模型組相比，Caspase-1 抑制劑組小鼠的血清IL-1β、IL-18 水平下降，Caspase-1和GSDMD 蛋白表達(dá)均下調(diào)，肺組織損傷減輕，說明通過抑制焦亡途徑可以減輕膿毒癥肺損傷。與模型組相比，犀角地黃湯加減方藥物組小鼠肺組織NF-κB、NLRP3、Caspase-1和GSDMD 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，小鼠的血清IL-1β、IL-18 水平均明顯下降，肺組織損傷顯著減輕，且中藥高劑量組比中藥低劑量組改善更明顯，表明犀角地黃湯加減方可以通過抑制TLR4 信號通路減少NF-κB 激活，從而抑制了NLRP3 炎性小體的激活以及Caspase-1 活化所引發(fā)的一系列焦亡、炎癥反應(yīng)，減少肺損傷，且與藥物的濃度呈現(xiàn)相關(guān)性。

基于以上結(jié)果，我們認(rèn)為犀角地黃湯加減方能通過抑制NLRP3 炎性小體的激活及Caspase-1 活化所致的焦亡相關(guān)通路來改善炎癥反應(yīng)，減輕膿毒癥所致的肺損傷。

綜上，本研究通過動物體內(nèi)實驗驗證了犀角地黃湯加減方對膿毒癥肺損傷的調(diào)控作用及相關(guān)通路，但也存在一定局限性，雖然檢測了焦亡相關(guān)蛋白，但未對焦亡主要細(xì)胞進(jìn)行明確。后期我們將篩選出藥物作用的具體成分以及焦亡細(xì)胞的種類，進(jìn)一步明確犀角地黃湯加減方緩解膿毒癥致ALI 的機(jī)制，為臨床運(yùn)用提供實驗依據(jù)。