利伐沙班聯合血栓通膠囊調控血栓調節蛋白表達抑制大鼠深靜脈血栓形成的機制研究*

潘應強 沈 駿 潘 杰 史 睿 張 攀

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴州 貴陽 550001；3.貴州中醫藥大學第二附屬醫院，貴州 貴陽 550001）

下肢深靜脈血栓形成（DVT）指血液在深靜脈腔內凝結，造成靜脈回流障礙，進而引發肢體腫脹疼痛的臨床疾病［1］。隨著人口老齡化現象的加重，DVT 引發的靜脈血栓栓塞癥（VTE）發病率高達1.53%，已成為心血管患者致死的主要病因［2］。目前抗凝和溶栓是治療DVT 的基本手段。利伐沙班抗凝效果顯著，安全性高［3］。血栓通膠囊可疏通血液凝結，為血栓栓塞常用藥［4］。本研究通過觀察利伐沙班聯合血栓通膠囊對血栓調節蛋白表達的調控作用，探討藥物聯合治療抑制大鼠深靜脈血栓形成的機制，為臨床治療DVT 提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡SPF 級雄性大鼠60 只，體質量210～235 g，購自貴州中醫藥大學實驗動物研究所，生產許可證號：SCXK（黔）2021-0003。動物培養室晝夜25 ℃，50%恒濕，12 h黑暗/12 h光照。

1.2 實驗藥物

利伐沙班片（蘇州東瑞制藥公司，國藥準字H20233402）；血栓通膠囊（主要成分：三七總皂苷，哈爾濱珍寶制藥有限公司，國藥準字Z20025972）。

1.3 試劑與儀器

活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）和血漿纖維蛋白原（FIB）檢測試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，貨號：YS0306、YS0307、YS0335 和YS0308）；蘇木素-伊紅染色試劑盒（金克隆北京生物技術有限公司，貨號：RS3390）；血栓蛋白（TM）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和細胞間黏附因子-1（ICAM-1）ELISA 試劑盒（上海生工生物工程有限公司，貨號：D721144、D711385 和D731167）。一步法反轉錄熒光定量試劑盒（上海生工生物工程有限公司，貨號：B639277）；冷凍微量高速離心機OHAUS，型號：FC5515R）；分析天平（日本島津，型號：AP135W）；熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad，型號：T100）。

1.4 分組與造模

采用隨機數字表法將大鼠分為對照組、模型組、利伐沙班組、血栓通組和利伐沙班聯合血栓通膠囊組（聯合組），每組12 只。大鼠可自由進食，適應性飼養1 周。造模前12 h 禁食，以腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 進行麻醉，麻醉后以仰臥位將大鼠固定于實驗臺，消毒后沿腹中線切2 cm 傷口暴露下腔靜脈分支至髂總靜脈分叉處，用血管夾阻斷該段血管。2 h后，可見血管顏色暗紅，細針穿刺后無血液流出即造模成功。深靜脈血栓形成后取出血管夾，縫合傷口并消毒。對照組切腹后不給予血管夾阻斷血管［5］。

1.5 給藥方法

對照組和深靜脈血栓模型組灌胃注射3 mL 生理鹽水；利伐沙班組每日灌胃給藥2.6 mg/kg；血栓通組每日灌胃給藥0.45 g/kg；聯合組每日分別灌胃利伐沙班2.6 mg/kg、血栓通膠囊0.45 g/kg。各組均每日給藥1次，連續7 d［6］。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 凝血指標檢測 末次給藥間隔8 h 后，取5 組大鼠動脈血1 mL，3 000 r/min 離心15 min，取上清測定APTT、PT、TT和FIB。檢測方法參照試劑盒說明書。

1.6.2 蘇木素-伊紅（HE）染色 取各組大鼠左腎靜脈結扎線至股靜脈1～2 cm，樣本用10%甲醛溶液固定，包埋在石蠟中，包埋組織切片后依次進行蘇木素染液和伊紅染液染色。使用光學顯微鏡觀察血管內皮組織病理變化情況。

1.6.3 血栓質量檢測 分離各組小鼠下腔靜脈，在管腔內小心取出血栓，PBS 溶液沖洗2 次，用微量電子天平稱取血栓濕質量。血栓轉移至烘箱中，60 ℃干燥30 min，稱重并記錄干重［7］。

1.6.4 ELISA 檢測血液蛋白含量 取各組大鼠頸動脈血3 mL 于3.8% 枸櫞酸鈉生理水溶液中抗凝，5 000 r/min，4 ℃離心5 min。取血清，參照ELISA 試劑盒說明書檢測TM、MCP-1和ICAM-1的含量。

1.6.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測 取各組左腎靜脈結扎線至股靜脈短置于液氮，快速研磨成粉末。使用RNA 提取試劑盒提取樣本RNA，熒光定量PCR 儀檢測TM、MCP-1 和ICAM-1 表達水平。參照逆轉錄試劑盒將1 μg RNA 反轉錄成cDNA，以cDNA 為模板，β-actin 為內參，進行實時熒光定量PCR 擴增。PCR 反應條件：95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃30 s，40 個循環。以2-ΔΔCt計算TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA 的相對表達水平。TM 上游引物：GATTTTCAGACGCTGCCGA TAG；下游引物：CA- GAGTTCGTTGCACAATTGAG。MCP-1 上游引物：CCAGTTACCACGAGCGGGAA；下游引物：GATTATTCGCCACAGGATTGCC。MIF 上游引物：ATCTTGGAGTCGACGCTTTCT；下游引物：TTGGG ACCCTATCGGGAGG［8］。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 各組小鼠凝血指標比較

見表1。與對照組相比，模型組大鼠APTT、PT、TT顯著降低，FIB 含量顯著升高（P＜0.05），表明模型組大鼠凝血時間較對照組延長。與模型組相比，利伐沙班組、血栓通膠囊組APTT、PT、TT升高，FIB含量降低，聯合組APTT、PT、TT 顯著升高，FIB 水平顯著降低（P＜0.05），表明用藥治療后深靜脈血栓大鼠凝血時間減短，且利伐沙班和血栓通膠囊聯合用藥后凝血效果顯著。

表1 各組大鼠凝血指標比較（±s）

表1 各組大鼠凝血指標比較（±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05；與利伐沙班組比較，▲P ＜0.05；與血栓通組比較，□P ＜0.05。下同。

組 別對照組模型組利伐沙班組血栓通組聯合組n 12 12 12 12 12 APTT（s）24.04±1.32 13.69±1.55*16.48±1.97*△17.31±1.15*△23.81±0.98△▲□PT（s）11.67±0.84 6.72±0.94*8.48±0.42*9.74±1.18*△12.36±1.13△▲□TT（s）35.73±2.31 25.61±2.26*30.18±1.96*△30.51±0.77*△35.67±0.83△▲□FIB（g/L）2.13±0.43 2.98±0.26*2.68±0.83*△2.55±0.27*△2.04±0.92△▲□

2.2 各組大鼠血管內皮細胞組織病理觀察

HE 染色后，對照組血管內皮細胞結構完整，形態正常；模型組損傷嚴重，細胞腫脹脫落，大量炎癥細胞附著；利伐沙班組和血栓通組血管內皮細胞中度損傷，少量炎癥細胞附著；聯合組血管內皮細胞損傷輕微，極少炎癥細胞附著現象。見圖1。

圖1 各組大鼠血管內皮細胞組織病理情況（HE染色，400倍）

2.3 各組大鼠血栓質量比較

見表2。對照組無血栓現象。與模型組相比，利伐沙班組、血栓通組和聯合組血栓濕質量和干質量顯著降低（P＜0.05）；與利伐沙班組相比，血栓通組和聯合組血栓濕質量顯著降低（P＜0.05）；與血栓通組相比，聯合組血栓濕質量和干質量顯著降低（P＜0.05）。結果表明，用藥治療后深靜脈血栓大鼠血栓減輕，且聯合組血栓減輕效果顯著。

表2 各組大鼠血栓質量比較（mg，±s）

表2 各組大鼠血栓質量比較（mg，±s）

組 別對照組模型組利伐沙班組血栓通組聯合組n 12 12 12 12 12血栓濕質量0 21.34±2.45 16.39±2.74△13.45±2.92△▲9.41±3.15△▲□血栓干質量0 16.44±2.73 8.78±2.47△8.63±2.54△5.18±3.26△▲□

2.4 各組大鼠血液蛋白含量比較

見表3。與對照組相比，模型組中大鼠TM、MCP-1、ICAM-1 蛋白含量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，利伐沙班組、血栓通組和聯合組TM、MCP-1、ICAM-1 蛋白含量均降低，聯合組蛋白水平顯著降低（P＜0.05）。表明利伐沙班聯合血栓通膠囊可調控血栓調節蛋白，緩解大鼠深靜脈血栓。

表3 各組大鼠TM、MCP-1、ICAM-1蛋白表達比較（±s）

表3 各組大鼠TM、MCP-1、ICAM-1蛋白表達比較（±s）

組 別對照組模型組利伐沙班組血栓通組聯合組n 12 12 12 12 12 TM（ng/mL）16.27±1.42 27.84±1.03*21.53±1.64*△23.86±1.08*△17.33±1.75△▲□MCP-1（pg/mL）121.58±10.78 257.83±12.74*183.62±12.53*166.88±13.82*△136.9±11.60△▲□ICAM-1（ng/mL）183.82±12.37 571.83±43.27*386.89±22.74*△401.86±33.82*△▲223.53±19.54*△▲□

2.5 各組大鼠血栓組織中相關mRNA表達比較

見表4。與對照組相比，模型組TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組相比，利伐沙班和血栓通組TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA 表達水平降低，且聯合組mRNA 顯著降低（P＜0.05）。

表4 各組大鼠TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠TM、MCP-1、ICAM-1 mRNA表達比較（±s）

組 別對照組模型組利伐沙班組血栓通組聯合組n 12 12 12 12 12 TM 1.00±0.00 3.26±0.34*2.67±0.17*△1.96±0.88*△▲1.08±0.28△▲□MCP-1 1.00±0.00 8.34±1.26*4.83±1.64*5.84±1.79*△2.84±1.33*△▲□ICAM-1 1.00±0.00 4.72±0.63*3.64±0.58*△3.45±0.18*△▲2.35±0.38*△▲□

3 討 論

血管壁損傷、血液阻滯、凝血障礙為血栓形成的常見誘因［9］。單純抗凝血不能完全清除DVT 血栓，因此聯合使用抗凝和溶栓藥物可清除血栓［10］?？鼓幚ド嘲鄬儆谥苯覺a因子抑制劑，無須監測常規凝血指標，可抑制血栓蔓延，疏通血管，降低DVT 并發癥發病率［11-12］。血栓通膠囊作為溶栓藥可促進纖維蛋白溶解血栓，保護靜脈結構和功能，減少血栓對機體的不可逆損害［13］。利伐沙班和血栓通膠囊聯合治療DVT 的分子機制尚不清楚。另一方面，研究表明TM 可抑制深靜脈血栓形成［14］。TM 作為檢測DVT 的重要標志物，其表達水平與血管內皮細胞損傷程度相關。

本研究通過觀察利伐沙班聯合血栓通膠囊治療大鼠深靜脈血栓過程中TM 的表達水平，闡釋利伐沙班聯合血栓通膠囊治療DVT 的作用機制。凝血異常是血栓形成的關鍵因素［15-16］。本研究對凝血指標檢測發現，聯合組可顯著延長DVT 大鼠APTT、TT 和PT，FIB 含量較模型組顯著降低（P＜0.05），利伐沙班聯合血栓通膠囊可能是通過抑制凝血因子活性，進而降低FIB 含量發揮抗凝作用［17-18］。對5 組大鼠內皮細胞組織切片染色發現，模型組大鼠血管內皮細胞結構異常，有大量炎癥細胞附著，導致組織發生炎性損傷。血栓質量比較結果表明，聯合組較模型組質量顯著降低（P＜0.05）。以上結果表明聯合組治療DVT 大鼠可有效抑制血栓形成。

TM作為凝血酶蛋白的重要組成部分，可抑制大鼠深靜脈血栓形成，炎癥因子MCP-1 和ICAM-1 是驗證細胞激活過程的重要標志物，與TM 異常表達相關［19］。為進一步研究利伐沙班聯合血栓通膠囊對TM 的調控作用，本研究檢測了TM 的含量變化。聯合組能顯著降低DVT 大鼠TM、MCP-1 和ICAM-1 含量，表明利伐沙班聯合血栓通膠囊可能通過調控TM 促進抗凝因子的表達。研究表明NF-κB 信號通路是DVT 治療中的關鍵通路［20］，MCP-1 和ICAM-1 是NF-KB 信號通路的關鍵因子［21］。利伐沙班聯合血栓通膠囊能顯著降低二者含量并抑制血栓組織中TM、MCP-1 和ICAM-1 mRNA 合成，表明聯合用藥可能通過調控TM 的表達介導MCP-1和ICAM-1因子的轉錄，發揮凝血溶栓作用，進而抑制大鼠深靜脈血栓形成。

綜上所述，利伐沙班聯合血栓通膠囊可通過抑制TM 表達對DVT 大鼠發揮抗炎凝血作用。本研究進一步闡釋了利伐沙班聯合血栓通膠囊對DVT 大鼠血管內皮細胞的分子機制，為臨床用藥提供依據。