痛瀉安腸方對(duì)腸易激綜合征小鼠短鏈脂肪酸代謝及Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡的影響*

袁亞利 謝春娥，2 李軍祥 毛堂友 薛曉軒裴文婧 王木源張文基 盧心毓 趙興杰△

［1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，100078；2.廣東省深圳市寶安中醫(yī)院（集團(tuán)），廣東 深圳 518133］

腹瀉型腸易激綜合征（IBS-D）是消化科常見(jiàn)的功能性腸病，臨床以腹痛伴有腹瀉為主要表現(xiàn)，在我國(guó)發(fā)病率較高，約占IBS 所有亞型的75%左右［1-2］。IBS-D發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚無(wú)安全有效的治療方法［3］。北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院李軍祥教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，仿痛瀉要方創(chuàng)立了具有抑肝扶脾作用的痛瀉安腸方，前期研究發(fā)現(xiàn)其能明顯改善患者腹痛、腹瀉等臨床癥狀［4］，降低IBS 小鼠內(nèi)臟高敏感及腸道菌群紊亂［5］。短鏈脂肪酸是腸道菌群的重要代謝產(chǎn)物之一，近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，短鏈脂肪酸（SCFAs）在IBS-D的發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用，其不僅參與調(diào)節(jié)內(nèi)臟敏感性、維持腸上皮屏障功能，并且參與調(diào)節(jié)腸道Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡［6-7］。因此，本研究以短鏈脂肪酸為切入點(diǎn)，通過(guò)束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃復(fù)制肝郁脾虛證IBS-D 小鼠模型，進(jìn)一步探討痛瀉安腸方對(duì)小鼠短鏈脂肪酸代謝及Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡的影響，為中藥的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠，體重18～22 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：110011211111792224，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（BUCM-4-2021061002-2115）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

痛瀉安腸方配方顆粒（組成：炒白術(shù)15 g，炮姜9 g，白芍12 g，烏梅9 g，陳皮6 g，蟬蛻6 g，黃連6 g）購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司。番瀉葉顆粒購(gòu)自華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司。

1.3 試劑與儀器

FITC anti-mouse CD3（Biolegend，美國(guó)，100204），Brilliant Violet 510TManti-mouse CD4（Biolegend，美國(guó)，100449），Brilliant Violet 421TManti-mouse IFN-γ（Biolegend，美國(guó)，505830），PE anti-mouse IL-4（Biolegend，美國(guó)，504104），F(xiàn)ixation/Permeabilization Concentrate（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，00-5123-43），eBioscience Fixation/Perm Diluent（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，00-5223-56），Permeabilization Buffer（10X）（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)，008333-56），流式細(xì)胞儀（BD FACS Canto Plus，美國(guó)）。

1.4 分組與造模

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，30 只小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、痛瀉安腸方低劑量組、痛瀉安腸方中劑量組和痛瀉安腸方高劑量組，每組6 只。使用束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃復(fù)制肝郁脾虛證IBS-D 小鼠模型［8］：小鼠每日上午9∶00～11∶00 予束縛刺激2 h，連續(xù)2 周，自第2 周起灌胃番瀉葉水溶液（0.607 g/mL），灌胃體積0.01 mL/g，每日1 次，連續(xù)1 周。痛瀉安腸方低、中、高劑量組分別予痛瀉安腸方溶液4.93、9.86、19.72 g/kg灌胃，空白組及模型組予0.9 %氯化鈉溶液灌胃，每日1次，連續(xù)治療14 d。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 糞便SCFAs含量 收集小鼠新鮮糞便組織，檢測(cè)糞便SCFAs（包括丁酸鹽、乙酸鹽及丙酸鹽等）的濃度，檢測(cè)方法如下：將10 mg糞便樣品加入160 μL蒸餾水中混勻，置于超聲波提取器中30 min，隨后4 ℃，8 000g離心10 min。取上清液，加水稀釋（1∶50），并用0.22 μm篩網(wǎng)過(guò)濾。提取的樣品使用Dionex ICS-3000 離子色譜系統(tǒng)（Dionex，Sunnyvale，CA，USA）進(jìn)行檢測(cè)。

1.5.2 腸系膜淋巴結(jié)T 淋巴細(xì)胞檢測(cè) 本研究使用CD3+、CD4+共標(biāo)記的T 細(xì)胞，采用CD3+、CD4+、IFNγ+共標(biāo)記Th1 細(xì)胞，CD3+、CD4+、IL-4+共標(biāo)記Th2 細(xì)胞［9］。小鼠治療結(jié)束后禁食12h，隨即麻醉剖殺取腸系膜淋巴結(jié)，快速放入裝有提前預(yù)冷的cDMEM（DMEM∶FBS∶雙抗=100∶10∶1）中，用70 μm 的細(xì)胞篩過(guò)濾，制備單個(gè)細(xì)胞混懸液，依次進(jìn)行刺激、破膜、染色，隨即上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠糞便SCFAs相對(duì)含量比較

見(jiàn)表1。與空白組相比，模型組小鼠糞便總SCFAs相對(duì)含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中乙酸、丙酸及丁酸均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01 或P＜0.05），痛瀉安腸方各劑量組治療后小鼠糞便總SCFAs 相對(duì)含量均顯著降低（P＜0.01），乙酸、丙酸及丁酸均有不同程度降低，其中痛瀉安腸方各劑量組均可顯著降低乙酸和丁酸的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），低劑量組及中劑量組可顯著降低丙酸的含量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組小鼠SCFAs相對(duì)含量比較（μg/g，±s）

表1 各組小鼠SCFAs相對(duì)含量比較（μg/g，±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。下同。

組 別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n6 6 6 6 6總SCFAs 1 321.0±378.2 2 700.0±439.8**1 577.0±303.5△△1 424.0±352.0△△1 730.0±496.0△△乙酸894.8±246.3 1 780.0±267.7**1 113.0±174.4△△939.4±176.3△△1 174.0±301.5△△丙酸252.3±81.6 563.9±176.0*305.2±107.1△314.2±103.5△396.7±136.7丁酸144.5±60.9 357.8±151.8*122.2±77.9△△81.3±51.6△△122.9±77.4△△

2.2 各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1細(xì)胞的表達(dá)比較

見(jiàn)表2、圖1。采用CD3+、CD4+、IFN-γ+共標(biāo)記Th1細(xì)胞，模型組小鼠在造模后Th1細(xì)胞占比與空白組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），在中劑量和高劑量痛瀉安腸方灌胃2 周后小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1細(xì)胞占比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1細(xì)胞比例

表2 各組小鼠系膜淋巴結(jié)Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)及Th1/Th2比值比較（±s）

表2 各組小鼠系膜淋巴結(jié)Th1、Th2細(xì)胞表達(dá)及Th1/Th2比值比較（±s）

組 別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n6 6 6 6 6 Th1（%）1.51±0.10 3.41±0.47**2.75±0.55 1.62±0.12△△2.02±0.14△△Th2（%）2.24±0.16 0.80±0.08**2.28±0.50△△2.03±0.56△2.09±0.55△Th1/Th2 0.67±0.02 4.32±0.79**1.21±0.03△△0.84±0.21△△1.01±0.28△△

2.3 各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th2細(xì)胞的表達(dá)比較

見(jiàn)表2、圖2。采用CD3+、CD4+、IL-4+共標(biāo)記Th2細(xì)胞，與空白組相比，模型組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th2細(xì)胞占比顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），不同劑量痛瀉安腸方灌胃干預(yù)2 周后，小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th2 細(xì)胞占比均明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。

圖2 各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th2細(xì)胞比例

2.4 各組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡比值

見(jiàn)表2。與空白組相比，模型組小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1/Th2細(xì)胞比率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。而不同劑量痛瀉安腸方灌胃干預(yù)2 周后，小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡比值均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討 論

IBS 是功能性胃腸病中最具代表性的一類疾病。在我國(guó)，除了明顯的腹痛，反復(fù)發(fā)作的腹部不適、腹脹伴有排便情況改變也被納入IBS的診斷中［11］。羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)將其分為腹瀉型、便秘型、混合型以及不定型4個(gè)亞型［10］，其中腹瀉型占比最多。性別、年齡、飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等均可影響疾病的發(fā)生，盡管有研究發(fā)現(xiàn)男女患病率并無(wú)明顯差異［11］，但大部分研究均支持女性的患病率略高于男性［12］，其好發(fā)于中青年，這可能與中青年的生活、學(xué)業(yè)壓力較大相關(guān)［13］。IBS雖然是一種功能性疾病，但長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并且極易出現(xiàn)焦慮、抑郁等情緒。

IBS-D 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs 在IBS 的病理生理學(xué)過(guò)程中起重要作用［14］。Tana 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，IBS 患者的糞便樣本中乙酸鹽、丙酸鹽和總SCFA 的含量顯著高于對(duì)照組，且乙酸鹽和丙酸鹽水平高的IBS 患者胃腸道癥狀、生活質(zhì)量和負(fù)面情緒明顯更差。Germana 等［16］研究發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，IBS-D 患者糞便中的乙酸鹽和丙酸鹽顯著升高，并且IBS-D 的乙酸鹽、丁酸鹽、丙酸鹽和戊酸鹽水平顯著高于IBS-C。Fukumoto 等［17-18］均發(fā)現(xiàn)SCFAs尤其是丁酸鹽可以導(dǎo)致結(jié)腸5-HT 水平升高，其不僅可以直接刺激結(jié)腸，加快結(jié)腸轉(zhuǎn)運(yùn)速度，而且可以通過(guò)激活5-HT2A受體誘導(dǎo)內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。

現(xiàn)有研究證實(shí)IBS-D 患者存在持續(xù)的低度炎癥，表現(xiàn)為血清炎癥因子明顯升高以及腸道黏膜存在多種炎癥因子的浸潤(rùn)［19-20］。這一過(guò)程涉及多種體內(nèi)免疫細(xì)胞，因此進(jìn)一步探索免疫細(xì)胞類型及其相關(guān)狀態(tài)與IBS-D 的關(guān)系，對(duì)于研究IBS-D 診治的新靶點(diǎn)具有非常重要的意義。Th1/Th2 細(xì)胞是由CD4+T 細(xì)胞分化而來(lái)免疫細(xì)胞，共同調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫平衡，當(dāng)機(jī)體免疫紊亂時(shí)，Th1/Th2 細(xì)胞群的比例發(fā)生變化，其中Th1 主要發(fā)揮誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用，而Th2 則具有免疫抑制功能［21］。越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2免疫平衡與IBS-D的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。趙佳鈞等［22］對(duì)27 例IBS-D 患者及31 例同齡、同性別的同期健康受試者外周血Th相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4檢測(cè)，并計(jì)算二者比值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，IBS-D 患者外周血IFN-γ濃度及IFN-γ/IL-4 比值均明顯升高，而IL-4 濃度明顯降低，表明IBS-D 患者存在外周血Th1 細(xì)胞增多，而Th2 細(xì)胞減少。邢煜等［23］的研究發(fā)現(xiàn)IBS-D 患者血漿IFN-γ、IL-12 表達(dá)水平和Th1/Th2 比值明顯高于健康受試者，而IL-4 和IL-10 水平無(wú)明顯差異，表明IBS-D患者存在免疫功能紊亂，其中以外周血優(yōu)勢(shì)表達(dá)Th1為主。此外，基于調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫平衡以治療IBS-D的研究也得到了廣泛研究。焦良山等［24］的研究發(fā)現(xiàn)溫腎健脾方聯(lián)合利福昔明可以明顯改善脾腎陽(yáng)虛證IBS-D 患者的中醫(yī)證候積分，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)外周血Th1/Th2 細(xì)胞因子表達(dá)水平而發(fā)揮作用的。馬軍等［25］發(fā)現(xiàn)烏梅丸聯(lián)合中藥敷貼可以明顯緩解寒熱錯(cuò)雜型IBS-D 患者的腹痛、腹瀉癥狀，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2 細(xì)胞因子相關(guān)。一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Th1/Th2 免疫平衡與IBS-D 的關(guān)系［26-27］。此外，Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡也受到SCFAs 的調(diào)節(jié)，后者可以直接影響T細(xì)胞向效應(yīng)T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，乙酸和丙酸的增加會(huì)導(dǎo)致T 細(xì)胞分化為Th1 細(xì)胞，導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的增加［28］，因此SCFAs 介導(dǎo)的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)可能是IBS-D發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制。

IBS-D 歸屬于中醫(yī)“泄瀉”“腹痛”的范疇，病位主要在大腸，但與肝、脾、腎密切相關(guān)［29］。其多因飲食不節(jié)、情志失調(diào)、先天稟賦不足、外感六淫等，導(dǎo)致濕邪困阻脾胃，脾胃功能虛弱，運(yùn)化失司，清氣不升，濁陰不降，中焦氣機(jī)受阻。《醫(yī)方考》中記載“瀉責(zé)之脾，痛責(zé)之肝；肝責(zé)之實(shí)，脾責(zé)之虛，脾虛肝實(shí)，故令痛瀉”。李軍祥教授［30］認(rèn)為“腹痛即泄，泄后痛減”為該病主要表現(xiàn)，其核心病機(jī)為脾虛肝旺，因此治療本病的關(guān)鍵在于健運(yùn)脾氣、舒達(dá)肝氣，若脾氣得健、肝氣得舒，則痛瀉自止。李教授仿痛瀉要方自擬痛瀉安腸方，以抑肝扶脾法治療肝郁脾虛證IBS-D，在臨床上收到了良好的治療效果。我們團(tuán)隊(duì)前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，痛瀉安腸方能明顯緩解IBS-D 患者的腹痛腹瀉癥狀，提高患者的生活質(zhì)量［4］。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，痛瀉安腸方治療可以明顯改善IBS-D 小鼠糞便性狀及內(nèi)臟高敏感，調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，從而達(dá)到治療IBS-D 的目的［5］。本研究通過(guò)束縛應(yīng)激聯(lián)合番瀉葉灌胃復(fù)制了肝郁脾虛證IBS-D小鼠模型，進(jìn)一步探索了其對(duì)小鼠糞便SCFAs 及腸系膜淋巴結(jié)Th1/Th2 細(xì)胞免疫平衡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，痛瀉安腸方可以顯著降低小鼠糞便總SCFAs的相對(duì)含量，尤其降低了丁酸、丙酸、乙酸的含量；并且可以降低小鼠腸系膜淋巴結(jié)Th1 細(xì)胞的占比及Th1/Th2 細(xì)胞比例，而增加Th2細(xì)胞的占比。因此提示，痛瀉安腸方能調(diào)節(jié)肝郁脾虛證IBS-D 小鼠的糞便SCFAs 含量，并且具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，痛瀉安腸方可以降低肝郁脾虛證IBSD 小鼠糞便SCFAs的含量，調(diào)節(jié)小鼠Th1/Th2細(xì)胞免疫紊亂從而發(fā)揮治療作用。