擬南芥35S∶NAS2載體構建和轉基因株系的篩選

王婷婷, 曹樹青, 吳 席, 賈亞峰, 陳逸凡, 樊婷婷

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

鐵是植物生長發育所必需的元素,參與植物生長的全過程。鐵也是人們最早發現的植物微量元素,早在1843年發現生長在石灰性土壤上的葡萄葉片失綠癥與缺鐵有關,后經植物學家研究,將鐵確定為植物生長的必需微量元素。土壤中的鐵含量豐富,但可利用的鐵含量是有限的[1]。鐵在土壤中的溶解度特別低,以離子形式游離地存在于土壤中,很難與其他物質結合,因此導致植物能從土壤中吸收和利用的鐵非常少[2]。在許多干旱、半干旱地區的石灰性土壤上廣泛存在植物缺鐵問題[3]。雖然植物根部吸收鐵的機制已有大量的研究,但對植物感知缺鐵機理的了解較少[4]。植物生長需要最佳水平的鐵,鐵用于能量生產、許多酶促過程,并且對于細胞代謝都是必不可少的[5]。植物缺鐵會導致生長發育受限,引發植物缺鐵性黃化病出現,可食用植物是人類一大飲食來源,植物的鐵缺乏也會損害人類的健康[6]。

因此,運用植物轉基因技術對植物品系進行改良優化顯得格外重要。在之前的研究中發現,BZIP44和NAS2基因均參與到擬南芥的鐵穩態中,BZIP44功能缺失突變體對缺鐵表現敏感,NAS2功能缺失突變體對缺鐵表現也敏感,且BZIP44功能缺失突變體在缺鐵脅迫下NAS2基因表達紊亂,但這2個基因在植物的鐵穩態中的遺傳關系尚不清楚,為了進一步研究這2個基因對于調節鐵穩態的機制,本文分別構建35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44轉基因植株,為后續研究的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

植物是哥倫比亞(col) 遺傳背景的野生型(wild type,WT)擬南芥(Arabidopsisthaliana);T-DNA插入突變體bzip44-1(SALK-084241)從美國擬南芥種質資源中心獲得,由合肥工業大學植物分子生物學實驗室繁殖所得;載體構建所用質粒pART27,大腸桿菌DH5α,農桿菌GV3101。

1.1.2 主要試劑

Plasmid miniprep Kit (TIANGEN),T4-DNA Ligase(NEB),限制性內切酶KpnⅠ(NEB),HinDⅢ (NEB),PrimeSTAR HS DNA Polymerase (TaKaRa),2×San Taq PCR Mix(Sangon Biotech),DNA loading buffer,異丙醇,無水乙醇,氯仿,SDS,Tris-HCl,RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific)等。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥無菌苗的培養

配制MS固體培養基,稱取MS、瓊脂和蔗糖,待溶解后調節其pH值至 5.8,封上封口膜后用高壓滅菌鍋121 ℃、101 kPa高壓蒸汽滅菌20 min,滅菌后得到無菌固體培養基,并將其倒入同樣滅菌后的培養皿中。用0.1% 氯化汞對種子殺菌消毒后,將種子均勻點在培養基上。4 ℃冰箱中春化2 d,在22 ℃、16 h光照時長的培養箱中豎直培養 14 d。

1.2.2 擬南芥RNA的提取及反轉錄

實驗前將研缽洗凈烘干后,用錫箔紙包好,置于180 ℃烘箱烘4 h,待冷卻至室溫后再放到-20 ℃冰柜預冷。將樣品置于預冷的研缽中,加液氮研磨,組織充分研碎后,加入1 mLTrizol溶液,繼續研磨至完全融化。室溫放置5 min,使樣品充分裂解。離心機4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液靜置5 min。加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩晃動15 s后,室溫放置5 min。離心機4 ℃、12 000 r/min離心15 min,吸取500 μL含總RNA的上層無色液體至新的離心管中。加入0.5 mL異丙醇,顛倒混勻后于室溫下放置沉淀10 min。離心機4 ℃、12 000 r/min離心10 min,棄上清。加入1 mL用DEPC水配制的75%乙醇溶液,顛倒混勻。離心機4 ℃、7 500 r/min離心5 min,棄上清。待RNA晾干后加入20 μL DEPC水溶解,檢測純度及濃度,-20 ℃冰箱保存。

將檢測好純度和濃度的總RNA,根據Thermo Scientific公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄試劑盒說明書反轉合成cDNA。反應總體系為20 μL,在冰上進行操作,產物置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 擬南芥DNA的提取

取出于培養皿中培養的擬南芥,置于預冷的研缽中,加入液氮研磨至粉碎后,加入400 μL SDS DNA提取液繼續研磨,待充分研磨后轉移至離心管中,12 000 r/min、4 ℃離心10 min后,取上清液200 μL于另一新的離心管中,再加入200 μL異丙醇,12 000 r/min離心10 min,離心后棄去管中的上清液,加入800 μL體積分數為70%的乙醇,12 000 r/min離心5 min。離心后去上清,將沉淀置于通風櫥15 min,待乙醇蒸發后,加入30 μL的無菌雙蒸水,獲得DNA溶液,置于-20 ℃冷凍保存。

1.2.4NAS2的CDS區域基因片段的克隆

利用Oligo 7.0軟件設計以下引物進行NAS2的CDS區域基因片段克隆。上游引物FP為:

3’-GAGAACACGGGGGACGGTACCATGGCT

TGCGAAAACAACCTC-5’;

下游引物RP為:

5’-GGGGAAATTCGAGCTAAGCTTTTACTCGA

TGGCACTATACTCCTCG-3’。

以野生型擬南芥RNA反轉錄的cDNA為擴增模板進行克隆。

1.2.5 大腸桿菌和農桿菌的轉化

從-80 ℃冰箱中取出存儲的大腸桿菌DH5α感受態細胞,放置于冰上自然溶解。吸取 5 μL連接產物加入到感受態細胞中,吹打混勻,冰上放置30 min,在42 ℃金屬浴中熱激 60 s,再放置于冰上冷激 2 min。在熱激和冷激后的感受態中加入無抗性的600 μL LB 液體培養基,放在 37 ℃恒溫搖床中低速振蕩培養1～2 h。待培養完成后,涂布于加有壯觀霉素的LB固體培養基上。平板倒置在37 ℃恒溫培養箱中培養過夜。次日挑取培養基上的單菌落,接種于加入壯觀霉素的LB液體培養基中,振蕩培養6 h后進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)鑒定,選取陽性克隆進行測序,并對結果分析比對,正確后得到具有重組質粒的大腸桿菌菌株。

取出存儲于-80 ℃冰箱中的農桿菌感受態細胞(GV3101),置于冰上解凍。取2 μL重組質粒加入到感受態細胞中,混勻,吸取至已預冷的1 cm電擊杯中,在電轉儀中電擊后迅速加入600 μL無抗性的LB 液體培養基,28 ℃搖床培養2～3 h,涂布于同時添加有壯觀霉素和慶大霉素的固體LB培養基上,置于28 ℃培養箱中培養2 d。培養皿上挑取單菌落接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養基中,28 ℃搖床培養至指數增長期,然后進行PCR鑒定。

1.2.6 浸花侵染法獲得轉基因擬南芥

將陽性農桿菌接種于添加有壯觀霉素和慶大霉素的液體培養基中,振蕩培養至A600為1.2～1.4,離心去上清,用侵染緩沖液重懸至溶液A600為0.8～1.2,最后加入一定量的表面活性劑SilwettL-77 混勻,侵染花序,黑暗處理12 h。第1次侵染后隔8 d,進行第2次侵染。

1.2.7 轉基因陽性植株的鑒定

將獲得的擬南芥種子置于含有卡那霉素的MS固體培養基中進行抗性篩選,培養箱培養7 d,將具有根且子葉顏色嫩綠的幼苗移栽至土質培養基中,再提取DNA,經PCR鑒定正確后,即獲得轉基因陽性植株。

2 結果與分析

2.1 NAS2的CDS區域的克隆結果

為了確定NAS2基因在擬南芥突變體bzip44響應缺鐵脅迫中的作用,本文構建35S∶NAS2/bzip44載體。以擬南芥野生型的cDNA作為模板,采用PCR技術擴增片段,得到NAS2的CDS區域,且片段大小與NAS2的實際大小963 bp一致,如圖1所示。圖1中,M代表Marker,下同。

2.2 目的片段和質粒雙酶切

使用KpnⅠ、HindⅢ 2種限制性內切酶對NAS2的CDS區域以及pART27質粒進行酶切,如圖2所示,得到具有相同黏性末端的片段和質粒,且片段大小與NAS2的實際大一致,質粒大小與pART27質粒的實際大小一致。

圖2 NAS2和pART27的雙酶切

2.3 連接和大腸桿菌轉化后陽性克隆鑒定

用T4連接酶將酶切后的目的片段和質粒在16 ℃的條件下進行過夜連接,得到的連接產物采用熱激法轉入大腸桿菌DH5α感受態中,將菌涂布于加有壯觀霉素的固體培養基中培養過夜,挑取單克隆菌落置于加有壯觀霉素的液體培養基中振蕩培養至菌液渾濁。將得到的單克隆菌液進行PCR鑒定,如圖3所示,選擇2號菌送去測序,經測序后選擇測序正確的2號菌液進行后續實驗。圖3中,1～7號表示在培養基中隨機挑取的大腸桿菌單克隆菌落培養的菌液。

圖3 大腸桿菌PCR鑒定結果

2.4 農桿菌轉化分析

將重組質粒用電擊轉化法轉入GV3101農桿菌感受態中,鑒定結果如圖4所示,選取3號菌進行擴大培養。圖4中,1～7號表示在培養基中隨機挑取的農桿菌單克隆菌落培養的菌液。

圖4 農桿菌PCR鑒定結果

2.5 擬南芥bzip44突變體鑒定及花序侵染分析

為了確保實驗的成功,需要鑒定被侵染的擬南芥株系是否為純合的bzip44突變體植株,分別用bzip44的FP和RP以及SALK BP和bzip44的RP進行鑒定,用bzip44的FP和RP鑒定,如圖5a所示,1～6號沒有條帶,野生型有大小為1 500 bp的條帶,說明被檢測的擬南芥株系中沒有BZIP44基因,用SALK BP和bzip44的RP鑒定,如圖5b所示。圖5中,1～7號表示土培的bzip44純合體植株。

圖5 bzip44突變體鑒定結果

由圖5b可知,野生型沒有條帶,但1～6號有大小為600 bp的條帶,說明SALK BP有插入到擬南芥的這些株系中,因此1～6號都為純合體。接著采用浸花浸染法分別侵染野生型(WT)擬南芥和bzip44突變體植株,反復侵染3遍得到侵染后的種子。

2.6 轉基因植株的抗性篩選分析

將侵染后收到的種子撒在加有卡那霉素的1/2 MS固體培養基中,得到的陽性植株如圖6所示。

圖6 陽性植株篩選結果

2.7 轉基因陽性植株的鑒定結果分析

提取陽性植株的DNA進行鑒定,結果如圖7所示。

圖7 陽性植株鑒定圖

圖7中,1～7號表示抗性篩選出的疑似陽性植株,且片段大小與NAS2的實際大小一致,根據鑒定結果選擇1號植株作為陽性35S∶NAS2/WT植株,并選擇1號植株作為陽性35S∶NAS2/bzip44植株,進一步通過抗性分離純合得到陽性植株。

2.8 純合體篩選結果分析

將鑒定正確的陽性植株進行土培繁殖,每一代植株都采用抗性分離比篩選,如圖8所示,在第3代得到純合的35S∶NAS2/WT和35S∶NAS2/bzip44植株。

圖8 轉基因植株的抗性分離比

3 討 論

土壤缺鐵問題在全球都很普遍,大約有1/3的可耕種土壤存在缺鐵問題[7]。與此同時,土壤缺鐵問題帶來的副作用也會接踵而至,如植物缺鐵性黃化病、缺鐵嚴重時還會出現葉片灰白的現象等,甚至會危及到人類的健康[8],因此解決土壤缺鐵引發的植物缺鐵問題至關重要。

本研究涉及到的轉錄因子為bZIP家族中的BZIP44基因,bZIP轉錄因子是所有真核生物都具有的轉錄因子[9]。有報道稱bZIP轉錄因子在植物干旱脅迫響應中起著重要的調節作用,并在水稻中發現了一種新型的干旱脅迫相關bZIP轉錄因子OsbZIP62,該基因參與ABA信號通路,通過調控脅迫相關基因的表達正向調控水稻的耐旱性[10]。

本研究所用種子從擬南芥種子資源中心獲得,分別為擬南芥哥倫比亞背景的野生型和BZIP44基因功能缺失型突變體。前期研究結果顯示,BZIP44基因參與植物對缺鐵脅迫的響應,且其可以通過調控NAS2基因的表達參與植物對缺鐵脅迫的響應,為了進一步研究基因NAS2和BZIP44在擬南芥缺鐵脅迫響應中的遺傳關系,通過基因工程技術構建35S∶NAS2重組載體,分別將其轉入野生型擬南芥和BZIP44基因功能缺失型突變體中,從而獲得35S∶NAS2/WT及35S∶NAS2/bzip44轉基因植株。本文為研究NAS2基因和BZIP44基因在植物體中響應缺鐵脅迫的遺傳關系奠定了良好的基礎。