ＬＥＣ１ 等轉錄因子基因在花生小種子突變體種子發育過程中的表達分析

朱秀瑾 郭鳳丹 夏晗 趙傳志 侯蕾

摘要：花生突變體ｓｓｍ１ 與其對照親本魯花１１ 號（ＬＨ１１）相比，種子皺縮變小，百仁重、單株生產力和含油量顯著降低。 為了探究導致該突變體種子變小且含油量降低的原因，本試驗研究了種子發育關鍵轉錄因子基因ＬＣＥ１ 等在突變體ｓｓｍ１ 及其對照ＬＨ１１ 合子受精及種子發育不同階段的表達情況。 結果表明，ＡｈＬＥＣ１ 在花生未受精子房（ＤＢＰ０）時期表達量較低，且在ｓｓｍ１ 和對照ＬＨ１１ 中無明顯差異，在受精后的子房（ＤＢＰ１）和入土１０ ｄ（ＤＡＰ１０）和２０ ｄ（ＤＡＰ２０）種子中表達量上調，并且在ＬＨ１１ 中的表達量極顯著高于突變體ｓｓｍ１、轉錄因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５ 和ＡｈＷＲＩ１ 在ｓｓｍ１ 中表達均有不同程度下調。 其中，與脂肪酸合成和糖酵解關系密切的ＡｈＷＲＩ１ 基因在ｓｓｍ１ 中的表達量顯著下調。 因此推測，ｓｓｍ１ 中ＡｈＬＥＣ１ 基因的表達量顯著下調，影響ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 等基因的表達，進而導致ｓｓｍ１ 種子胚胎發育和油脂積累的異常。

關鍵詞：花生、小種子突變體ｓｓｍ１、轉錄因子基因ＬＥＣ１、基因表達、種子發育、油脂積累

中圖分類號：Ｓ５６５.２、Ｑ７８６文獻標識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－００１０－０７

油脂是油料作物種子主要的貯藏物質，為種子萌發和幼苗生長提供能量。 花生（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙ￣ｐｏｇａｅａ Ｌ.）是我國重要的油料作物之一，我國花生生產量和消費量均居世界第一。 我國食用油大量依賴進口，提高花生油產量是解決油料短缺的有效途徑[１] ，提高籽仁含油量和產量是花生育種的重要工作。 研究發現，多種轉錄因子對種子中油脂積累具有重要的調控作用。 例如，ＬＥＡＦＹ ＣＯＴ￣ＹＬＥＤＯＮ１（ＬＥＣ１）、ＬＥＣ２、ＡＢＳＣＩＳＩＣ ＡＣＩＤ ＩＮＳＥＮ￣ＳＩＴＩＶＥ ３（ＡＢＩ３）、ＦＵＳＣＡ３（ＦＵＳ３）、ＷＲＩＮＫＬＥＤ１（ＷＲＩ１）和ＡＧＡＭＯＵＳ￣Ｌｉｋｅ１５（ＡＧＬ１５）等轉錄因子在調控胚胎發育、脂肪酸合成和糖酵解途徑等方面都起著重要作用[２－１４] 。 ＬＥＣ１ 被認為是種子發育的關鍵調控因子，屬于核因子Ｙ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃ￣ｔｏｒ－Ｙ， ＮＦ－Ｙ）轉錄因子家族，編碼ＨＡＰ３ 復合體的一個亞基，通過與ＣＣＡＡＴ 順式作用元件結合調控基因的表達[３] 。 在胚胎發育早期，ＬＥＣ１ 對維持胚柄細胞以及子葉的特性具有重要意義，而在胚胎發育后期，ＬＥＣ１ 在種子積累儲存脂肪和蛋白質等大分子物質以及種子獲得抗脫水能力過程發揮重要作用[４－１３] 。 在油菜種子中過量表達Ｂｎ￣ＬＥＣ１ 基因可使籽粒中的含油量提高２％ ～ ２０％，脂肪酸生物合成、蔗糖合成和運輸、糖酵解等途徑相關基因表達上調，這些生物學途徑所需碳通量增加[１５] 。 在擬南芥幼苗、種子以及大豆種子中，利用芯片分析ＬＥＣ１ 基因的異位表達和缺失突變體，結果表明，ＡＢＩ３、ＦＵＳ 和ＬＥＣ２ 都受到ＬＥＣ１ 的調控[１５] 。 ＷＲＩ１ 在擬南芥種子的油脂積累過程中發揮著極其重要的作用，擬南芥ｗｒｉ１ 突變體中糖酵解和脂肪酸合成相關基因的表達呈下降趨勢[１６] ，種子含油量顯著降低[１７] 。 研究發現，ＷＲＩ１ 控制著多個糖酵解途徑關鍵酶的基因以及參與脂肪酸合成的基因的表達，包括ＰＫＰ２、乙酰輔酶Ａ 羧化酶（ＡＣＣａｓｅ）、蔗糖合成酶（ＳｕｃｒｏｓｅＳｙｎｔｈａｓｅ ２，ＳＵＳ２）等，而ＷＲＩ１ 的表達受到ＬＥＣ１和ＬＥＣ２ 的調控，因此，ＬＥＣ 是調節脂肪酸合成代謝的關鍵基因[１６，１８] 。 ＡＧＬ１５ 編碼一種ＭＡＤＳ 結構域的轉錄因子，在種子發育過程中調節ＬＥＣ２、ＡＢＩ３ 和ＦＵＳ３ 等基因的表達[１９] 。

油料作物種子的正常生長發育與種子中油脂的積累密切相關。 植物種子油脂合成途徑已經較為清楚，但是調控花生種子油脂合成的分子機理仍不明確，因此闡明花生種子發育過程中油脂合成的調控機理，對花生高油育種有重要意義。 我們前期研究中獲得一個種子變小、種皮皺縮的花生突變體ｓｓｍ１，與對照親本ＬＨ１１ 相比，該突變體種子含油量顯著降低，“球形胚”時期的胚胎明顯變小，且胚胎數目變少。 ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 種子發育不同時期的轉錄組數據表明，在糖酵解途徑及脂肪酸生物合成和代謝途徑存在顯著富集，參與脂肪酸合成和代謝以及糖酵解途徑的眾多基因在ｓｓｍ１ 中表達顯著下調[２０] 。 為分析種子早期發育中的關鍵調控基因，本研究利用ｑＲＴ－ＰＣＲ 技術分析了ＬＥＣ１ 等轉錄因子基因在突變體合子受精及種子發育時期的表達變化，以期為篩選導致突變表型的候選基因、解析花生發育和油脂積累的調控網絡、深入研究調控花生油脂合成的分子機理及培育高含油量花生新品種提供參考。

１ 材料與方法

１.１ 植物材料

以山東省農業科學院農作物種質資源研究所特色作物資源與分子技術創新團隊實驗室保存的魯花１１ 號（ＬＨ１１）及其突變體ｓｓｍ１ 作為試驗材料。 將ＬＨ１１ 用６０ Ｃｏγ 輻照誘變，對收獲的Ｍ２ 代種子進行調查，獲得一個穩定遺傳的小種子株系，命名為ｓｓｍ１（ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄ ｍｕｔａｎｔ １）。

２０２０ 年４ 月底將ＬＨ１１ 與突變體Ｍ４ 代種子種植在山東省農業科學院試驗基地，株距２０ ｃｍ，行距５０ ｃｍ，單粒播種[２１] 。 播種１４０ ｄ 后收獲，對單株結果數、單株幼果數、百果重和百仁重等性狀進行統計分析。

于花生開花期和莢果發育不同階段，采集開花之前未受精的子房（ＤＢＰ０）、受精１ ｄ 的子房（ＤＢＰ１）以及入土１０ ｄ（ＤＡＰ１０）、２０ ｄ（ＤＡＰ２０）、４０ ｄ（ＤＡＰ４０）膨大的未成熟種子。 采集的樣品用液氮速凍后放入－８０ ℃冰箱保存。

１.２ 種子營養成分含量測定

含油量及蛋白質、脂肪酸的含量測定分別參照ＮＹ/ Ｔ １２８５—２００７、ＧＢ ５００９.５—２０１６、ＧＢ ５００９.６—２０１６ 規程進行，在中國科學院油料作物研究所完成。

１.３ ＲＮＡ 提取與ｃＤＮＡ 合成

ＲＮＡ 使用天根公司的ＲＮＡ 提取試劑盒進行提取，然后利用艾瑞克生物公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄合成ｃＤＮＡ。

１.４ ｑＲＴ－ＰＣＲ 檢測

參照陳娜等[２２] 的方法和條件進行ｑＲＴ －ＰＣＲ。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 的ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰｒｅＭｉｘ 試劑盒購自艾瑞克生物公司。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 反應體系[２３] 為２０μＬ，包括２×ＳＹＢＲ? Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳ Ｐｒｅｍｉｘ １０μＬ，稀釋至８ ｎｇ/ μＬ 的ｃＤＮＡ ２ μＬ，正、反向引物各１ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６ μＬ。 反應程序：９５ ℃ ３０ ｓ、９５ ℃ ５ ｓ，６０ ℃ ３０ ｓ，４０ 個循環。 以花生Ａｃｔｉｎ 基因為內參，每個時期的樣品重復３ 次，采用２－ΔΔＣｔ法[２４] 計算目標基因的相對表達量，用ｌｏｇ２ＦＣ[ｌｏｇ２（Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ）] 值表示基因相對表達的差異倍數。 ｑＲＴ－ＰＣＲ 所用引物見表１。

２ 結果與分析

２.１ 花生ｓｓｍ１ 突變體表型分析

籽仁大小是影響花生產量的重要農藝性狀之一[２５] 。 突變體ｓｓｍ１ 的莢果和種子明顯小于ＬＨ１１，且種皮皺縮、顏色較深（圖１）。 以ＬＨ１１ 作為對照，對成熟后的突變體ｓｓｍ１ 的部分農藝性狀進行分析，發現ｓｓｍ１ 的單株幼果數增多，單株結果數顯著增加，分別較對照增加３８.４６％和８８.０４％、百果重、百仁重分別較對照降低６４.９６％、６０.３１％，差異達極顯著水平、公斤仁數極顯著增加，約是ＬＨ１１ 的２.５ 倍、雖然突變體ｓｓｍ１ 的結果數多，但由于種子變小，幼果數多，產量大幅度降低，單株生產力較ＬＨ１１ 降低３４.１１％（表２）。

２.２ 種子營養成分含量與脂肪酸的組成

對ｓｓｍ１ 和ＬＨ１１ 干種子粗蛋白含量、含油量和主要脂肪酸含量進行測定，結果（表３）表明，ｓｓｍ１ 的含油量顯著降低，比ＬＨ１１ 降低１３.５３％。ｓｓｍ１ 突變體的粗蛋白、棕櫚酸、花生酸含量稍有升高，與ＬＨ１１ 差異較小、硬脂酸、油酸和亞油酸含量略降低，十七碳烷酸、十七碳一烯酸分別比ＬＨ１１ 降低３３.３３％、２５.００％，而亞麻酸、花生一烯酸、山崳酸、芥酸、二十四碳烷酸含量明顯升高。

２.３ ＬＥＣ１ 等轉錄因子基因的表達

利用ｑＲＴ－ＰＣＲ 分別檢測了ＬＨ１１ 和突變體ｓｓｍ１ 中ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＡＧＬ１５、ＡｈＷＲＩ１ 基因在花生合子受精及種子發育不同階段的表達情況，結果（圖２） 表明，在ＬＨ１１ 中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ、ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＷＲＩ１ 和ＡｈＡＧＬ１５ 在種子發育早期的表達總體上均呈現先上升后下降的趨勢，而ＡｈＡＢＩ３ 的表達呈一直上升趨勢。 在ｓｓｍ１ 中， 各基因表達水平明顯低于ＬＨ１１，其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＡＢＩ３ 表達呈持續上調趨勢、ＡｈＷＲＩ１ 在ＤＢＰ０—ＤＡＰ１０ 時期表達量升高，之后變化不大，各時期表達量均顯著低于ＬＨ１１、其余基因表達變化趨勢基本與ＬＨ１１ 中一致，且除ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＤＢＰ０ 和ＤＡＰ４０ 以及Ａｈ￣ＦＵＳ３ 在ＤＡＰ４０ 時期外， 表達量均顯著低于ＬＨ１１。 ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 的未受精子房（ ＤＢＰ０） 中差異不明顯， 但是在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０ 時期，即受精后子房以及胚胎發育早期，在ｓｓｍ１ 中的表達顯著下調，且ＡｈＬＥＣ１Ｂ 表達量的升高具有明顯的延遲性。 其中，ＡｈＬＥＣ１Ａ在ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０ 時期表達量分別比ＬＨ１１ 降低５２.０４％、４５.４４％、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在種子胚胎發育早期（ＤＡＰ１０）表達較ＬＨ１１ 大幅下調，降低７７.８８％。而ＬＥＣ１ 下游調控的轉錄因子基因ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡ￣ＧＬ１５ 在種子發育早期（ＤＢＰ０—ＤＡＰ２０ 時期） 的表達量逐步升高，但ｓｓｍ１ 的表達量顯著低于ＬＨ１１、ＡｈＡＢＩ３ 在ｓｓｍ１ 中的表達量明顯低于ＬＨ１１，且除ＤＢＰ１ 外， 均達顯著水平。 推測在ｓｓｍ１ 中，ＡｈＬＥＣ１ 可能作為上游關鍵調控因子，其表達下調引起ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３、ＡｈＷＲＩ１ 等下游轉錄因子基因表達量降低。 例如，ＡｈＷＲＩ１ 在ｓｓｍ１種子發育過程中表達量顯著降低，在營養物質積累的ＤＡＰ２０ 時期其在ｓｓｍ１ 中的表達量比ＬＨ１１下調８２.９４％。

３ 討論與結論

ＬＥＣ１ 與植物胚胎發育和種子成熟密切相關，作為先驅轉錄因子在胚胎發育早期就被激活表達，原胚期和整個胚胎發生過程中都能檢測到其表達[２６] ，是調控胚胎成熟過程的關鍵因子[２７] 。前期對ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 的ＤＡＰ１０、ＤＡＰ２０、ＤＡＰ４０時期種子進行了轉錄組測序，發現與脂肪酸合成和代謝以及糖酵解相關通路中的眾多基因在ｓｓｍ１ 中表達顯著下調。 本研究對ＬＥＣ１ 等轉錄因子基因的表達模式進行分析，發現ＡｈＬＥＣ１Ａ 和ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ｓｓｍ１ 合子受精和種子發育早期的表達與ＬＨ１１ 相比大幅度降低且表達延遲。 另外，在子房受精之前，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 的表達量在ＬＨ１１ 和ｓｓｍ１ 中差異并不明顯，但是受精后開始出現顯著差異，直至ＤＡＰ４０ 時期兩者之間又無明顯差異，說明ＬＥＣ１ 在合子受精后開始對早期胚胎發育進行調控。

在ＬＥＣ１ 過表達的油菜和擬南芥中發現脂肪酸種類和脂質水平顯著增加[１５] 、甘藍型油菜ｌｅｃ１突變體中種子含油量下降，與糖酵解和脂肪酸修飾的相關基因表達下調[２８] 。 ＷＲＩ１ 控制著多個糖酵解途徑關鍵酶的基因以及參與脂肪酸合成的基因的表達。 擬南芥ｗｒｉ１ 突變體中關于糖酵解和脂肪酸代謝相關酶活性降低，ｗｒｉ１ 種子的含油量降低８０％[２９] 。 這些轉錄因子基因在胚胎和種子發育時期特異性表達，過量表達或抑制表達這些基因能提高含油量，證明了它們在調控種子脂肪合成方面的重要作用[１５，２８] 。 在本研究中，ＡｈＬ￣ＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 正常表達的ＬＨ１１ 中其下游轉錄因子基因ＡｈＦＵＳ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 在ＤＡＰ１０ 時期后大幅度升高、但是在ｓｓｍ１ 中，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 在ＤＢＰ１—ＤＡＰ２０ 時期表達下調且顯著低于ＬＨ１１，ＡｈＦＵＳ３ 和ＡｈＷＲＩ１ 的表達量同樣顯著下調且表達量的升高出現延遲性，同時，受到ＬＥＣ１ 調控的ＡＢＩ３ 和調節ＦＵＳ３ 等基因表達的ＡＧＬ１５ 轉錄因子基因在ｓｓｍ１ 中的表達量也降低。 ＤＡＰ１０—ＤＡＰ２０ 時期是養分物質積累的重要時期， 在ＬＨ１１ 中ＬＥＣ１ 以及下游轉錄因子基因的表達趨勢與油脂合成相關基因表達趨勢一致，都呈上升趨勢，與油脂積累同步、而在ｓｓｍ１ 中，ＬＥＣ１ 及其下游轉錄因子基因表達與ＬＨ１１ 相比在同時期顯著下調，油脂合成相關基因表達也顯著下調。 作為ＬＥＣ１ 靶基因的ＷＲＩ１ 轉錄因子在花生小種子突變體ｓｓｍ１ 中表達顯著降低，而受ＷＲＩ１ 轉錄因子調控的ＰＫｐ２Ｂ（丙酮酸激酶）在ｓｓｍ１ 種子中表達量幾乎為零，糖酵解途徑中ＦＢＰＢ（果糖－１，６－二磷酸酶）和ＰＦＫＢ（磷酸果糖激酶）基因在ｓｓｍ１中表達也顯著下調[２０] ，影響了脂肪酸從頭合成所需原料乙酰ＣｏＡ 的正常合成。

ｓｓｍ１ 表現出種子皺縮、種皮顏色較深以及含油量下降的表型，這與擬南芥ｗｒｉ１ 突變體[２９] 和甘藍型油菜ｌｅｃ１ 突變體[２８] 表型基本一致。 可以推測，ＡｈＬＥＣ１Ａ、ＡｈＬＥＣ１Ｂ 作為上游轉錄因子，其表達量的顯著下調影響了ＡｈＦＵＳ３、ＡｈＡＢＩ３ 和Ａｈ￣ＷＲＩ１ 等下游轉錄因子的表達，進而影響了脂肪酸合成和代謝以及糖酵解途徑中基因的表達，導致種子含油量明顯降低。 因此推測ＬＥＣ１ 基因參與了早期胚胎的發育調控，并且激活了下游轉錄因子的表達，共同參與脂肪合成和糖酵解途徑。但是關于ＬＥＣ１ 及其下游轉錄因子如何調控脂肪合成通路還有待進一步研究。

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