產氣莢膜梭菌α－毒素基因數字ＰＣＲ 方法的建立及其在標準物質研制方面的應用

張銘洋 張喜悅 趙格 曲志娜 高宏偉 孫敏 程慧敏 徐佳微 王君瑋 鄒明

摘要：產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）是一種重要的人獸共患病原菌，α－毒素是其分子生物學檢測的主要靶標。 試驗選取Ｃｌｐｅｒ 引物及探針建立微滴式數字ＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｔｉａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）方法，最佳引物濃度０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ，探針濃度為０.３ μｍｏｌ/ Ｌ，退火溫度為６０ ℃。 利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法檢測單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌的ＤＮＡ，結果均為陰性，表明該方法具有較好的特異性。 合成產氣莢膜梭菌α－毒素基因，制成ＤＮＡ 標準品，選取３ 個稀釋梯度的標準品進行重復試驗，組內和組間變異系數均小于５％，證明該方法具有較好的重復性。 采用７ 個稀釋梯度的標準品進行重復檢測，計算出該方法的檢測限為１２.３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，定量限為３３.９７ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 通過對６８ 份臨床樣品進行檢測，證實該方法可用于臨床，且用于檢測質粒ＤＮＡ 時無明顯的基質效應。 應用ｄｄＰＣＲ 方法對標準品進行均勻性和穩定性檢驗，并聯合９ 家實驗室進行定值，最終獲得了國家市場監督管理總局頒發的標準物質證書（ＧＢＷ（Ｅ）０９１２３７）。 α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法的建立和ＤＮＡ 標準物的研制，為產氣莢膜梭菌分子生物學檢測試劑的標準化奠定了基礎。

關鍵詞：產氣莢膜梭菌；ｄｄＰＣＲ；α－毒素基因；標準物質；特異性；靈敏度；可重復性；定值

中圖分類號：Ｓ８５２.６１文獻標識號：Ａ文章編號：１００１－４９４２（２０２４）０１－０１５６－０８

微滴式數字ＰＣＲ （ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）是近年來迅速發展起來的一項定量分析技術，能夠實現對靶基因的精準定量檢測。 數字ＰＣＲ 的概念由Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ 等[１] 首次提出，他們在檢測大腸癌患者的Ｋ－ＲＡＳ 基因突變時，進行了微升級的ＰＣＲ 擴增，分別用不同熒光檢測突變基因和正常基因，通過計算突變基因和正常基因的比例得出突變率。 隨著生物技術的不斷發展與優化，ＰＣＲ 技術從普通ＰＣＲ 逐漸發展為熒光定量ＰＣＲ，目前的ｄｄＰＣＲ 屬于第三代ＰＣＲ。 ｄｄＰＣＲ 技術通過對樣品進行微滴化處理，經ＰＣＲ 擴增后對所有微滴進行逐個檢測，有熒光信號的判讀為１，無熒光信號的判讀為０，再根據泊松分布原理和陽性微滴的數量與比例可得出目的分子的起始拷貝數。 與傳統ＰＣＲ 及熒光定量ＰＣＲ 相比，ｄｄＰＣＲ具有樣本需求量低、絕對定量以及高靈敏度、高重復性、高耐受性等優勢[２－４] 。 目前，該技術已廣泛應用于轉基因生物、致病菌、病毒、食品安全等領域。

產氣莢膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ） 廣泛分布于土壤、污水、飼料和動物腸道中，可導致動物的壞死性腸炎、腸毒血癥，以及人類的腹瀉和食物中毒等疾病[１－２] 。 近年來，關于產氣莢膜梭菌分子生物學診斷方法的報道較多，但多為傳統的ＰＣＲ 和熒光定量ＰＣＲ 方法，使用的靶基因均為α－毒素基因。 隨著產氣莢膜梭菌分子生物學檢測試劑的廣泛應用，對標準物質研發的需求也越來越強烈。 標準物質可以滿足檢測結果標準化的需求，因此，本研究旨在建立產氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 檢測方法，并應用于質粒標準物質的研發。

１ 材料與方法

１.１ 供試菌株及樣品

產氣莢膜梭菌（ＡＴＣＣ１３１２４）、單核細胞增生李斯特菌（ＡＴＣＣ１９１１１）、沙門氏菌（ＡＴＣＣ１４０２８）、大腸桿菌（ＡＴＣＣ２５９２２）、腸球菌（ＡＴＣＣ２９２１２）、金黃色葡萄球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）、彎曲桿菌（ＡＴＣＣ３３５５９）均由國家獸醫微生物菌（毒）種保藏中心動物衛生與流行病學分中心保存。 產氣莢膜梭菌陽性病料由中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室保存。

１.２ 試劑和儀器

ｄｄＰＣＲ 探針法超預混液（不含ｄＵＴＰ）、微滴發生油購自北京匯力宏業生物科技有限公司。α－毒素基因、引物和探針序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 微滴式數字ＰＣＲ 檢測系統（伯樂ＱＸ２００，美國）。

１.３ 試驗設計與方法

１.３.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立 參照Ｇｒａｕ－Ｒｏｍａ[５] 、Ｘｕ[６] 等的方法分別合成２ 對引物和探針（表１）。

分別使用上述２ 對引物建立ｄｄＰＣＲ 方法并進行反應條件優化。 引物和探針分別設置４ 個濃度梯度，其中１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物加樣量設置為：１.３、１.５、１.７、１.９ μＬ；１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探針加樣量設置為：０.３、０.６、０.９、１.２ μＬ。 退火溫度設置為５６、５８、６０、６２ ℃。通過比較ｄｄＰＣＲ 的檢測拷貝數、微滴生成數、微滴分布狀態、微滴熒光信號的強度確定最佳反應條件。

１.３.２ 特異性、重復性、檢出限和定量限試驗 分別以產氣莢膜梭菌、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌和金黃色葡萄球菌的ＤＮＡ 為模板， 用產氣莢膜梭菌α － 毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法檢測以評價其特異性。 選取３ 個濃度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的標準品ＤＮＡ為模板，在間隔第７ 天和第１４ 天分別進行重復試驗，每個濃度設３ 個重復，記錄各次試驗的拷貝數，并分析組內和組間的變異系數，以檢測該方法的重復性。 參考?分析方法檢出限和定量限的評估?（ＧＢ/ Ｔ ２７４１５—２０１３）[７] 中的方法進行檢出限（ＩＤＥ）和定量限（ＩＱＥ）的測定。 以７ 個濃度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的產氣莢膜梭菌α－毒素基因質粒標準品ＤＮＡ 為模板，每個梯度重復檢測９ 次，用產氣莢膜梭菌α－毒素基因的ｄｄＰＣＲ 方法對其擴增，評估方法的檢出限、定量限和動態范圍。

１.３.３ ｄｄＰＣＲ 方法的臨床應用及基質效應評估

取實驗室保存的６８ 份臨床陽性病料，其中產氣莢膜梭菌陽性病料３８ 份，沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、彎曲桿菌陽性病料各５ 份，提取ＤＮＡ 作為臨床樣本進行產氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法鑒定。 依據?基質效應與互通性評估指南?（ＷＳ/ Ｔ３５６—２０１１）[８] 中的方法對制備的標準物質進行基質效應與互通性評估驗證。 選取產氣莢膜梭菌臨床陽性樣本２０ 份，濃度在１０２ ～ １０４ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ間隨機分布。 準備５ 份制備樣本，將制備樣本與臨床樣本隨機穿插排列，使用ｄｄＰＣＲ 方法測定所有樣本。

１.３.４ 候選標準物質的制備 通過ＮＣＢＩ 網站Ｂｌａｓｔ 比對，合成具有代表性的產氣莢膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 基因（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ２７７７２４.１） 片段，克隆至ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 質粒并轉化Ｅ. ｃｏｌｉ Ｔｏｐ １０ 感受態細胞。 經擴大培養后提取質粒備用。 應用ＫｐｎⅠ（ＮＥＢ，美國）對質粒進行線性化處理，反應體系為２ μＬ ｃｕｔｓｍａｒｔ、３ μＬ ＫｐｎⅠ、５ μＬ ｄｄＨ２Ｏ、１０ μＬ質粒（５３.６５ ｎｇ/ μＬ），３７ ℃水浴３ ｈ。 回收后的線性化質粒，稀釋后分裝作為候選標準物質，－８０ ℃保存備用。

１.３.５ 候選標準物質的鑒定及檢驗 對產氣莢膜梭菌α－毒素基因質粒進行常規ＰＣＲ 鑒定、雙酶切和測序鑒定，并對其進行均勻性和穩定性檢驗，鑒定方法參照文獻[９]進行。

１.３.６ 定值 選擇９ 家具備認可資質的實驗室，對候選標準物質進行聯合定值。 對測得的數據進行正態分布檢驗、組內可疑值檢驗、組間等精度檢驗以及各組平均值之間的ｔ 檢驗，并計算樣品的不確定度，對候選標準物質定值，并通過有證標準物質評估實驗室定值的穩定性[７，９] 。

２ 結果與分析

２.１ ｄｄＰＣＲ 方法的建立

分別使用２ 對引物建立ｄｄＰＣＲ 方法，結果Ｃｌｐｅｒ 引物探針具有更好的特異性，故在本研究中，使用該引物探針進行目標基因的擴增。 對引物和探針的濃度進行優化，結果１０ μｍｏｌ/ Ｌ 引物的用量為１.７ μＬ、１０ μｍｏｌ/ Ｌ 探針的用量為０.６μＬ，即反應濃度分別為０.８５ μｍｏｌ/ Ｌ 和０.３ μｍｏｌ/ Ｌ時，ｄｄＰＣＲ 檢測拷貝數最多，微滴分布狀態、微滴熒光信號的強度也均較好（圖１Ａ）。 退火溫度優化結果顯示，６０ ℃ 時特異性最好，且信號強度較強（圖１Ｂ）。最終建立的ｄｄＰＣＲ 方法，主要包括微滴生成、ＰＣＲ 擴增和微滴讀取３ 個步驟。 ①微滴生成。 反應體系為ｓｕｐｅｒｍｉｘ １０ μＬ、上、下游引物（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） 各１.７ μＬ、探針（１０ μｍｏｌ/ Ｌ） ０.６μＬ、模板１ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ５.０ μＬ，加入至微滴生成卡的ｓａｍｐｌｅ 孔；在微滴生成卡的ｏｉｌ 孔中加入７０ μＬ微滴生成油；將生成卡放入微滴生成儀，生成微滴。 ②ＰＣＲ 擴增。 將生成的微滴轉移至９６ 孔板，蓋膜后放入熱封儀封膜；將封好膜的９６ 孔板放入ＰＣＲ 儀進行擴增；ＰＣＲ 擴增程序為：５０ ℃ ２ｍｉｎ；９５ ℃ １０ ｍｉｎ；９５ ℃ ３０ ｓ，６０ ℃ １ ｍｉｎ，４０ 個循環；９８ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ ６０ ｍｉｎ。 ③微滴讀取。 擴增完畢后將９６ 板轉移至ＱＸ２００ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｒｅａｄｅｒ 微滴讀取儀上進行微滴讀取。 在以上確定的反應條件下，陰、陽性微滴劃分閾值劃定在熒光強度為２ ０００的位置。

加樣說明參見表２。

２.２ 特異性、重復性、檢出限和定量限結果

分別以單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、腸球菌、彎曲桿菌、金黃色葡萄球菌的ＤＮＡ 為模板，用建立的產氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法檢測，結果均為陰性（圖２），表明特異性較好。

選取３ 個濃度梯度（１０１、１０２、１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的標準品ＤＮＡ 為模板，分別在第１、７、１４ 天進行重復試驗，每個梯度設３ 個平行，記錄各次試驗的拷貝數，并統計分析組內和組間的變異系數。 結果３個梯度標準品的組內變異系數為０.７３％ ～３.１７％，組間變異系數為３.３６％ ～４.２７％（表３），重復性和重現性較好。

采用７ 個濃度梯度（１０－１、１００、１０１、１０２、１０３、１０４ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ 和１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）的產氣莢膜梭菌α－毒素基因質粒ＤＮＡ 進行檢測。 每個稀釋度３個重復。 結果（圖３）表明，ｄｄＰＣＲ 反應產生的微滴數量超過１０ ０００ 個，當稀釋度為１０１ ～１０４時，產氣莢膜梭菌α－毒素基因拷貝數與濃度之間呈良好的線性關系，可繪制標準曲線（圖４）。 標準曲線方程為ｙ＝ ４.３１９ｘ＋１４.５３，Ｒ２ ＝ ０.９９９，計算得出檢出限為１２. ３９ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， 定量限為３３. ９７ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

Ａ０８、Ｂ０８、Ｃ０８ 的ＤＮＡ 濃度為１０５ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，Ｄ ０８、Ｅ０８、Ｆ０８的ＤＮＡ濃度為１０４ ｃｏｐｉｅｓ / μＬ，Ｇ０８、Ｈ０８ 的ＤＮＡ 濃度為１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｂ０９、Ｃ０９、Ｄ０９ 的ＤＮＡ 濃度為１０２ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｅ０９、Ｆ０９、Ｇ０９ 的ＤＮＡ 濃度為１０１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｈ０９、Ｄ１０、Ｅ１０ 的ＤＮＡ 濃度為１００ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ， Ｆ１０、Ｇ１０、Ｈ１０ 的ＤＮＡ 濃度為１０－１ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.３ 候選標準物質的制備與鑒定

將提取的ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ 質粒進行雙酶切和ＰＣＲ 鑒定，結果均可見大小為１ １４６ ｂｐ 的片段，符合預期（圖５Ａ、Ｃ）。 電泳鑒定線性化質粒，僅見１ 條條帶且大小正確，證實酶切完全（圖５Ｂ）。將質粒交由公司進行測序，結果其序列與大腸產氣莢膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ 完全一致。 證明產氣莢膜梭菌α－毒素基因質粒ＤＮＡ 候選標準物質基因序列正確。

２.４ 臨床樣品的驗證及基質效應評價

對６８ 份臨床陽性病料進行檢測，結果３８ 份產氣莢膜梭菌陽性病料的拷貝數均高于１ ０００（熒光值均高于２ ０００），其他非特異性菌株陽性病料的拷貝數均為零（熒光值均低于２ ０００）。 證明建立的ｄｄＰＣＲ 方法可用于臨床樣品的檢測。測定的結果采用線性回歸分析方法進行分析，參考?基質效應與互通性評估指南?[８] 中的方法，計算樣本測定值雙側９５％置信區間。 結果表明，標準物質的測定均值在臨床樣本９５％置信區間內（圖６），表明標準物質無明顯的基質效應。

２.５ 候選標準物質的檢驗

對２０ 管候選標準物質進行均勻性檢驗，采用單因素方差分析法（Ｆ 檢驗法）對結果進行分析，結果Ｆ<Ｆα，表明樣品是均勻的。 經穩定性檢驗，樣品可在－２０ ℃條件下穩定儲存１８ 個月，基因含量未發生顯著變化；將樣品置于４ ℃保存８ ｄ，結果樣品的檢測值無顯著變化，表明標準物質在４ ℃運輸條件下可穩定保持。 模擬反復凍融，結果樣品凍融３０ 次，基因含量未發生顯著變化。

２.６ 定值

聯合９ 家實驗室應用ｄｄＰＣＲ 方法進行定值。應用ＳＰＳＳ 軟件，對定值數據進行正態分布檢驗，結果顯示數據符合正態分布；應用Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ做出正態分布的直方圖，擬合正態曲線（圖７）。對組內數據可疑值檢驗，結果各組所有最大值和最小值之差的絕對值｜ｖｉ ｜均小于l（α，ｎ）ｓ，證實組內沒有可疑值。 對各組數據進行等精度檢驗，計算出Ｃ 值為０.１８，實驗室取α 為０.０５，數據組數９，重復測定次數９，查科克倫檢驗臨界值Ｃ（α，ｍ，ｎ） 為０.２７；結果Ｃ≤Ｃ（α，ｍ，ｎ） ，表明各組數據為等精度。 對平均值最大組及平均值最小組之間的數據進行ｔ 檢驗，ｔ 值為２.７４，查ｔ 值表ｔα為２.７８，ｔ<ｔα，證明各組平均值之間無顯著差異[７] 。

２.７ 不確定度評定

用ｕＡ，ｒｅｌ表示相對Ａ 類不確定度，經計算ｕＡ，ｒｅｌ為２.１％。 用ｕＢ，ｒｅｌ 表示Ｂ 類相對不確定度，經計算ｕＢ，ｒｅｌ為３.２％。 用ｕｂｂ，ｒｅｌ表示均勻性差異帶來的不確定度，經計算為２.３％。 用Ｕｌｔｓ和Ｕｓｔｓ分別表示長期和短期不確定度，經計算分別為６.６０％和３.４２％。將各分量合成得到標準物質的合成相對不確定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ 為８.６７％，擴展相對不確定度ｕＣＲＭ，ｒｅｌ為１７.３４％，擴展不確定度ｕＣＲＭ為０.５９×１０３ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。 綜合確定制備的標準物質的定值為（３.４３±０.４３）×１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ。

２.８ 比對與驗證

購置中國計量科學研究院制備的豬繁殖與呼吸障礙綜合征標準物質，用ｄｄＰＣＲ 方法對其進行測定。 ３ 次的結果分別為９.４１×１０８、９.３８×１０８、９.４２×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，經分析，該值符合標準物質說明書上的定值（標準值９.４×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ，擴展不確定度０.９×１０８ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ）。 證明本研究建立的ｄｄＰＣＲ 方法對標準物質的定值正確。

３ 討論與結論

產氣莢膜梭菌分布廣泛，對人類和動物的健康造成嚴重危害。 該菌可產生多種毒素，其中Ａ型產氣莢膜梭菌分泌的α－毒素是動物和人食源性感染的主要毒素型。 研究表明，α－毒素能夠突破血腦屏障、侵害延髓、破壞呼吸系統及心臟的傳導系統，最終引發動物“猝死癥”[１０] 。 產氣莢膜梭菌可跟據其產生的４ 種主要毒素（α、β、ε、ι）分為５ 種毒素型（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ）。 其中α－毒素是產氣莢膜梭菌分泌的主要致死毒素，是一種多功能磷脂酶，幾乎所有產氣莢膜梭菌都能產生α－毒素。Ｙｏｎｏｇｉ 等[１１] 建立了用于檢測產氣莢膜梭菌各種毒素的多重ＰＣＲ 檢測方法；ｖａｎ Ａｓｔｅｎ 等[１２] 針對α、β、ε 等毒素建立了多重ＰＣＲ 檢測方法；Ｓｈａｎ￣ｎｏｎ 等[１３] 建立了用于檢測城市污水中特定病原菌的熒光定量ＰＣＲ 檢測方法；Ｈａｎａｂａｒａ 等[１４] 建立了用于檢測人類糞便中食源性致病菌的熒光定量ＰＣＲ 檢測方法；另有其他眾多關于檢測產氣莢膜梭菌的報道[１５－２２] ，他們使用的靶基因均為α－毒素基因。

ｄｄＰＣＲ 方法是一種對核酸分子進行絕對定量的檢測技術，已廣泛應用于病原檢測領域，尤其適用于對低拷貝、低含量病原早期的精準檢測，可有效彌補普通熒光定量ＰＣＲ 方法的不足。ｄｄＰＣＲ 將反應體系分散為上萬個微滴，微滴經ＰＣＲ 擴增后，利用微滴檢測儀對每個微滴進行檢測，最后根據泊松分布原理，直接計算陽性微滴的個數，從而實現直接定量核酸濃度。 本研究建立的產氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 方法，具有較好的特異性、靈敏性和重復性，與Ｌｉ[２３－２４] 、Ｃｏｒ￣ｂｉｓｉｅｒ[２５] 、Ｄｕｐａｓ[２６] 等的報道一致。ｄｄＰＣＲ 檢測中，ＤＮＡ 濃度過高會超出儀器的檢測范圍，無法直接用于檢測；而ＤＮＡ 濃度過低則會對標準物質的穩定性產生不利影響。 為保證標準物質的穩定性，以更好地應用于臨床，本研究制備了濃度相對較低（１０３ ｃｏｐｉｅｓ/ μＬ） 的標準物質。 ｄｄＰＣＲ 為直接定量方法，其對標準物質的定值結果是全國標準物質管理委員會評價其可信度的主要指標。 本研究利用建立的ｄｄＰＣＲ 方法對標準物質進行定值，并獲得了國家市場監督管理總局頒發的標準物質證書（ＧＢＷ（Ｅ） ０９１２３７）。該標準物質的研發成功，可促進產氣莢膜梭菌診斷試劑的標準化，減少檢測誤差，確保檢驗人員的檢測能力，規范試劑盒的管理。

相較于其他定值方法，ｄｄＰＣＲ 法對技術人員和試劑等要求更高，但隨著技術進步和試劑成本的逐步降低，本研究建立的產氣莢膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ 檢測方法，必將具有廣闊的應用前景。

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